Клиническое значение выявления CagA-белка H. pylori при гастродуоденальной патологии

Клиническое значение выявления CagA-белка H. pylori при гастродуоденальной патологии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Медико-диагностический факультет

Кафедра поликлинической терапии и общеврачебной практики

Дипломная работа

Тема: Клиническое значение выявления CagA-белка H.pylori при гастродуоденальной патологии

Гомель - 2012 г.

РЕФЕРАТ

Объект исследования: Пациент, с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

Предмет исследования: Результат лабораторного, эндоскопического, гистологического исследований биоптатов полученных от данных пациентов.

Методы исследования: ПЦР-диагностика (Хеликопол НПФ «ЛИТЕХ», г. Москва, для определения присутствия Helicobacter pylori в исследуемых образцах, а выявление гена CagA H.pylori проводили при помощи двух наборов: первый «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА ,второй ОДО «Праймтех» г. Минск, Беларусь).

Цель исследования: Изучить распространенность CagA+ штаммов H.pylori в Гомельском регионе, и их клиническое значение при гастродуоденальной патологии.

Задачи исследования:

изучить данные литературы о клиническом значении и распространенности CagA+ штаммов H.pylori;

освоить методику определения CagA-белка;

сформулировать практические H.pylori рекомендации;

ВВЕДЕНИЕ

В 1875 году немецкие учёные обнаружили спиралевидную бактерию в слизистой оболочке желудка человека. Эта бактерия не росла в культуре (на известных в то время искусственных питательных средах), и это случайное открытие было в конце концов забыто.

В 1893 году итальянский исследователь Джулио Биззоцеро описал похожую спиралевидную бактерию, живущую в кислом содержимом желудка собак. В 1899 году польский профессор Валерий Яворский из Ягеллонского университета в Кракове, исследуя осадок из промывных вод желудка человека, обнаружил, помимо бактерий, напоминавших по форме хворостины, также некоторое количество бактерий характерной спиралеобразной формы. Он назвал обнаруженную им бактерию ''Vibriorugula''. Он был первым, кто предположил возможную этиологическую роль этого микроорганизма в патогенезе заболеваний желудка. Его работа на эту тему была включена в польское «Руководство по заболеваниям желудка».[19] Однако эта работа не имела большого влияния на остальной врачебный и научный мир, поскольку была написана на польском языке.

Бактерия была вновь открыта в 1979 году австралийским патологом Робином Уорреном, который затем провёл дальнейшие исследования её вместе с Барри Маршаллом, начиная с 1981 года. Уоррену и Маршаллу удалось выделить и изолировать этот микроорганизм из проб слизистой оболочки желудка человека. Они также были первыми, кому удалось культивировать этот микроорганизм на искусственных питательных средах.В оригинальной публикации Уоррен и Маршалл высказали предположение, что большинство язв желудка и гастритов у человека вызываются инфицированием микроорганизмом ''Helicobacterpylori'', а не стрессом или острой пищей, как предполагалось ранее. Признание научным сообществом этиологической роли этого микроба в развитии заболеваний желудка начало постепенно приходить лишь после того, как были проведены дополнительные исследования. Один из наиболее убедительных экспериментов в этой области был поставлен Барри Маршаллом: он сознательно выпил содержимое чашки Петри с культурой бактерии ''H. pylori'', после чего у него развился гастрит.Бактерия была обнаружена в слизистой его желудка, тем самым были выполнены три из четырёх постулатов Коха. Четвёртый постулат был выполнен, когда на второй эндоскопии, спустя 10 дней после преднамеренного заражения, были обнаружены признаки гастрита и присутствие ''H. pylori''. Затем Маршалл сумел продемонстрировать, что он в состоянии излечить свой хеликобактерный гастрит с помощью 14-дневного курса лечения солями висмута и метронидазолом.Маршалл и Уоррен затем пошли дальше и сумели показать, что антибиотики эффективны в лечении многих, если не большинства, случаев гастрита и язв желудка и двенадцатиперстной кишки.

