Явление люминесценции

Явление люминесценции

Контрольная работа

Явление люминесценции

Введение

флуоресценции люминисценция краситель поляризация

Время жизни электронно-возбужденного состояния молекул 10^-8-10^-9 с. После этого молекула возвращается в исходное состояние, израсходовав дополнительную энергию безизлучательным образом на колебательные движения ядер и поступательные движения соседних молекул, т.е. растратив ее в виде тепла. Но эта энергия также может выделиться в виде излученного фотона. Это явление называют люминесценцией. В зависимости от способа возбуждения молекулы - светом, электрической энергией, химическими реакциями, нагреванием, и т.д. - различают фото-, электро-, хемо-, или термолюминесценцию. Нас больше интересует фотолюминесценция, обычно называемая флуоресценцией.

1. Законы флуоресценции

Спектром флуоресценции называют зависимость интенсивности излученного света от энергии фотонов: I_фл = f (hn) или F(n). Но обычно в видимой и ультрафиолетовой области строят зависимость интенсивности флуоресцентного света от длины волны:

флуоресценция люминисценция краситель поляризация

I_фл = f(l).

По закону Стокса, спектр флуоресценции смещен в длинноволновую область по сравнению со спектром поглощения. Это смещение называется стоксовским сдвигом. Оно отражает потерю части энергии возбуждения вследствие теплового рассеяния. Но нередко спектры флуоресценции частично перекрываются со спектрами поглощения света (и со спектрами возбуждения флуоресценции). В области перекрытия, называемой антистоксовской (Рис. 1), энергия излученных фотонов больше энергии поглощенных квантов. Дополнительная энергия в данном случае берется за счет колебательной энергии молекул, когда в результате излучения происходит переход на более низкий колебательный подуровень, чем тот, с которого происходило поглощение фотона (Рис. 2).

Рис. 1. Зеркальная симметрия спектров флуоресценции (1) и поглощения (2) раствора родамина 6G. Антистоксова область заштрихована

Правило Каша гласит, что в растворах излучательные переходы происходят, как правило, с нижних колебательных подуровней синглетных или триплетных возбужденных уровней. Это происходит потому, что за время жизни возбужденного состояния 10^-8-10^-9 с успевают осуществиться все колебательно-вращательные переходы (их типичная длительность 10^-13-10^-12 с). Можно сказать, что к моменту испускания фотона молекула «забывает», на какой подуровень она была возбуждена. Поэтому спектр флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света.

Рис. 2. Схемы переходов между электронно-колебательными при стоксовой (а) и антистоксовой (б) флуоресценции, когда в результате перехода на более низкий колебательный подуровень энергия излученного кванта выше энергии поглощенного кванта

По правилу Лёвшина, спектры флуоресценции, построенные в шкале частот (энергий фотонов, зеркально-симметричны относительно длинноволновой полосе поглощения. Это связано с тем, что расстояния между колебательными подуровнями и вероятности переходов на них у молекул в возбужденном состоянии сходны с таковыми в основном состоянии. Причина этого в том, что за время электронных переходов порядка 10^-15 с положения ядер не успевают измениться, так как типичные периоды их колебаний на два-три порядка дольше - порядка 10^-13-10^-12 с. Поэтому по принципу Франка-Кондона поглощение и испускание фотонов обусловлено одними и теми же колебательными подуровнями.

Квантовым выходом флуоресценции называется отношение числа излученных квантов к числу поглощенных:

j = n_фл/n_погл

Величина 0 < j < 1, потому что кроме испускания фотонов, есть и другие пути утилизации энергии возбуждения: она может быть передана другим молекулам, расходоваться в химических реакциях или рассеваться в виде тепла.

В соответствии с законом Вавилова, в стоксовой области квантовый выход флуоресценции сложных молекул в растворах не зависит от длины волны возбуждающего света.

Интенсивность флуоресценции разбавленных растворов пропорциональна концентрации флуорохромов. Действительно, в разбавленных растворах с низкой оптической плотностью D = ecl < 0,05

I_фл = Kj I_погл = Kj I₀ (1-Т) = Kj I₀ (1-10^─D)» 2,3 kj I₀ D,

где k - доля флуоресцентного излучения, попадающего в фотоприемник. Это позволяет по флуоресценции определять количество флуорохрома и его изменения при различных воздействиях. Для количественного измерения концентрации флуорохрома используют калибровочную кривую:

c = c_станд (I_фл/I_станд),

где индекс «станд» относится к стандартному калибровочному раствору.

. Регистрация флуоресценции. Спектрофлуориметры

При регистрации флуоресценции необходимо, чтобы более интенсивный возбуждающий свет не попал в фотоприемник и не мешал измерениям. Для этого располагают фотоприемник по углом 90^о и используют скрещенные светофильтры (Рис. 3). В канале возбуждения флуоресценции помещают светофильтр, хорошо пропускающий возбуждающий свет, но не пропускающий свет в диапазоне, где объект флуоресцирует, а в канале регистрации - светофильтр, не пропускающий коротковолновый свет, используемый для возбуждения флуоресценции, но хорошо пропускающий излучаемый свет. Пара таких взаимоисключающих светофильтров не должна пропускать свет.

