Механическая желтуха

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт Фундаментальной Биологии и Биотехнологии

Кафедра Медицинской биологии

УТВЕРЖДАЮ   Заведующий кафедрой

_____  ______________

 подпись   инициалы, фамилия

« _____» _______  2013 г.

ОТЧЁТ О ПРАКТИКЕ

Механическая желтуха

Руководители _____________ 15.09.13 канд. биол. наук, проф. Смирнова О.В.

   подпись

Студент ББ11-02Б  ________   15.09.13 Шангина Ю.С.

   подпись

  Красноярск 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений………………………………………………………………..3

Введение……………………………………………………………………………4

1 Обзор литературы………………………………………………………………..5

1.1  Определение, классификация механической желтухи……………………5

1.2 Патофизиология……………………………………………………………...6

1.3 Диагностический подход………………………………………………….....8

1.4 Обязательные исследования для больных желтухой……………………..10

1.5 Иммунный статус…………………………………………………………...14

1.6 Иммуноферментный анализ………………………………………………..17

1.7 Хемилюминесцентный анализ оценки активности нейтрофильных гранулоцитов. …………………………………………………………………...22

2 Материалы и методы…………………………………………………………...23

2.1 Объект исследования……………………………………………………….23

2.2 Метод исследования иммунного статуса………………………………….24

2.3 Метод определения хемилюминесцентного анализа оценки активности нейтровильных гранулоцитов………………………………………………….26

Выводы…………………………………………………………………………….28

Список используемых источников………………………………………………29

Реферат (summary)………………………………………………………………..30

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФА – иммуноферментный анализ

CD -  Кластер дифференцировки

HLA-DR - Человеческие лейкоцитарные антигены, Система генов тканевой совместимости человека

АЛТ – аминотрансфераза

ЩФ (ALP) – щелочная фосфатаза

ГГТ - Гамма-глутаминтрансфераза

ПВ – протромбиновый индекс

АСТ — Аспартатаминотрансфераза

АЛТ — Аланинаминотрансфераза

ГГТП — Гамма-глютамилтранспептидаза

АсАТ — Аспартатаминотрансфераза

ВВЕДЕНИЕ

Кровь является внутренней средой организма, обеспечивающей нормальное функционирование всех органов и тканей живого организма, отражающей в большей или меньшей степени все нарушения их функций. Кровь называют "зеркалом", в котором отражаются самые различные процессы, происходящие во всех органах. Поэтому исследование крови является неотъемлемой частью медицинской диагностики, с помощью которой невозможно подтвердить диагноз и назначить лечение, а так же отследить его.

Исходя из вышесказанного, целью данной работы явилось изучение методов лабораторного анализа крови и получение базовых знаний по использованию лабораторного оборудования. На основании поставленной цели были определены следующие задачи:

1)   Научиться работать с автоматическими дозаторами;

2)   Приготовление рабочих растворов;

3)   Научиться выделять клетки крови;

4)   Научиться работать с флуоресцентным микроскопом;

5)   Научиться работать с лабораторной посудой;

6)   Научиться работать с промывочным аппаратом;

7)   Научиться работать с термостатируемым шейк ером – инкубатором;

8)   Научиться работать с ИФА – анализатором;

9)   Освоение ИФА метода;

10)   Познакомиться с методом непрямой иммунофлуоресценции;

11)   Ознакомиться с методом хемилюминесцентного анализа нитрофильных гранулоцитов;

12)   Провести анализ научной литературы.

Работа выполнена на базе ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинских проблем севера» Минздрава России.

1   ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Определение,классификация желтухи

Желтуха — это синдром, характеризующийся желтушным окрашиванием кожных покровов, слизистых оболочек и склер, обусловленный повышенным накоплением билирубина в сыворотке крови, а также других жидкостях и тканях организма.

Выявление желтухи не представляет трудностей, т.к. это хорошо заметный признак, обращающий на себя внимание не только медицинских работников, но и самого больного и окружающих его. Всегда значительно сложнее выяснить ее причину, т.к. желтуха наблюдается при многих как инфекционных, так и неинфекционных заболеваниях. Часто больные с механической желтухой ошибочно госпитализируются в инфекционный стационар с подозрением на инфекционный характер, что приводит к запоздалой диагностике и упущению времени для оптимального вмешательства.

В зависимости от первичной локализации патологического процесса, приводящего к развитию желтухи, и механизма возникновения выделяют следующие виды желтухи:

• Надпеченочная или гемолитическая желтуха — вызвана главным образом повышенной продукцией билирубина в связи с усилением распада эритроцитов и реже при нарушении плазменного транспорта билирубина. К ней относятся различные типы гемолитической желтухи — врожденные дефекты эритроцитов, аутоиммунные гемолитические желтухи, ассоциированные с В12- (фолиево-) дефицитной анемией, рассасывающиеся массивные гематомы, инфаркты, различного рода интоксикации, отравления. Повышенный гемолиз независимо от его этиологии всегда приводит к характерной клинической триаде: анемия, желтуха с лимонным оттенком, спленомегалия.