В 1994 году Американский Национальный Институт Здравоохранения опубликовал экспертное мнение, в котором утверждалось, что большинство рецидивирующих язв желудка и гастритов с повышенной кислотностью вызываются инфицированием микробом ''H. pylori'', и рекомендовал включать антибиотики в терапевтические режимы при лечении язвенной болезни желудка, а также гастритов с повышенной кислотностью. Постепенно накапливались данные также о том, что язвы двенадцатиперстной кишки и дуодениты также ассоциированы с инфицированием ''H. pylori''.

В 2005 году первооткрыватели медицинского значения бактерии Робин Уоррен и Барри Маршалл были удостоены Нобелевской премии по медицине.[19-21]

До того, как стала понятна роль инфекции ''Helicobacterpylori'' в развитии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и гастритов, язвы и гастриты обычно лечили лекарствами, которые нейтрализуют кислоту (антациды) или снижают её продукцию в желудке (ингибиторы протонного насоса, блокаторы H2-гистаминовых рецепторов, М-холинолитики и др.). Хотя такое лечение в ряде случаев бывало эффективным, язвы и гастриты весьма часто рецидивировали после прекращения лечения. Весьма часто используемым препаратом для лечения гастритов и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки был висмута субсалицилат (пепто-бисмол). Он часто был эффективен, но вышел из употребления, поскольку его механизм действия оставался непонятным. Сегодня стало понятно, что эффект пепто-бисмола был обусловлен тем, что соли висмута действуют на ''Helicobacterpylori'' как антибиотик. На сегодняшний день большинство случаев язв желудка и двенадцатиперстной кишки, гастритов и дуоденитов с доказанной лабораторными тестами хеликобактерной этиологией, особенно в развитых странах, лечат антибиотиками, эффективными против ''Helicobacterpylori''.

Хотя ''H. pylori'' остаётся наиболее медицински значимой бактерией, способной обитать в желудке человека, у других млекопитающих и некоторых птиц были найдены другие представители рода ''Helicobacter''. Некоторые из них способны заражать и человека. Виды рода ''Helicobacter'' были также обнаружены в печени некоторых млекопитающих, причём они способны вызывать поражения и заболевания печени.[1,19-21]

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В последние годы интенсивно ведется поиск и исследование факторов, определяющих вирулентность штаммов H. pylori. Наиболее известные факторы вирулентности: вакуолизирующий цитотоксин (продукт гена VacA) и продукт цитотоксин-ассоциированного гена (CagA).[15,22] Ген CagA (cytotoxin-associated gene) получил свое название из-за частого сочетания с вакуолизирующим цитотоксином. Известно, что белок CagA имеет молекулярную массу 120-140 кДа и является иммунодоминантным антигеном H. pylori . [22]

Установлено, что CagA-содержащие штаммы увеличивают риск развития дистального рака желудка. У лиц, инфицированных CagA-продуцирующими штаммами, выше активность антрального гастрита и выраженность кишечной метаплазии. Кроме того, CagA-содержащие штаммы колонизируют слизистую оболочку не только желудка, но и двенадцатиперстной кишки, что может объяснить высокую частоту язвенной болезни у CagA-серопозитивных лиц.[7,13]

Ранее при проведении первых эпидемиологических исследований предполагалось, что инфекция ответственна за возникновение более чем 70% дуоденальных язв и 70-80% язв желудка (ЯЖ). Последние уточненные результаты широкомасштабных исследований в разных странах мира показали, что на долю язвенной болезни, ассоциированной с инфекцией Н.pylori, приходится 70-80% дуоденальных язв и 50-60% ЯЖ. [19,20]Пилорический хеликобактериоз официально включен в международную классификацию гастритов как хеликобактерный гастрит (или гастрит, ассоциированный с хеликобактериозом, гастрит типа "В", активный хронический гастрит), дуоденитов, и, возможно, некоторые случаи лимфом желудка и рака желудка (в 1995 году Международной Ассоциацией по Изучению Рака (IARC) H.pylori признан канцерогеном 1 класса) этиологически связаны с инфицированием ''Helicobacter pylori''. Однако у многих инфицированных носителей ''Helicobacter pylori'' не обнаруживается никаких симптомов заболевания.[19,17,9]

Таблица 1 - H. pylori и патология человека

В последние десятилетия в странах Западной Европы и США вследствие высокого социально-экономического уровня и проведения активных терапевтических мероприятий с целью эрадикации H. pylori происходит постепенное уменьшение распространённости хеликобактерной инфекции.