Рис. 3 Применение скрещенных светофильтров для регистрации флуоресценции (А) и их спектры пропускания света (Б). 1 - светофильтр в канале возбуждения, 2 - светофильтр в канале регистрации флуоресценции

Рис. 4. Схема спектрофлуориметра. 1 - источник света; 2 - собирающий линзы; 3 и 5 - монохроматоры в каналах возбуждения и регистрации флуоресценции; 4 - кювета с образцом; 6 - фотоумножитель; 7 - источник питания фотоумножителя; 8 - усилитель; 9 - компьютер и принтер

В современных спектрофлуориметрах обычно используются два монохроматора, один в канале возбуждения, другой - в канале регистрации флуоресценции (Рис. 4) Это позволяет регистрировать как спектр флуоресценции, так и спектр возбуждения. В последнем случае флуоресценцию регистрируют на определенной длине волны, обычно в максимуме, а если в спектре флуоресценции есть несколько максимумов, то можно для каждого из них зарегистрировать спектр возбуждения и по ним идентифицировать флуорохромы, ответственные за появление этих максимумов.

. Кинетика люминесценции. FLIM микроскопия

Не все возбужденные молекулы излучают фотоны в одно и то же время. Это вероятностный процесс, поэтому одни молекулы испускают кванты раньше, а другие позже. Поэтому после возбуждения коротким световым импульсом, например, лазерным, флуоресценция постепенно затухает. Переход возбужденной молекулы М* в основное состояние М₀ можно описать с помощью уравнения:

М*  М₀ + j Q,

где k - вероятность перехода в единицу времени, а Q - квант света (фотон).

Кинетика этого процесса описывается уравнением первого порядка:

[M*]/dt = - k [M*]

Его решение:

[M*(t)]=[M*(0)] exp (t/t),

где t = 1/k - среднее время жизни возбужденного состояния. Интенсивность люминесценции также равна:

I(t) = d[Q]/dt = - k [M*]= d [M*]/dt

или:

I(t) = d(j[M*])/dt = ─jk [M*]= ─j[M*(0)] exp (t/t) = ─ I(0) exp (t/t),

то есть кинетика люминесценции повторяет кинетику концентрации возбужденных молекул (Рис. 5А, Б). Постоянную времени затухания флуоресценции можно найти из графика кинетики затухания флуоресценции. Для этого удобней воспользоваться линеаризованным графиком (Рис. 5Б):

─ ln [I(t)/I(0)] = t/t,

на котором t = ctg a, где a - угол наклона прямой.

Практически такие измерения провести трудно, так как время жизни синглетного возбужденного состояния очень мало (обычно 0,5-10 нс). Поэтому часто используют метод однофотонной фотометрии. В нем образец освещают очень коротким лазерным импульсом длительностью менее 1 нс. Он возбуждает некоторое количество молекул, которые высвечивают световые кванты через разные интервалы времени t_i. При попадании фотона на фотокатод фотоумножителя генерируется короткий импульс фототока. Гистограмма распределения этих импульсов по величинам t_i дает кинетику люминесценции. Для ее построения экспериментатор задает временной интервал ∆t порядка нескольких сот пикосекунд, в котором подсчитываются импульсы (это время подачи сигнала на вход усилителя), и общее количество таких интервалов n. Соответственно, общее время регистрации: T = n∆t. Функция зависимости числа импульсов в i-м интервале от времени (или от номера канала) как раз представляет кинетику спада флуоресценции после возбуждения. Ее более точно определяют по полученным экспериментальным точкам с помощью метода наименьших квадратов (Рис. 5А).

Нередко в состав изучаемого биологического объекта входит несколько (i) компонент с близкими спектрами флуоресценция, но с разной кинетикой затухания флуоресценции. В этом случае кинетика затухания флуоресценции представляет собой сумму из нескольких экспонент. На линеаризованном графике в этом случае они будут представлены отрезками с разным наклоном:

─ ln [I(t)/I(0)] = S(t/t_i),

по которому можно определить число этих компонент и характерное время затухания флуоресценции t_i для каждого из них.

Рис. 5. А. Кинетика спада флуоресценции после возбуждения коротким световым импульсом. Определение времени жизни возбужденного состояния t на экспоненциальном (Б) и линеаризованном (В) графиках

Рис. 6. Однофотонный и фазово-модулированный методы измерения постоянной времени затухания флуоресценции: (Адаптировано из #"872478.files/image002.gif">

Для разных пар веществ R₀ составляет от 1 до 10 нм, чаще 3-5 нм.

Рис. 14. Ферстеровский индуктивно-резонансный способ миграции энергии. На графике изображена зависимость эффективности переноса энергии от расстояния между молекулами

Индуктивно-резонансная миграция энергии может происходить между энергетическими уровнями с разной мультиплетностью:

o      Синглет-синглетная: D* + A ®A* + D

o   Синглет-триплетная: D* + A® A^т + D

o   Триплет-синглетная: D^т + A ® A*+ D.