• Печеночная или паренхиматозная желтуха — обусловлена поражением гепатоцитов и/или холангиол. По ведущему механизму можно выделить несколько вариантов печеночных желтух. Она может быть связана с нарушением экскреции и захвата билирубина, регургитацией билирубина. Это наблюдается при остром и хроническом гепатитах, гепатозе, циррозе печени (печеночно-клеточная желтуха). В других случаях нарушаются экскреция билирубина и регургитация его. Подобный тип отмечается при холестатическом гепатите, первичном билиарном циррозе печени, идиопатическом доброкачественном возвратном холестазе, при печеночно-клеточных поражениях (холестатическая печеночная желтуха). В основе желтух может лежать нарушение конъюгации и захвата билирубина. Это отмечается при энзимопатической желтухе при синдромах Жильбера, Криглера-Найяра. Печеночная желтуха может быть связана с нарушением экскреции билирубина, например при синдромах Дабина-Джонсона и Ротора.

• Механическая или обтурационная желтуха — осложнение патологических процессов, нарушающих отток желчи на различных уровнях желчевыводящих протоков.

В одной из англоязычных статей, которая была опубликована в 2013 году  учеными из Румынии,  очень хорошо описан Диагностический подход и Патофизиология. 

1.2.Патофизиология

 Желтуха, не является болезнью, это признак одного из многих возможных изменений, лежащих в основе патологических процессов, которые происходят в какой-то момент пути нормального физиологического метаболизма билирубина.

Основной источник билирубина — гемоглобин. Когда красные кровяные клетки завершают свою жизнь это приблизительно 120 дней, или когда они повреждены, их мембраны становятся хрупкими и склонны к разрыву. Каждая красная кровяная клетка проходит через ретикуло-гистиоцитарную систему. Если мембрана клетки имеет хрупкое строение то она разрывается и все клеточное содержимое, включая гемоглобин, впоследствии освобождены наружу. За сутки распадается примерно 1% эритроцитов и из их гемоглобина образуется 10–300 мг билирубина.

При разрушении эритроцитов гемоглобин фагоцитируется макрофагами - разделяется на «гема» и  «глобин» порции. В «глобине» часть, белка, разлагается на аминокислоты и не играет никакой роли в болезни желтухе. Железо подвергается окислению и снова используется организмом в виде  белка ферритина. Молекула «гемма» под воздействием окислтиельных реакций превращается через стадию биливердина в билирубин. В крови билирубин связывается с носителем – альбумином (белок) т.к. он не растворим в воде при физиологическом pH крови.

Ход пигмента.

В обмене билирубина важные функции выполняет печень. Она захватывает из крови билирубин  гепатоцитами (клетки паренхимы печени) и связывает его с глюкуроновой кислотой. Далее выделяет (конъюгированный) билирубин из гепатоцитов в желчные капилляры. Соединение билирубина с глюкуроновой кислотой делает его растворимым в воде, что делает возможным переход его в желчь, фильтрацию в почках и обеспечивает быструю (прямую) реакцию с диазореактивом (прямой, конъюгированный, связанный билирубин).

Далее билирубин выделяется из печени в желчь. Билирубин поступает в кишечник и под действием бактериальных дегидрогеназ превращается в мезобилиноген и уробилиногеновые тельца: уробилиноген и стеркобилиноген. Основное количество уробилиногена из кишечника выделяется с калом в виде стеркобилиногена (60–80 мг в сутки), на воздухе превращающегося в стеркобилин, что окрашивает кал в коричневый цвет. Часть уробилиногена всасывается через стенку кишечника и попадает в воротную вену, затем в печень, где расщепляется. Здоровая печень полностью расщепляет уробилин, поэтому в норме в моче он не определяется.

Часть стеркобилиногена через систему геморроидальных вен попадает в общий кровоток и выводится почками (около 4 мг в сутки), придавая моче нормальный соломенно-желтый цвет.

1.3. Диагностический подход

Большинство пациентов, поступающих с желтухой будут иметь различные предпосылки аномалии печени, хотя существенных различий не существует. Типичный анализ печени будет включать в себя уровни в крови ферментов, прежде всего, такие как аминотрансфераза (АЛТ, АСТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ); билирубина (который вызывает желтуху); и протеина, в частности, общего белка и альбумина. Другие первичные лабораторные тесты для функции печени включают GGT и протромбиновый индекс (ПВ).