В России же инфицированность населения H. pylori остается крайне высокой и сопоставимой с развивающимися странами. Поэтому несомненна актуальность исследований, посвящённых изучению распространённости и клиническому значению CagA-продуцирующих штаммов H. pylori в Белоруссии. [7,1]

1.1 Helicobacter pylori что это такое?

''Helicobacter pylori'' - спиралевидная грамотрицательная бактерия, около 3 мкм в длину, диаметром около 0,5 мкм. Она обладает 4-6 жгутиками и способностью чрезвычайно быстро двигаться даже в густой слизи или агаре которая инфицирует различные области желудка и двенадцатиперстной кишки. [21]

1.2 Факторы вирулентности

Уникальные «колонизаторские» способности хеликобактера во многом обусловлены его высокой мобильностью: благодаря спиралевидной форме и наличию мощных жгутиков он может очень быстро проникать внутрь спасительного слоя вязкий слизи. Но колонизация вряд ли бы состоялась, если бы не чрезвычайно высокая уреазная активность бактерий. Настолько высокая, что в присутствии мочевины бактерии остаются жизнеспособными на протяжении полутора часов при рН 2,0. И что особенно интересно, в отличие от всех прочих уропатогенных бактерий - кишечной палочки, протея, клебсиеллы, провиденции, морганеллы, - Helicobacter pylori имеет в своем распоряжении не только внутриклеточную, но и внеклеточную уреазу. Для того, чтобы фермент очутился на поверхности бактерий, некоторым из них приходится «пожертвовать своей жизнью», зато результат того стоит. Во-первых, поверхностная уреаза связывает антитела к Helicobacter pylori, после чего комплекс уреаза-антитело благополучно удаляется с клеточной поверхности, а свободная уреаза занимает свое прежнее место. Во-вторых, уреаза действует как токсин (двуокиси углерода и аммиака, образующиеся при гидролизе мочевины, способны повреждать эпителий слизистой оболочки желудка). И, в-третьих, уреаза, активируя моноциты и нейтрофилы, выступая в качестве аттрактанта лейкоцитов, стимулируя секрецию цитокинов, образование окиси азота и радикалов кислорода, усиливает воспалительный процесс. Словом, уреаза - активный участник практически всех стадий процесса инфицирования. Что касается стадии «заселения», то для ее успешного завершения одной уреазы мало. В этом исследователи единодушны. Разногласия начинаются, когда речь заходит о количестве белков. Некоторые ученые в качестве претендентов на эту роль называют два белка, другие - один [6,3].

Но в любом случае «поселиться» на новом месте - это, как говорится, полдела. Чтобы реализовать свой патогенный потенциал, бактериям еще нужно там «закрепиться».pylori делает это с помощью адгезинов, взаимодействующих с эпителиальными клетками желудка, используя в качестве рецепторов остатки сиаловых кислот и остатки фруктозы люис-антигенов, а также сульфогруппы гликопротеинов, гликолипидов и фосфолипидов. Кроме того, бактерия наделена способностью «прилипать» к белкам соединительной ткани - коллагену, ламинину, витронектину - и проникать внутрь эпителиальных клеток. Возможно, за счет продукта гена ice A, который она начинает вырабатывать при контакте с эпителиальной клеткой. Предполагается, что этот самый продукт обладает цитотоксическими свойствами. Не исключено, что в качестве цитоксина выступает и один из поверхностных белков, участвующий в превращении плазминогена в плазмин. И совершенно точно известно о связи цитотоксичности с продуктом гена VacA, провоцирующим вакуолизацию эпителиальных клеток за счет образования пор в их цитоплазматических мембранах. Не вызывают сомнений и цитотоксические свойства белка, кодируемого геном CagA.