Типичное время индуктивно-резонансного переноса энергии 10^-9-10^-10 с. Ферстеровский резонанс сокращает время жизни возбужденного состояния и длительность флуоресценции донора энергии. Также снижается вероятность обесцвечивания донора. Ферстеровскую миграцию энергии можно обнаружить по появлению в спектре возбуждения флуоресценции акцептора полосы поглощения донора или по исчезновению полосы флуоресценции донора энергии в присутствии акцептора энергии.

Явление FRET широко применяется в последнее время для изучения белок-белковых взаимодействий. Для этого к изучаемым белкам присоединяют флуоресцирующие молекулы (Рис. 15). Одна служит донором энергии, воспринимающим возбуждающий свет (в данном примере это зеленый флуоресцирующий белок, GFP), а другая - акцептором. только, Когда изучаемые белки взаимодействуют и акцептор сближается с донором, донор перестает флуоресцировать и появляется флуоресценция акцептора, у которой спектр возбуждения соответствует спектру поглощения донора энергии.

Рис. 15. Применение FRET для исследования белок-белковых взаимодействий

Обменно-резонансное взаимодействие возникает при перекрывании электронных орбит молекул донора и акцептора. Такое взаимодействие возможно при существенно меньших межмолекулярных расстояниях по сравнению с индуктивно-резонансным переносом (<2 нм). В отличие от индуктивно-резонансного механизма, где происходит миграция энергии между синглетными уровнями, в обменно-резонансном механизме разрешен перенос энергии электронного возбуждения от триплетной молекулы донора на триплетный уровень акцептора.

Экситонный механизм миграции энергии также, как и индуктивно-резонансный, основан на электрических диполь-дипольных взаимодействиях между молекулами в случае тесного межмолекулярного взаимодействия при плотной квазикристаллической упаковке молекул. При этом происходит экситонное расщепление уровней энергии, энергетические уровни молекул распределяются по сравнительно большому объему, и локализация возбужденного электрона становится неопределенной. В этом случае вероятность переноса энергии между соседними молекулами резко возрастает. Требуемое для этого время составляет всего 10^-14 - 10^-12 с, что на несколько порядков меньше, чем при индуктивном резонансе. Характерные расстояния переноса энергии - до 2 нм.

9. Тушение флуоресценции

Квантовый выход флуоресценции всегда меньше единицы, потому что часть энергии электронного возбуждения теряется внутри самой молекулы на тепловые процессы или передается соседним молекулам. К внутримолекулярным энергетическим тратам относятся безизлучательные переходы между колебательно-вращательными подуровнями, между электронными уровнями с одинаковой мультиплетностью (S₁ → S₀ или T₁ → T₀) или интеркомбинационная конверсия (S₁ → T₁ или T₁ → S₀). Энергия возбуждения может также растрачиваться на фотохимическую реакцию, например, на разрыв собственных химических связей. К межмолекулярным тратам относятся безизлучательный перенос энергии на соседние молекулы с увеличением их кинетической энергии (тепловые потери), на электронное возбуждение соседней молекулы с возвратом первой молекулы на основной уровень (миграция энергии). Безизлучательная дезактивация возбужденных состояний называется тушением флуоресценции.

Наиболее активными тушителями флуоресценции являются тяжелые ионы, такие как Cu²⁺, Cs⁺, I^─, Br^─; парамагнитные ионы и молекулы: нитроксильные радикалы, O₂ или Mn²⁺; молекулы растворителя, особенно воды, акцепторы энергии электронного возбуждения.

Время пребывания молекулы в возбужденном состоянии при отсутствии безизлучательной растраты энергии называют естественным временем жизни возбужденного состояния t_R. После возбуждения флуоресценция экспоненциально затухает. Скорость ее затухания, т.е. скорость изменения количества флуоресцирующих молекул I=-dn/dt пропорциональна их числу n:

I = - dn/dt = k_fn = k_fn₀ e^─k_f t =I₀ e^─k_f ^t = I₀ e^─t/t_R,

где k_f = 1/t_R - константа скорости флуоресценции, а n₀ - исходное число молекул.

В реальности, когда часть энергии необратимо рассеивается, время жизни возбужденного состояния t_f, и квантовый выход флуоресценции j понижаются вследствие расхода энергии возбуждения на другие процессы:

,

где k_d - константа внутренней конверсии, k_ik - константа интеркомбинационной конверсии, Q - концентрация молекул - тушителей флуоресценции. Отсюда: t_f = t_Rj_f и k_f = j_f /t_f.

Если тушителя флуоресценции нет, то квантовый выход флуоресценции составит:

,

Тогда степень тушения флуоресценции тушителем можно записать в виде:

j /j_f = 1 + K[Q].

Это уравнение Штерна-Фольмера. В нем константа K характеризует эффективность тушения флуоресценции. Так как при тушении флуоресценции на изменяется коэффициент поглощения флуорохрома, то такое же уравнение можно написать и для отношения интенсивностей флуоресценции в отсутствие и присутствии тушителя:

I /I_f = 1 + K[Q].

10. Зависимость флуоресценции от микроокружения молекулы

Спектры и квантовые выходы флуоресценции флуорохромов сильно зависят от полярности и подвижности окружающих их молекул, т.е. от диэлектрической проницаемости и вязкости растворителя. А если флуорохром встроен в белковую макромолекулу или биомембрану - от полярности и подвижности атомных группировок в их ближайшем микроокружении.