Нарушение некоторых костей и сердца  могут повлечь за собой увеличение ALP(щелочная фосфатаза) и аминотрансфераз, поэтому в дифференциации проблем с печенью, нужно сравнивать уровни ГГТ.

При желочных проблемах нужно хирургическое вмешательство, а при проблемах печени достаточно медицинского лечения. ЩФ и ГГТ растут одинаково а вот АСТ и АЛТ повышение разноуровневое. Если ALP (10-45 ме/Л) и ГГТ (18-85) возрастают пропорционально примерно так же высоко, как и " АСТ " (12-38 ме/Л) и ALT (10-45 ме/Л), это означает что проблема холестатическая. То есть желтуха с внутрипеченочным холестазом развивается при лекарственных поражениях печени (аминазин, тестостерон, сульфаниламиды, хлорпропамид и др.), вирусном гепатите, хроническом гепатите, токсических поражениях печени, первичном билиарном циррозе печени, идиопатическом доброкачественном возвратном холестазе, холестатическом гепатозе беременных и др.

 С другой стороны, если АСТ и АЛТ поднимается значительно выше, чем ЩФ и ГГТ это означает что проблема в печени. Печеночно-клеточная желтуха развивается при остром вирусном гепатите, обострении хронического гепатита, циррозе печени, алкогольном поражении печени, при воздействии ряда токсических веществ (хлорированные углеводороды, бензол и его производные, фосфор, свинец, ртуть, мышьяк, ядовитые грибы), а также некоторых лекарственных препаратов.

Наконец, различие между печеночно-клеточной желтухи, является сравнение уровней АСТ и АЛТ. АСТ уровни, как правило, будут выше, чем АЛТ. Это остается и в большинстве других заболеваний печени, кроме гепатита (вирусной или токсичных для печени). Алкогольные поражения печени могут быть вполне нормального уровня АЛТ, а АСТ 10 раз выше, чем АЛТ. С другой стороны, если уровень АЛТ выше, чем АСТ, это свидетельствует о том, что это гепатит. Уровни АЛТ и АСТ не хорошо коррелируют степени повреждения печени, хотя если  эти уровни очень высокие то они могут указывать на серьезный некроз. Низкий уровень альбумина, как правило, свидетельствуют о хроническом заболевании.

В результатах лабораторного анализа печени часто сравнивают масштабы и различия показателей, а не чистого количества, а также путем их отношения. AST:ALT соотношение может быть хорошим индикатором для выявления алкогольных поражений печени (10), некоторые другие формы поражения печени (выше 1), или гепатит (меньше, чем 1). Уровни билирубина более чем в 10 раз может указывать на новообразования или внутрипеченочный холестаз. Уровень АСТ более чем в 15 раз, как правило, указывает на острый гепатоцеллюлярной (печеночный) ущерб. Если ALP уровень превышает более чем в 5 раз  нормального, это как правило, указывает на механическое препятствие, в то время как уровень более чем в 10 раз превышает нормальны указывает на наличие наркотиков (токсичных) это индуцированный  холестатический гепатит или Цитомегаловирус. Обе эти болезни могут также иметь уровни АЛТ и АСТ более чем в 20 раз от нормального значения. Уровни ГГТ более чем в 10 раз нормального значения, как правило, указывают на холестаз. А если в 5  раз больше нормального показателя, значит - вирусный гепатит. Если уровень ГГТ менее 5 раз нормальных показателей, это как правило, указывает на токсичность препаратов. Острый гепатит обычно имеет ALT и AST рост уровней в 20-30 чраз больше чем нормальные значения (более 1000), и может оставаться значительно повышенными в течение нескольких недель. Токсичность Ацетаминофен может привести к уровню АЛТ и АСТ более чем в 50 раз нормального.

1.4.Обязательные исследования для больных желтухой

А в Русскоязычной статье  авторов П. Я. Григорьев — профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик МАИ; и А. В. Яковенко — доцент кафедры гастроэнтерологии РГМУ я нашла интересные факты исследования анализов при желтухе.

Анализ крови - минимальный набор клинико-биохимических показателей, необходимых для проведения дифференциальной диагностики желтух, представлен в таблицах

Таблица 1 - 2 - Показатели крови и мочи при желтухе (#"center">

Печеночные ферменты (АсАТ, а также АлАТ, щелочная фосфатаза) являются надежными критериями в оценке цитолитического и холестатического синдромов.Повышение содержания гаммаглютамилтранспетидазы и щелочной фосфатазы отражает поражение печени, тогда как изолированное повышение последней может быть связано только с патологией костной ткани.Сывороточный альбумин, коагуляция и протромбиновое время являются лучшими маркерами, отражающими синтетическую функцию печени, но уровень сывороточного альбумина может быть также связан с перераспределением жидкости в организме (например, при отеке, диарее).