Точно лишь одно: все гены, так или иначе связанные с вирулентностью Helicobacter pylori, сосредоточены в одном сегменте хромосомы - так называемом «островке патогенности». И поскольку нуклеотидный состав «островка патогенности» сильно отличается от нуклеотидного состава остального генома, вполне возможно, что хеликобактер пилори когда-то «позаимстовал» его у какого-то микроорганизма, а «позаимствовав», встроил свою хромосому.

Как бы то ни было, но маркерами «островка патогенности» на сегодняшний день являются гены VacA и CagA. Ген ''cagA'' кодирует один из важнейших белков вирулентности ''H. pylori''. У лиц, инфицированных CagA-продуцирующими штаммами, выше активность антрального гастрита и выраженность кишечной метаплазии. Кроме того, CagA-содержащие штаммы колонизируют слизистую оболочку не только желудка, но и двенадцатиперстной кишки, что может объяснить высокую частоту язвенной болезни у CagA-серопозитивных лиц. Ген ''cagA'' кодирует белок длинной 1186 аминокислотных остатка. По наличию этих генов(VacA и CagA) все штаммы хеликобактера делятся на два типа: как правило, штаммы первого типа (VacA- и CagA-позитивные) выделяются в Европе, США и Австралии. А штаммы второго типа (VacA- и CagA-негативные) - в Юго-Восточной Азии. В некоторых случаях штаммы обоих типов выделяются у одного и того же человека. Возможно, в результате суперинфекции, а может, и в результате высокой нестабильности генома Helicobacter pylori. По логике вещей, постоянный обмен генами между штаммами «выгоден» для хеликобактера пилори. Хотя бы потому, что помогает бактериям лучше приспосабливаться к тому или иному «хозяину» и обрести устойчивость к химиопрепаратам. По крайней мере, к некоторым.

Хорошо известно, что под влиянием вирулентных штаммов клетки эпителия удлиняются и становятся похожими на узкий длинный клюв колибри. Фенотип "колибри" возникает также при действии на клетки фактора роста гепатоцитов. Вирулентные, но не доброкачественные, штаммы H. pylori инъецируют в клетки белок, называемый CagA. Далее белок cagA транспортируется внутрь клеток, где он нарушает нормальное функционирование цитоскелета. Хотя функция белка CagA до конца не выяснена, показано, что он является субстратом для внутриклеточных тирозинкиназ клеток хозяина и, следовательно, может вмешиваться в процессы фосфорилирования, являющиеся ключевыми при передаче сигнала внутрь клеток от многих мембранных рецепторов, что приводит к изменению морфологии клеток. Недавно клеточная мишень белка CagA была идентифицирована. Ею оказалась фосфатаза SHP-2, ответственная за фосфорилирование тирозина в клетках. Исследуя трансфецированные клетки желудочного эпителия, Higashi et al. обнаружили, что CagA подвергается в них фосфорилированию по тирозину подобно нормальным субстратам клеточных фосфатаз. Большинство таких клеток имели фенотип "колибри".содержит несколько остатков тирозина, потенциально пригодных для фосфорилирования, причем мутации этих сайтов способны предотвратить фосфорилирование белка CagA и развитие фенотипа "колибри".