Владимиров и Потапенко (2006) рассматривают физику этих эффектов на примере диметиламинохалкона (ДМХ), молекула которого в основном состоянии (1 на Рис. 16) является электрическим диполем с небольшим дипольным моментом (17×10^-30 Кл×м). При растворении в разных растворителях с диэлектрической проницаемостью, возрастающей от 1,9 (гептан), до 2,4 (толуол), 17,7 (бутанол), 32,7 (метанол) и 80 (вода) максимум поглощения и особенно максимум флуоресценции ДМХ прогрессивно смещаются в длинноволновую область от 383 до 427 нм и от 436 до 560 нм.

Авторы связывают этот сдвиг с потерей энергии при реорганизации сольватной оболочки. В основном состоянии молекула окружена сравнительно небольшой сольватной оболочкой. В полярных растворителях это оболочка из дипольных молекул растворителя. Быстрый переход в возбужденное состояние, происходящий за 10^-15 с (состояние 2 на Рис. 16), приводит к повышению дипольного момента до 77×10^-30 Кл×м. Такое повышение дипольного момента характерно и для многих других биологически значимых органических молекул. Оно вызывает поляризацию окружающих молекул растворителя, их переориентацию и дополнительную сольватацию ДМХ в течение последующих 10^-13-10^-8 с. В результате энергетических трат на эти процессы, энергия флуорохрома несколько понижается (состояние 3 на рис. 26). Затем излучается фотон флуоресценции и молекула флуорохрома быстро переходит на один из верхних подуровней основного состояния (состояние 4 на рис. 26). Его энергия выше энергии исходного состояния, т.к. молекула имеет дополнительную сольватную оболочку. В результате последующей десольватации молекула возвращается в исходное состояние. Энергетические траты на сольватацию приводят к снижению энергии излученного фотона, т.е. к длинноволновому сдвигу. Этот сдвиг высок, если возбуждение существенно повышает дипольный момент флуорохрома, если велик дипольный момент окружающих молекул, т.е. высока диэлектрическая проницаемость среды, и если высока подвижность молекул растворителя, т.е. низка его вязкость. Все это облегчает переориентацию молекул растворителя, снижает энергетические потери и вызывает длинноволновой сдвиг полосы поглощения.

Рис. 16. Изменения дипольного момента и сольватной оболочки флуорохрома в результате поглощения и излучения фотона. Дипольный момент обозначен соответствующим расстоянием между зарядами

Но такое свойство, вероятно, справедливо для дипольных молекул, а в случае гидрофобных веществ сдвиг может быть противоположным. Например, при переходе от неполярной среды (мембраны липосом или клеток) к полярной (метанол) полосы поглощения (555 и 596 нм) и флуоресценции (602 и 651 нм) гиперицина смещаются в коротковолновую область спектра до 546 и 589 нм и 595 и 645 нм, соответственно. Возможно, в данном случае более важную роль играла не полярность среды, а подвижность молекул в ближайшем микроокружении хромофора. Красный спектральный сдвиг обычно происходит при повышении вязкости микроокружения хромофора, когда подвижность молекул ограничена и больше энергии расходуется на реорганизацию среды вокруг возбужденной молекулы хромофора. Внутри мембран гиперицин локализуется в вязком липидном микроокружении, где его подвижность ограничена по сравнению с метанолом, в котором наблюдается более коротковолновое поглощение и флуоресценция.

11. Флуоресценция белков

Флуоресценция белков обусловлена флуоресценцией аминокислотных остатков, наиболее интенсивно поглощающих ультрафиолетовое излучение - триптофана, тирозина и фенилаланина. Основные параметры флуоресценции этих аминокислот в водных растворах приведены в таблице У триптофана и тирозина примерно одинаковые квантовые выходы флуоресценции, но поскольку молярный коэффициент поглощения на порядок больше, чем тирозина, то и флуоресцирует он сильнее; флуоресценцией остальных аминокислот можно пренебречь.

Таблица 1. Квантовый выход и максимум спектра флуоресценции хромофорных аминокислот

Спектры и квантовые выходы флуоресценции белков не тождественны спектрам и квантовым выходам флуоресценции эквимолярной смеси соответствующих аминокислот и зависят от структурной организации белковых молекул. Они изменяются при нарушении вторичной и третичной структуры белка и даже при более тонких структурных изменения. Вклад тирозиновой компоненты в общую флуоресценцию белка проявляется, когда в белке отсутствует триптофан.

Тирозиновая компонента имеет максимум при 303 нм, как и для свободного тирозина, и не изменяется при денатурации белка. Но квантовый выход флуоресценции тирозина в разных белках сильно варьирует. В составе белков он на порядок ниже, чем в водном растворе и сильно зависит от своего микроокружения. Например, в рибонуклеазе квантовый выход флуоресценции трех наружных тирозиновых остатков, обращенных в водную среду равен примерно 0,03, а трех остальных, находящихся внутри белковой глобулы, - всего 0,00 Возможно, низкий кантовый выход флуоресценции внутренних тирозинов обусловлен ее тушением карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, дисульфидными мостиками и другими факторами. Хотя изменение квантового выхода не позволяет судить о характере микроокружения тирозина, но все же этот параметр можно использовать как конформационно-чувствительный тест. После денатурации рибонуклеазы квантовый выход флуоресценции ее тирозиновых остатков повышается до 0,055.