Исследование мочи

Для оценки типа желтухи моча исследуется менее часто, чем кровь. Билирубин в моче отсутствует при надпечёночной желтухе (моча светлая, обычная). Уробилин в моче отсутствует при полном холестазе. Билирубин в моче присутствует при подпечёночной и внутрипечёночной желтухе, если уровень конъюгированной фракции в крови достигает 15 ммоль/л и более.

Другие исследования

При УЗИ возможно выявление расширенных внутри- и внепеченочных желчных протоков, наличие метастазов в печени. Метод позволяет определить размеры печени, селезенки, поджелудочной железы, оценить портальный кровоток, лимфоаденопатию, асцит, но с его помощью невозможно диагностировать цирроз печени. Расширение протоков - объективное доказательство в поддержку наличия механической обструкции билиарного тракта. Нерасширенные желчные протоки дают основание предположить наличие внутрипечёночного холестаза. Однако необходимо иметь в виду, что даже при наличии внепеченочной обструкции (стриктура, опухоль, холедохолитиаз) иногда отсутствует дилатация протоков. Общий желчный проток обычно бывает умеренно расширенным у больных, перенесших холецистэктомию. Результаты исследования зависят от квалификации специалиста и модели аппарата.

Надпечёночная желтуха

Желтуха умеренная, сывороточный билирубин редко превышает 90 ммоль/л, неконъюгированный. Нет изменений в окраске мочи.

1. Сывороточный гаптоглобин (снижен при гемолизе).

2. Прямой тест Кумбса.

3. Консультация гематолога (исследование костного мозга, тест для исключения ночной пароксизмальной гемоглобинурии).

Печеночная желтуха

1. Вирусные маркеры (HBsAg, HBeAg, антитела к вирусу гепатита А, С, D и другие исследования для обеспечения этиологической диагностики гепатитов).

2. Реакция Пауль-Буннеля при подозрении на инфекционный мононуклеоз.

3. Антигладкомышечные, антимитохондриальные и антинуклеарные антитела, если вирусные маркеры отрицательные и имеются симптомы аутоиммунного гепатита или первичного билиарного цирроза печени.

4. Биопсия печени, если диагноз остается неясным в результате проведенных неинвазивных исследований и предполагается хроническое активное заболевание печени или ферменты печени остаются не нормальными после острого вирусного гепатита. В биоптатах должны быть определены железо и медь.

5. Если отсутствуют вирусные маркеры и аутоантитела, необходимо исследовать сывороточное железо, железосвязывающую способность крови, ферритин (гемахроматоз). медь сыворотки, церрулоплазмин и 24-часовую экскрецию меди (болезнь Вильсона-Коновалова). При острых, а иногда и хронических гепатитах гипербилирубинемия коррелирует с тяжестью заболевания. Так, при остром гепатите В в легкой форме содержание билирубина обычно не превышает 90 ммоль/л (5 мг%), при среднетяжелой - колеблется в пределах - 90-170 ммоль/л (5-10 мг%). при тяжелой - свыше 170 ммоль/л (свыше 10 мг%), а при развитии печеночной комы билирубин может достигать 300 ммоль/л и более. Однако следует иметь в виду, что степень гипербилирубинемии не всегда зависит только от тяжести патологического процесса, она может быть обусловлена темпами развития гепатита, печеночной недостаточности, а тяжесть состояния больного может зависеть от системных проявлений. Например, при алкогольном гепатите - кардиомиопатия. энцефалопатия и т.д.

1.5.Иммунный статус

Иммунный статус - это комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты.

Его исследование проходит в 3 этапа. В первом этапе кровь суспендируют и разводят уксусной кислотой для подсчета лейкоцитов. Во втором этапе кровь ставят в термпостат для получения лейковзвесей, часть которой идет на хемилюминесцентный анализ а другая часть идет на выведение популяций клеток нейтрофилов и лимфоцитов. В последнем этапе популяционный состав и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивают с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции с моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD95, HLA-DR. CD – кластеры дифференцировки - Понятием кластер дифференцировки (от англ. cluster of differentiation, cluster designation; CD) обозначают номенклатуру дифференцировочных антигенов человеческих лейкоцитов. Данная классификация была принята с целью исследования и идентификации поверхностного мембранного белка лейкоцитов в 1982 году. CD-антигенами или, другими словами, CD-маркерами являются белки, которые служат лигандами, либо рецепторами, участвуют во взаимодействиях клеток и являются компонентами каскада установленных сигнальных путей. Данные белки способны выполнять и другие функции (в частности, белок клеточной адгезии). Перечень включенных в номенклатуру антигенов кластеров дифференцировки регулярно пополняется и на сегодня составляет свыше 320 CD-антигенов, а также их подтипов.