В эпителиальных клетках желудка процессы фосфорилирования при трансдукции сигнала от активированных рецепторов обеспечивает фосфатаза SHP-2. Она же обеспечивает и морфологические изменения клеток, индуцируемые фактором роста гепатоцитов. Фосфатаза SHP-2 содержит два особых тандемно расположенных участка, так называемые SH2-домены, которыми фермент связывается с фосфотирозином. Higashi et al. изучили, может ли белок CagA взаимодействовать с SHP-2, и пришли к выводу, что CagA дикого типа, экспрессируемый в эпителиальных клетках желудка, не только фосфорилируется по тирозину, но и связывается с клеточной фосфатазой SHP-2, причем этот процесс зависит от фосфорилирования. Если к лизатам клеток, экспрессирующих CagA, добавляли антитела к фосфатазе SHP-2, то вместе с ферментом преципитировалась и большая часть фосфорилированного CagA. Таким образом, фосфорилированный CagA связывается с данной фосфатазой. Оказалось также, что при взаимодействии с микробным белком CagA ферментативная активность фосфатазы SHP-2 значительно усиливается. Был идентифицирован и участок молекулы SHP-2, с которым связывается микробный белок. Путем направленного мутагенеза исследователи получили клетки с мутантной фосфатазой SHP-2, лишенной SH2-доменов, и показали, что CagA-белок H. pylori взаимодействует именно с SH2-доменами фермента.

Было установлено, что фосфатазная активность SHP-2 играет ключевую роль и в развитии фенотипа "колибри", индуцируемого в клетках эпителия H. pylori. Так, при подавлении фосфатазной активности SHP-2 специфическим ингибитором отсутствовало и удлинение эпителиальных клеток под влиянием CagA. Однако, мутант SHP-2, способный взаимодействовать с CagA, но лишенный фосфатазной активности, практически не влиял на фенотип клеток.

Так же гены cag (cagA pathogenicity island, cag PAI) причастны к развитию воспалительного ответа путем инициации каскада сигнальных трансдукций, приводящего к продукции интерлейкина (ИЛ)-8. Ответная выработка провоспалительных цитокинов и клеточный (Th-1 - опосредованный) ответ приводят к дальнейшему прогрессированию воспалительной реакции. Активность ферментов NO-синтетазы (iNOS) и циклооксигеназы может нарушать баланс между процессами апоптоза желудочных эпителиоцитов и их пролиферацией, способствуя в первом случае изъязвлению СОЖ, а во втором - развитию опухолей. Th-1 - ответ организма хозяина и выработка анти-H.pylori антител не способствуют элиминации возбудителя, что вызывает проблемы при разработке иммунологических методов лечения и профилактики обсуждаемой патологии.

К таковым, помимо выше перечисленных белков, относятся еще и липополисахариды бактериальных клеток, в боковых цепях которых присутствуют эпитопы, похожие на эпитопы люис-антигенов слизистой желудка и лейкоцитов «хозяина». Причем похожие настолько, что антитела, образующиеся в процессе инфицирования Helicobacter pylori, не различая «кто есть кто», вступают в борьбу не только с «чужаками», но и со «своими» (т. е. люис-антигенами «хозяина»). Борьба со «своими» приводит к хорошо известным последствиям: образованию иммунных комплексов и - в конечном итоге - появлению повреждений в тканях «хозяина».

Столь же тесно с аутоиммунными реакциями связаны и белки теплового шока Hsp А и Hsp В, отвечающие за правильность сборки других белков. Однако, каким образом реализуется эта самая связь, непонятно, как непонятны и многие другие детали болезнетворности Helicobacter pylori. Пока сценарий патогенного действия хеликобактера известен лишь в общих чертах. По тому же сценарию бактерии «действуют» и в двенадцатиперстной кишке: как недавно выяснилось, у каждого третьего взрослого с гиперацидным гастритом эпителий дуоденума претерпевает метаморфозу, превращаясь в эпителий, свойственный желудку, что весьма благоприят­ствует заселению дуоденума Helicobacter pylori, «специализирующегося» исключительно на колонизации желудочного эпителия.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ HELICOBACTER PYLORI

2.1 Методы диагностики Helicobacter pylori

Среди всего многообразия методов диагностики Helicobаcter pylori выделяют две большие группы - инвазивные и неинвазивыне методы. Инвазивные методы основаны на взятии биоптатов при проведении фиброгастродуоденоскопии(цитологический,гистологический,быстрый уреазный тест). Неинвазивные методы же, не требуют проведения эндоскопического исследования (уреазный дыхательный тест). Наиболее распространенными из них являются цитологический, уреазный и гистологический методы.