Вклад триптофановой компоненты в ультрафиолетовую флуоресценцию доминирует даже в сывороточном альбумине человека, в котором на единственный триптофан приходится 17-18 тирозинов и 33 фенилаланина. Спектры флуоресценции триптофана в разных белках сдвинуты в коротковолновую область по сравнению со свободным триптофаном (348-350 нм) и сильно различаются. Например, у рибонуклеазы максимум спектра флуоресценции приходится на 325 нм, а у сывороточного альбумина человека - на 343 нм. При денатурации белков максимум спектра флуоресценции сдвигается к 350 нм, как у свободного триптофана. По всей вероятности, положение максимума триптофановой флуоресценции зависит от микроокружения этой аминокислоты, которое определяется при укладке полипептидной цепи в глобулу.

Квантовый выход флуоресценции триптофана также сильно зависит от структуры белка и различается у разных белков. Например, у лизоцима он равен 0,08, а у пепсиногена - 0,27. После денатурации он становится равным 0,2, как у водного раствора триптофана. Предполагается несколько причин изменения квантового выхода флуоресценции триптофана при включении его в состав белковой глобулы:

-   Утрата заряженных групп - NH₃⁺ и - COO^─ в полипептидной цепи и последующее тушение флуоресценции (эффект пептидной связи);

-   Взаимодействие с триптофана с дисульфидной группой, остатками гистидина или карбоксильными группами аспарагиновой и глутаминовой аминокислот может усилить внутреннюю конверсию и безизлучательные переходы, что также снижает квантовый выход;

-   Повышение квантового выхода может быть обусловлено более гидрофобным микроокружением триптофанила в белке по сравнению с раствором, ограничением его подвижности и, значит, снижением вероятности безизлучательных переходов.

Согласно правилу Каша и закону Вавилова, спектр и квантовый выход флуоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света. Но во многих белках, содержащих несколько триптофанилов, это не выполняется благодаря их гетерогенности и, как следствие, вследствие разного поведения. Эта гетерогенность, вероятно, обусловлена их различным микроокружением в белковой глобуле. На основании многочисленных экспериментальных данных была составлена эмпирическая схема зависимости спектров поглощения и флуоресценции триптофанилов от их микроокружения (Рис. 17).

Рис. 17. Сдвиги спектров поглощения и флуоресценции аминокислот в разных областях белков. 1 - красный сдвиг и спектра поглощения, и спектра флуоресценции наблюдается в случае отрицательного заряда вокруг триптофанила. 2 - синий сдвиг обоих спектров наблюдается, если заряд вокруг триптофанилов отрицателен. 3 - сближение полос поглощения света и флуоресценции происходит при повышении гидрофобности (уменьшении полярности) микроокружения триптофанила. 4 - Удаление полос друг от друга происходит при уменьшении гидрофобности (повышении полярности) микроокружения триптофанила

Согласно Фрайфелдеру (1980), эти эмпирические правила следующие:

1.      Максимум спектра флуоресценции триптофана (l_max) смещается влево, в коротковолновую область, а интенсивность возрастает при уменьшении полярности растворителя. Из этого следует:

─       Если белок находится в воде и при этом l_max смещена влево относительно положения максимума триптофана в воде, то триптофан должен находиться внутри глобулы в гидрофобном микроокружении.

─       Если белок находится в неполярной среде и при этом l_max смещена влево относительно положения максимума триптофана в воде, то триптофан должен находиться на поверхности глобулы или попадать туда в результате вызванного растворителем конформационного перехода.

2.      Если вещество-тушитель флуоресценции, например, иодид или нитрат, тушит флуоресценцию триптофана или тирозина, то последние должны находиться на поверхности глобулы. Если же тушение не наблюдается, то либо аминокислота находится внутри глобулы, либо она окружена электрическими зарядами, отталкивающими этот тушитель.

3.      Если вещество, не влияющее на квантовый выход свободного триптофана или тирозина, влияет на флуоресценцию, когда они входят в состав белка, то оно делает это путем конформационной перестройки белка.

.        Квантовый выход флуоресценции триптофанила и тирозинила понижается при протонировании карбоксильной группы.

.        Флуоресценция триптофана может тушиться близлежащими протон-донорными группами.

.        Если связывание какой-то молекулы с белком приводит к тушению флуоресценции триптофана, то либо она индуцирует большую конформационную перестройку белка, либо часть триптофанилов находится вблизи центра связывания этой молекулы.

.        Если связывание молекулы-тушителя флуоресценции с белком снижает флуоресценцию триптофана, то триптофан находится вблизи места связывания этой молекулы.

Таким образом, можно:

─       различать «полярные» триптофанилы, находящиеся на поверхности глобулы, у которых l_max » 350 нм и j » 0,2 и «неполярные», находящиеся в гидрофобном окружении внутри белка, характеризующиеся l_max » 330 нм и j » 0,05.