Система кластеров дифференцировки применяется в иммунофенотипировании для отнесения клеток к тому или иному типу по представленным на клеточных мембранах молекулам-маркёрам. Наличие определённых молекул может быть ассоциировано с соответствующими иммунными функциями. Хотя наличие одного типа CD обычно не позволяет точно определить популяцию клетки (за исключением нескольких примеров), сочетания маркёров позволяют определить её достаточно чётко.

В лабораториях кластеры дифференцировки выявляются с помощью моноклональных антител.

    ?Клоном называют совокупность клеток, появившихся от одной общей клетки. Клетки клона идентичны на 100%. Одинаковые клетки синтезируют одинаковые антитела, которые и называют моноклональными.

Наиболее часто встречающиеся следующие виды кластеров:

CD2 - кластер Т-лимфоцитов, NK-клеток;

CD3 - кластер Т-лимфоцитов;

CD4 - кластер Т-хелперов;

CD8 – кластер Т-супрессоров;

CD16 – кластер NK-клетки (натуральные киллеры);

CD20 – кластер В-клеток.

СD молекулы используемые для сортировки клеток в различных методах таких как проточная цитометрия.

Таблица – 3 Кластеры диффиренцировки

Обследование на иммуноглобулины дает информацию о состоянии гуморального звена иммунитета. Это используется в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных, инфекционных, гематологических и других заболеваний.
Изменения иммунологических показателей могут быть проявлением нормальной реакции организма на воздействие физиологических или патологических факторов (с различной картиной сдвигов на разных стадиях заболевания), отражать чрезмерную активацию, истощение иммунной системы, характеризовать врожденный или приобретенный дефект отдельных звеньев иммунной системы.

Два наиболее широко используемых CD маркера — CD4 и CD8, которые соответственно являются характерными для T-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Эти молекулы определяются в сочетании с CD3+, так и с другими маркёрами для других популяций клеток (некоторые макрофаги экспрессируют низкие уровни CD4; дендритные клетки имеют высокие уровни CD8). Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) связывает CD4 и хемокиновый рецептор на поверхности T-хелперов для проникновения в клетку. Таким образом, количество CD4 и CD8 T-лимфоцитов в крови часто используется для мониторинга развития ВИЧ инфекции.

Один из самых важных показателей иммунного статуса – компоненты комплемента С3, С4. Комплементом называют набор иммунных белков, содержащихся в свежей сыворотке крови. Они участвуют в бактерицидном действии крови.

С3 - центральный компонент системы комплемента, белок острой фазы воспаления. Это важнейшая часть защитной системы против инфекций. Он образуется в печени, макрофагах, фибробластах, лимфоидной ткани и коже. Поэтому нарушение их нормального состояния существенно влияет на этот компонент.

С4 – гликопротеин, синтезируется в легких и в костной ткани. С4 поддерживает фагоцитоз, увеличивает проницаемость стенки сосудов, участвует в нейтрализации вирусов. Этот тест обычно назначают при подозрениях на аутоиммунные нарушения, повторные бактериальные инфекции; при динамическом наблюдении больных с системными аутоиммунными заболеваниями; при диагностике системной красной волчанки, ревматоидных васкулитов и других заболеваний.

Еще один показатель иммунного статуса – криоглобулин – аномальный белок, который может присутствовать в крови при ряде заболеваний. При низкой температуре криоглобулины становятся нерастворимыми, приводя к закупорке небольших кровеносных сосудов, расположенных в пальцах рук и ног в холодную погоду, и вызывая появление характерной сыпи. Наличие криоглобулинов (криоглобулинемия) может являться симптомом различных заболеваний, в том числе макроглобулинемии, системной красной волчанки, а также ряда инфекционных заболеваний.

1.6. Иммуноферментный анализ

ИФА – Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Этим методом мы определяли количество интерлейкинов в крови. Интерлейкины - группа цитокинов (небольшие пептидные информационные молекулы.) , синтезируемая в основном лейкоцитами (по этой причине было выбрано окончание «-лейкин»). Также производятся мононуклеарными фагоцитами и другими тканевыми клетками. Интерлейкины являются частью иммунной системы.

Прямой иммуноферментный анализ – этапы проведения :

В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.
Прикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом.

Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы. Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном. Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.

Удаление «лишних» антител. Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой. Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают. В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок. Лунки несколько раз ополаскивают специальным раствором, который позволяет вымыть все «лишние» антитела.
Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения.
Далее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт). Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.

Мне удалось наблюдать и немного поучаствовать в этом методе на определение Интерлейкина 2 и Интерлейкина 6.