─       Оценивать гетерогенность триптофановых остатков.

─       Оценивать полярность их микроокружения.

─       Изучать доступность этих остатков к разным веществам, добавляемым в раствор и следить за ней при конформационных превращениях белка.

─       Обнаруживать структурные конформационные переходы в белках при разных воздействиях.

─       Исследовать кинетику этих переходов.

─       Изучать условия их осуществления (температура, рН и т.д.)

─       Определять термодинамические параметры таких переходов.

Основные преимущества флуоресцентного метода - практическая безинерционность и исключительно высокая чувствительность, позволяющая работать с очень малыми количествами исследуемых веществ. Если с помощью спектрофотометра можно определить 10^-8-10^-9 М какого-то вещества, то флуоресцентный метод позволяет обнаруживать концентрации 10^-10-10^-12 М. Точность измерения интенсивности флуоресценции ограничена различными причинами: светорассеянием; экранировкой возбуждающего и испускаемого света другими молекулами; реабсорбцией (поглощением фотонов в толще образца) флуоресценции молекулами среды; гетерогенностью биообъектов, миграцией энергии, тушением флуоресценции и т.д.

12. Флуоресценция нуклеиновых кислот

В отличие от белков, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, ДНК и РНК, практически не флуоресцируют вследствие высокой вероятности безизлучательной дезактивации возбужденного состояния. Время жизни их возбужденных состояний порядка 10^-11-10^-10 с. Квантовые выход флуоресценции меньше 0,01.

13. Собственная флуоресценция клеток

Для регистрации ультрафиолетовой флуоресценции микроскоп должен быть оборудован ртутной лампой, излучающей ультрафиолетовый свет, кварцевой оптикой, светофильтром, выделяющим возбуждающий свет с длиной волны от 250 до 300 нм (l_max = 280 нм), и запирающим светофильтром, не пропускающим свет с длиной волны короче 300 нм, но пропускающим ультрафиолетовое излучение с длинами волн в области 300-350 нм. Наиболее интенсивная ультрафиолетовая флуоресценция наблюдается в цитоплазме, а ядра практически не флуоресцируют. Наибольший вклад во флуоресценцию клеток вносит свечение митохондрий, в мембраны которых встроено большое количество белков. Спектры флуоресценции клеток совпадают со спектрами белковых триптофанилов (l_max » 330-335 нм), находящихся в гидрофобном микроокружении либо внутри белковых глобул, либо внутри митохондриальных мембран, в которые встроены эти белки.

В видимой области (сине-зеленый диапазон) также интенсивней всего флуоресцируют митохондрии, в которых сосредоточены флавопротеины и рибонуклеопротеины, содержащие никотинамидадениндинуклеотид (NAD). При возбуждении с длиной волны 340 нм флуоресцирует восстановленная форма пиридиннуклеотида NADH, максимум флуоресценции которого в водной среде 470 нм, а в составе белков - 440 нм. Окисленная форма NAD⁺ не поглощает ультрафиолет и не флуоресцирует. Поэтому по флуоресценции можно судить о степени восстановленности NAD. Флуоресценцию окисленных флавинов, прежде всего флавинаденинмононуклеотида (FMN) и флавинадениндинуклеотида (FAD), удобно возбуждать в синей области спектра при 450 нм, а регистрировать в зеленой области (520 нм). Восстановленные флавины, в отличие от пиридиннуклеотидов, не флуоресцируют. По соотношению флуоресценции при 440-470 и 520 нм можно определить соотношение восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавинов в клетке и, соответственно, оценить интенсивность биоэнергетических процессов и ее изменения при различных воздействиях. В качестве примера на рис. 18 приведена микрофотография голубой аутофлуоресценции пиридиннуклеотидов и зеленой флуоресценции флавинов в теле одиночных нервных клеток.

Рис. 18. Аутофлуоресценция механорецепторного нейрона рака. А. Изображение нейрона в проходящем свете. Б. Голубое свечение пиридиннуклеотидов. В. Зеленое свечение флавинов в теле клетки. Масштабный отрезок 20 мкм

14. Флуоресцентная микроскопия

Исследование флуоресценции клеток, окрашенных специальными красителями-флуорохромами или флуоресцирующими антителами к определенным клеточным белкам, резко расширило возможности оптической микроскопии. В отличие от традиционных микроскопов, в которых клетки рассматривались в проходящем свете, во флуоресцентном микроскопе (Рис. 19) возбуждающий ультрафиолетовый или синий свет от ртутной лампы подается на объект через объектив сверху. Через этот же объектив свет флуоресценции попадает в глаза экспериментатора или на фотоприемник. Для того, чтобы вместе с флуоресценцией не проходил намного более интенсивный возбуждающий свет, отраженный от объекта, используют скрещенные светофильтры: пропускающий только ультрафиолетовый или синий свет в канале возбуждения и запирающий светофильтр, не пропускающий коротковолновый возбуждающий свет, в канале регистрации. Запирающий светофильтр может или пропускать весь свет с длиной волны, большей, чем длина волны возбуждающего света (длинноволновый или long-pass светофильтр), или селективно пропускать только свет в заданном узком диапазоне. Последним свойством отличаются интерференционные светофильтры, имеющие полосу пропускания порядка 10-20 нм. Для разделения света с разной длины также используется дихроическое зеркало, отражающее коротковолновый возбуждающий свет, и пропускающее длинноволновый свет флуоресценции.

А

 Б

Рис. 19. Флуоресцентный микроскоп. А. современный флуоресцентный микроскоп Observer (K. Zeiss, FRG). Б. Схема флуоресцентного микроскопа. 1 - ртутная лампа, возбуждающая флуоресценцию; 2 - светофильтр возбуждения; 3 - дихроическое зеркало, отражающее коротковолновый возбуждающий свет, и пропускающее длинноволновый свет флуоресценции; 4 - объектив микроскопа; 5 - объект исследования на предметном столике; 6 - запирающий светофильтр; 7 - сферическое зеркало с отверстием; 8 - зеркало; 9 - окуляр; 10 - зеркало; 11 - коллимирующая линза; 12 - лампа накаливания для наблюдения в проходящем свете; 13 - фотоприемник (видеокамера, цифровая фотокамера, фотоаппарат или фотоумножитель)

Обычная световая микроскопия, основанная на поглощении света, не свободна от недостатков:

o   оптическое разрешение менее половины длины световой волны:

d = 0,61l/NA=0,61l/n sin a,

где NA= n sin a - числовая апертура, n - показатель преломления среды, a - угол раскрытия, т.е. максимальный угол, под которым лучи от объекта могут попасть в объектив;

o   невысокий контраст: кроме изучаемой, видны окружающие структуры;

o   высокие требования к системе освещения и ее настройке;

o   различные аберрации и т.д.

Флуоресцентная микроскопия свободна от многих этих недостатков:

•        видны только флуоресцирующие структуры на темном фоне;

•        разрешение не ограничено;

•        система освещения не участвует в построении изображения;

•        отсутствуют хроматические аберрации.

Однако, флуоресцентное изображение не очень четкое, так как к флуоресценции каждого элемента объекта добавляется рассеянное флуоресцентное излучение других элементов, лежащих вне фокальной плоскости.

15. Лазерная сканирующая конфокальная и мультифотонная микроскопия

В 1957 году М. Мински запатентовал принцип конфокального микроскопа, в котором ход лучей при рассматривании точечного объекта в канале наблюдения совпадает с ходом лучей возбуждающего света и имеет общий фокус. Это позволяет исключить флуоресцирующие элементы, находящиеся вне плоскости фокуса. Внефокусные лучи снижают контраст и четкость изображения. В современном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе (Рис. 20) используются лазеры, дающие параллельный монохроматический луч, который можно сфокусировать объективом в плоскости препарата до диаметра порядка половины длины волны, т.е. до 1 мкм и менее в соответствии с дифракционными ограничениями (теоретически до l/2). Микронный объем, в котором возбуждается флуоресценция, называется вокселем. Если в плоскость промежуточного изображения ввести диафрагму (pinhole) с диаметром, соответствующим диаметру изображения этого вокселя, то она будет пропускать только лучи, исходящие из освещаемого объема, но не лучи, из точек, лежащих выше или ниже фокальной плоскости (Рис. 20). Сканирование лучом в плоскости фокусировки и «собирание» точечных изображений компьютером дает полное изображение объекта в «оптическом срезе» клетки толщиной всего около 1 микрометра. Поскольку рассеянная флуоресценция выше- и нижележащих слоев объекта не регистрируется, то изображение получается очень четким. Перемещение объекта по вертикальной оси Z позволяет получить стопку оптических срезов, по которым с помощью компьютера можно восстановить четкое трехмерное изображение объекта. Более того, это изображение можно поворачивать и рассматривать с разных сторон и под разными углами, что недостижимо в обычной оптической микроскопии.

Использование нескольких лазеров позволяет одновременно регистрировать флуоресценцию от нескольких флуорохромов, селективно окрашивающих разные клеточные структуры. Наложение этих изображений дает многоцветное изображение клетки, где разные цвета показывают геометрию различных клеточных компонентов (Рис. 21). Таким образом, использование конфокальности позволяет повысить четкость изображения, а сканирование и компьютерная реконструкция позволяют получить трехмерное изображение образца.

Рис. 20. Схема конфокального микроскопа. Через диафрагму (pinhole) на фотоумножитель проходят только лучи, исходящие из точки фокусировки лазерного луча (синие), но не лучи из точек, лежащих выше или ниже плоскости фокусировки (красные) (по: Л.П. Незлин. Leica Microsystems)

Рис. 21. Построение многоцветного изображения клеток

Дальнейшим развитием сканирующей микроскопии явилась разработка мультифотонных микроскопов. Они основаны на эффекте двух- или трехфотонного возбуждения молекул. Например, двухфотонное поглощение квантов с длиной волны 800 нм соответствует по энергии поглощению квантов света с удвоенной энергией, т.е. с длиной волны порядка 400 нм. Поэтому воздействуя на объект инфракрасным светом, можно получить такой же эффект, как и при действии фиолетового или ультрафиолетового излучения.