Интерлейкин 2  — белок, который относится к цитокинам воспаления и является медиатором иммунитета. Он является базовым в семействе интерлейкинов 2, в которое входят так же интерлейкины 4,7,9,15 и 21. Интерлейкин 2 играет центральную роль в регуляции клеточного иммунитета. Он вырабатывается активированными CD4+ Т-лимфоцитами, трансформированными Т- и В-клетками, лейкемическими клетками, лимфоцитарными активированными киллер-клетками и натуральными киллер-клетками. Интерлейкин 2  вызывает антигенную неспецифическую пролиферацию всех популяций Т-лимфоцитов и является фактором роста всех киллерных клеток, поэтому играет большую роль в противоопухолевом и трансплантационном иммунитете.

  Биологическая функция ИЛ-2 заключается в стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов, индукции синтеза ими гамма-интерферона, обеспечения их дифференцировки. Совместно с гамма-интерфероном он усиливает секрецию IgM и IgG. Это позволяет усилить защиту организма от инфекционных заболеваний путем запуска только тех клеток, которые активны в отношении микроорганизмов и вирусов.

  IL-2 участвует в развитии септического шока. Он усиливает проницаемость кишечной стенки и способствует вовлечению кишечной микрофлоры в септический процесс. По мере прогрессирования сепсиса уровень IL-2 в крови снижается, что требует проведения его коррекции.

При некоторых заболеваниях и старении рецепция IL-2 угнетается, что приводит к снижению активности клеточного иммунитета и развитию неопластических процессов.

В клинической практике, измеряя уровень IL-2, определяют функциональную активность Т-лимфоцитов при воспалительных, септических состояниях. Наиболее информативным является измерение растворимых рецепторов к IL-2, которые при патологических состояниях в большинстве случаев находятся в периферической крови и связывают избыток IL-2 в кровяном русле.

Когда уровень интерлейкина 2 повышен:

°  Аллергические заболевания.

°  Аутоиммунные заболевания.

°  Отторжение трансплантата.

°  Гематологические заболевания.

°  Бактериальный эндокардит.

°  Острый период первичной инфекции.

Когда уровень интерлейкина 2 понижен:

°  Онкологические заболевания.

°  Первичный и вторичный иммунодефицит.

°  СПИД.

°  Тяжелые ожоги, травмы.

°  Лечение цитостатиками и иммунодепрессантами.

°  Облучение ионизирующая радиация.

Интерлейкин 6 - то белок, который относится к цитокинам воспаления. Продуцируется в ответ на стимулирование антигеном, интерлейкином 1 и фактором некроза опухолей клетками иммунной системы, фибробластами, кератиноцитами, хондроцитами, клетками стромы эндометрия, клетками Лейдига в яичках, фолликулярно-звёздчатыми клетками гипофиза и гладкомышечными клетками кровеносных сосудов, эндотелиальными и синовиальными клетками, опухолевыми клетками различной гистологической природы.

Интерлейкин-6 характерен более широким набором эффектов по сравнению с другими цитоканами, имеет существенное сходство с действием интерлейкина-1. Под воздействием ИЛ-6 усиливается продукция кортикотропина и белков острой фазы, индуцируется лихорадка. Усиливается терминальная дифференцировка и продукция антител.

1.7.Хемилюминесцентный анализ оценки активности нейтрофильных гранулоцитов

Одним из наиболее перспективных методов, позволяющих оценить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, является хемилюминесцентный анализ.

Хемилюминесцентный анализ позволяет получать информацию о нативном состоянии и функциональной активности клеток. Установлена возможность непосредственного исследования клеточного ответа при воздействии физиологических и патологических агентов . Доказан высокий уровень корреляции между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом .

В связи с этим, определение хемилюминесценции нейтрофилов может использоваться как один из критериев их способности к завершенному фагоцитозу. Уровень хемилюминесценции нейтрофилов характеризует интенсивность «респираторного взрыва» в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие (супероксидный анион-радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.).

Хемилюминесцентная реакция включает следующие основные стадии: а) восстановление одного из участников реакции и окисление второго, приводящее к накоплению химической энергии в системе; б) перенос электрона на один из более высоких энергетических уровней и образование, таким образом, продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии; в) высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция).

Метод регистрации ХЛ клеток крови позволяет проводить изучение и отбор иммуномодулирующих фармакологических препаратов на основании сравнения люминолзависимой стимулированной хемилюминесценции до и после введения в пробу с лейкоцитарной взвесью исследуемых препаратов.

Хемилюминесцентный тест является высокочувствительным и безопасным методом диагностики непереносимости лекарственных средств. В случае непереносимости инкубация цельной крови с раствором этих препаратов в терапевтических концентрациях сопровождается достоверным снижением генерации активных форм кислорода нейтрофилами, стимулированными неспецифическими активаторами. Снижение люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови при непереносимости лекарственного препарата отмечается независимо от химических свойств и принадлежности медикаментов к фармакологическим группам.

 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 2.1. Объект исследования

Во время проведения анализов  мы использовали кровь больных  механической желтухой. Кровь взята из локтевой вены на голодный желудок. Медицинское учреждение в котором находились больные – Городская клиническая больница №6 г. Красноярска.

2.2. Методика Исследование иммунного статуса

1 этап :  Цельную кровь суспендируют, берут 10 мкл крови и разводят в планшете в 40 мкл уксусной кислоты для подсчета лейкоцитов (лейкоциты считают в камере Горяева в 5 больших квадратах по диагонали; суммарное количество лейкоцитов полученное в 5 больших квадратах делят на 4 и получают количество лейкоцитов в 1 л крови *10 в 9 степени). Также из цельной крови делают мазки на морфологию для подсчета развернутого анализа крови : капают на стекло 5 мкл цельной крови и растирают по стеклу шпателем. Для исследования миелопероксидазы в нейтрофилах делают мазок из цельной крови на стекле. Мазки подсушиваем и затем фиксируем: мазок на морфологию 96% спиртом ; мазок на миеопероксидазу – 10% смесью спирта и формалина. После подсушивания мазок на морфологию докрашивают красителем по Романовскому-Гимза; на миелопероксидазу соответствующим красителем.

2 этап :  Цельную кровь ставят в термостат на 30 минут для получения лйковзвеси (эритроциты должны осесть), 2 мл лейковзвеси забирают для хемилюминесценции. Оставшуюся лейковзвесь используют для выделения популяций клеток нейтрофилов и лимфоцитов. В пробирку вносят 2 мл фиколла с плотностью 1,119 на него наслаивают 2 мл фиколла с плотностью 1,077 и затем медленно вносят 5 мл лейковзвеси. Центрифугируют 40 минут при 500g .  После центрифугирования в пробирке должно наблюдаться расслоение лейковзвеси: верхний слой клеток это лимфоцитарное кольцо, нижний слой клеток – нейтрофильное кольцо. Лимфоциты выделяют в одну пробирку, нейтрофилы в другую (незабываем подписывать пробирки). Плазму (верхний желтоватый слой) забирают в 3 эпиндорфа по 500 мкл в каждый . Клетки в пробирках отмывают 2 раза вносят в пробирки по 2 мл среды ( в лимфоциты – 199 среды; в нейтрофилы – среды Хенкса), центрифугируют по 5 мин при 500 g.  После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, клетки рассуспендируют. После 2-го центрифугирования надосадочную жидкость сливают, клетки рассуспендируют и добавляют 1мл среды. Просчитывают количество лимфоцитов и нейтрофилов для биолюминесценции (см. разведение и подсчет лейкоцитов в камере Горяева). Количество клеток определяют по формуле ( X1 * 0?025) – 0,1=X2 где Х1- суммарное количество клеток в 5 квадратах Х2- количество среды на 100 мкл суспензии клеток (необходимая концентрация клеток 10 в 6 степени на 1 мл среды)

3 этап : Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивают с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD95, HLA-DR. (ТОО «Сорбент» г.Москва).

Отмытые лимфоциты капают в планшет в количестве 30 мкл на лунку и добавляют 3 мкл моноклонального антитела, затем суспендируют (1 лунка соответствует одному моноклональному антителу) , моноклоны закапывают в следующем порядке CD 3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD95, HLA-DR, затем инкубируют 60 минут при t +4 C ( в холодильнике).  Через 60 минут планшет вынимают из холодильника, содержимое планшета выливают и к лимфоцитарной суспензии добавляют 3 мкл ФИТЦ и 300 мкл среды 199 из расчета на одного человека (на 8 лунок), суспендируют и инкубируем с ФИТЦ – мечеными антителами 40 минут при T+4C ( в холодильнике). После этого клетки готовы для наблюдения. Окрашенные клетки просматриваются с помощью флуоресцентного микроскопа под водной иммерсией. Количество антител позитивных клеток определяют как процент флуоресцирующих клеток, при просматривании 100 лимфоцитов за вычетом процента флуоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. Если клетки не анализировать в день постановки методики, то их нужно зафиксировать в формалине и просмотреть в течение недели. После инкубации планшет вынимают из холодильника, содержимое планшета выливают и к лимфоцитарной суспензии добавляют 60 мкл 199 среда и 20 мкл 10% формалина на 1 лунку.

2.3. Метод определения хемилюминесценции.