Рис. 22. Возникновение двухфотонного эффекта при фокусировке луча только в малой области вблизи фокальной плоскости, где интенсивность излучения превышает пороговую. Однофотонное возбуждение происходит по всему ходу луча - в фокусе и за его пределами

Двух- или трехфотонное поглощение происходит только при очень больших интенсивностях света. Это достигается при очень малой длительности импульса. Для мультифотонной микроскопии используются импульсно-периодические лазеры, генерирующие импульсы длительностью 10^-13 с высокой частотой (порядка 100 МГц). При этом энергия импульса и средняя мощность излучения обычно невелики, сравнимы с таковыми при однофотонном возбуждении. Другой фактор, повышающий интенсивность облучения - фокусировка луча в маленькое пятно микронных размеров. При этом интенсивность превышает пороговую, требуемую для двухфотонного возбуждения только в малой области вблизи фокуса луча (Рис. 22). Эта область начинает флуоресцировать, как если бы ее облучали коротковолновым синим или ультрафиолетовым светом. Ее размер по высоте вдоль оси Z заметно меньше, чем при однофотонном возбуждении в конфокальном микроскопе. Поэтому конфокальная диафрагма не требуется, а при сканировании получается еще более тонкий «оптический срез» и более четкая картина.

Хотя в сканирующем мультифотонном микроскопе не используется конфокальный эффект, он конструктивно не отличается от сканирующего конфокального микроскопа за исключением инфракрасного лазерного блока. Используемое в нем инфракрасное излучение слабо поглощается тканями и клетками и практически не повреждает их, поэтому его лучше применять для исследования живых клеток. Оно глубоко проникает в ткани, что позволяет изучать толстые срезы биологических тканей и даже проводить опыты на живых органах in situ. Инфракрасное излучение не вызывает выцветание красителей, что позволяет дольше изучать флуоресценцию и является еще одним преимуществом мультифотонной микроскопии.

16. Флуоресцентные зонды

Сильная зависимость флуоресценции от микроокружения флуоресцирующих молекул лежит в основе метода флуоресцентных зондов. Флуоресцентные зонды слабо флуоресцируют в воде, но их флуоресценция резко усиливается при изменении определенных физико-химических свойств микроокружения или при связывании с определенными веществами - ионами или молекулами. Это позволяет охарактеризовать микросреду вокруг молекулы флуорофора, оценить ее параметра и визуализировать молекулы, особенно сильно влияющие на флуоресценцию зонда. Этот интенсивно развивающийся метод стал одним из мощнейших инструментов изучения биомолекул и клеток и получил широкое распространение в последние годы.

Потенциометрические зонды

Некоторые красители, такие как 1-анилинонафталин-8-сульфонат (ANS, Рис. 23) очень чувствительны к полярности их микроокружения. Квантовый выход флуоресценции ANS в воде равен 0,004, а в липидном слое мембраны - 0,29, на два порядка выше. Длительность его флуоресценции также возрастает от 0,55 в воде до 7,0 нс в мембране. Поэтому ANS является чувствительным индикатором на присутствие гидрофобной фазы. Он выявляет присутствие гидрофобных полостей в белковых глобулах, конформационные изменения белков, их сворачивание в глобулы. ANS также широко используется для исследования мембран. Например, ковалентно пришивая к молекуле ANS гидрофобные «хвостики» разной длины, внедряющиеся в липидный слой, можно погрузить зонд на определенную глубину в мембрану и по изменению ее флуоресценции зондировать свойства мембраны на разной глубине.

Рис. 23 Примеры потенциометрических флуоресцентных зондов

Рис. 24. Регистрация потенциала действия в мышечной клетке сердца кролика с помощью флуоресцентного потенциометрического зонда di-4-ANEPPS. l_возб 488 нм. (А). Регистрация флуоресценции двумя фотоумножителями на 540 (зеленый сигнал) и >610 нм (красный сигнал). (В). Отношение зеленого и красного сигналов лучше отображает изменения мембранного потенциала, чем измерения в каждом канале по-отдельности. На (С) для сравнения представлен потенциал действия, зарегистрированный с помощью микроэлектрода

Поскольку молекула ANS содержит отрицательно заряженную группу SO3─, то она чувствительна к электрическому полю, в частности к поверхностному потенциалу клеток или к трансмембранному потенциалу. При добавлении ANS в наружную среду его молекулы встраиваются в клеточную мембрану так, что анионная группа остается снаружи. Так как поверхность клетки заряжена отрицательно, то зонд погружается в мембрану на некоторую глубину и начинает флуоресцировать. При генерации потенциалов действия изменяется мембранный потенциал клетки, и это модулирует флуоресценцию ANS. Это позволяет оптически оценивать изменения мембранного потенциала клеток и даже регистрировать потенциалы действия в возбудимых клетках. На Рис. 24 приведен пример регистрации потенциала действия в мышечной клетке сердца кролика с помощью флуоресцентного потенциометрического зонда di-4-ANEPPS.

Таблица 2. Области применения потенциометрических флуоресцентных зондов, разработанных компанией Molecular Probes