Лейкоцитарный супернатант дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 500g. Супернатан сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл Хенкса и получают взвесь. Для подсчета клеток в планшет добавляют 40 мкл уксусной кислоты и 10 мкл лейковзвеси и подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камер Горяева в 5 больших квадратах по диагонали. Количество клеток определяют по формуле ( Х1*11*1000)/0,02=(Х2/2000000)-1 количство Хенкса необходимое добавить к 1 мл лейкоцитарной суспензии, где Х1 – суммарное количество клеток в 5 квадратах , Х2- количество нейтрофилов в1 мл суспензии ( необходимое количество клеток 2*10 в 6 степени). Для проведения хемилюминесцентного анализа используют следующие реактивы : донорскую сыворотку (группа крови АВ резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люминол или люцигенин в концентрации 100 мкг/мл . Готовят пробу : 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола или люцигенина и 40 мкл зимозана или бактериальной суспензии Staphylococcus epidermidis или  Staphylococcus aureus  в концентрации (0,4 ОП).  Бактериальную взвесь делают из суточной бактериальной культуры, которую разводят в 3 мл физиологического раствора. Концентрацию клеток измеряют на приборе КФК-2 при ?=590 им относительно физ.раствора, затем доводят физиологическим раствором  концентрацию бактериальной суспензии до 0,4 ОП. Хемилюминесцентный анализ проводят  в 8 кюветах ( в первых 4 используем любинол; во вторые 4 добавляем лоцигенин). Спонтанная хемилюминесценция осуществляется без добавления индуктора, во вторую кювету добавляют зимозан, в третью бактериальную суспензию Staphylococcus epidermidis, в четвертую Staphylococcus aureus при помощи хемилюминесцентного анализатора, например « CL.3604» в течение 90 мин. Генистрация результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляется через компьютер. Получают кривую хемилюминесценция. Определяют величину Tmax Imax Smax для каждого показателя (спонтанная хемилюминесценция, зимозан-зависимая хемилюминесценция и стафилококк-зависимая хемилюминесценция).

ВЫВОДЫ

1) Научилась работать с автоматическими дозаторами;

2) Приготовление рабочих растворов;

3) Научилась работать с флуоресцентным микроскопом;

4) Научилась выделять клетки крови;

5) Научилась работать с лабораторной посудой;

6)   Научилась работать с промывочным аппаратом;

7)   Научилась работать с термостатируемым шейк ером – инкубатором;

8)   Научилась работать с ИФА – анализатором;

9)   Освоение ИФА метода;

10) Познакомилась с методом непрямой иммунофлуоресценции;

11) Ознакомилась с методом хемилюминесцентного анализа нитрофильных гранулоцитов;

12) Провели анализ научной литературы;

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Желтуха, виды желтух – причины симптомы, неотложная помощь [Электронный ресурс]. URL: http://doctor-v.ru/med/jaundice-types-jaundice-causes-symptoms-emergency-care/#.211 (дата обращения: 15.09.2013)

2 Желтуха, симптомы, лечение [Электронный ресурс]. URL:  http://medicina.kharkov.ua/diseases/1103-jaundice.html (дата обращения 15.09.2013)

3 Желтуха . П. Я. Григорьев — профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик МАИ; и А. В. Яковенко — доцент кафедры гастроэнтерологии РГМУ [Электронный ресурс]. URL: http://gastroweb.ru/Pechen/Zheltuha.html (дата обращения 20.07.2013)

4 Jaundice Obstructuve Syndrom [Электронный ресурс]. URL: http://www.chsjournal.org/archive/vol37-no2-2011/for-practitionerfor-practitioner/jaundice-obstructive-syndrom дата обращения (15.07.2013)

5   Дадвани, С.А. Желчнокаменная болезнь / С.А. Дадвани, П.С. Ветшев [и др.]. — М.: Издательский дом Видар-М, 2000. —144

6 Хирургические болезни: Учеб. / М.И. Кузин, О.С. Шкроб, Н.М. Кузин и др.; Под ред. М.И. Кузина.-3-е изд, перераб. и доп. – М.: Медицина, 2005.

7 Барбара Бэйтс, Линн Бикли, Роберт Хекельман и др. Энциклопедия клинического обследования больного,  перевод с английского. Москва, Геотар медицина 1997г.

8  Дадвани, С.А. Желчнокаменная болезнь / С.А. Дадвани, П.С. Ветшев [и др.]. — М.: Издательский дом Видар-М, 2000. —144 с.

РЕФЕРАТ(SUMMARY)

Blood is the body's internal environment. She bespechivaet the normal functioning of all organs and tissues of a living organism. The blood is an indicator of all the processes in the organs. Therefore, the study of blood is an integral part of medical diagnostics.

The aim was to study the methods of laboratory analysis of blood and providing basic knowledge on the use of laboratory equipment.
All of the tasks performed. Learned to work with glassware and equipment. Conducted an analysis of the scientific literature. Familiarize yourself with the method of immune status, ELISA and by chemiluminescence analysis.