Цитологический метод:

Материалом для цитологического исследования служат мазки-отпечатки биоптатов, полученные при эндоскопии из участков слизистой оболочки антрального отдела желудка или двенадцатиперстной кишки с наиболее выраженными морфологическими изменениями (гиперемия, отек и т.п.). Мазки высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Папенгейму или метанолазурэозиновой смесью. При цитологической диагностике можно не только определить наличие возбудителя, но и судить о составе клеточной инфильтрации по наличию лимфоцитов, плазмоцитов, эозинофилов и нейтрофилов. Чувствительность метода колеблется от 90 до 100%, специфичность - 89-100%.

Гистологические методы:

Гистологическое исследование биоптата характеризуется высокой специфичностью - 100%, в случае, если выполняется опытным специалистом. Чувствительность же метода колеблется от 69% до 95%-100%.

Данный метод имеет ряд преимуществ: широкая доступность, удобство хранения и транспортировки препаратов и возможность оценки в любое время любым специалистом, который легко может проводить ретроспективный анализ. Гистологический метод позволяет оценить любую из форм повреждения СОЖ (выраженность воспаления, атрофии, обнаружение метаплазии и дисплазии слизистой).

При взятии биопсийных проб возможен ложноотрицательный результат вследствие неоднородности локализации бактерии на слизистой, поэтому для уменьшения вероятности ложноотрицательных результатов рекомендовано взятие двух биоптатов из антрального отдела, двух из тела желудка и одного из угла желудка.

Иммуногистохимический метод

Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Helicobacter pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только Helicobacter pylori. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при исключительно низкой степени обсемененности слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori, когда морфологический метод и уреазный тест дают ложноотрицательные или сомнительные результаты. Он также используется для выявления морфологически измененных (кокковых форм) Helicobacter pylori, ,и даёт возможность не только существенно повысить чувствительность и специфичность гистологического выявления Helicobacter pylori, но и идентифицировать различные штаммы Helicobacter pylori, что важно для выяснения природы повторного инфицирования слизистой оболочки после эффективного антихеликобактерного лечения.

Уреазный дыхательный тест метод ("золотой стандарт" диагностики):

В развитых странах в последние годы стандартным методом контроля за эрадикацией стал уреазный дыхательный тест, который основан на способности уреазы разлагать мочевину до НСО3 ¯ и NH4 +. Из НСО3¯ образуется СО2, который, попадая в кровоток, затем транспортируется в легкие. Для проведения УДТ необходима мочевина, меченная радиоактивным углеродом ¹³С или 14С. Чаще в клинической практике применяется нерадиоакивный стабильный углерод ¹³С. 14С используется реже, так как является источником излучения низкоэнергетических β-частиц, которые обнаруживаются сцинтилляционным счетчиком. Изотоп количественно определяют газовым хроматомасс-спектрометром или с помощью инфракрасного и лазерного оборудования.

В начале исследования берутся 2 фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат; в течение 1 часа, с интервалами в 15 минут, у него берут 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воздухе определяют в течение 10-30 минут. Затем пробирки направляются на масс-спектрометрию. Результат выражается как приращение ¹³СО2 - δ¹³СО 2, его экскреция (‰) и считается положительной при значениях выше 5‰.

В ряде стран используется определение изотопного отношения концентраций ¹³СО2/¹²СО2, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных погрешностей.

При использовании дыхательного уреазного теста ложноположительные результаты считаются редкими (4-10%), ложноотрицательные результаты возможны у пациентов, принимавших перед исследованием антисекреторные и висмутсодержащие препараты, которые ингибируют уреазу бактерий, в связи с чем рекомендуется осуществлять диагностику эрадикации уреазными методами не ранее чем через месяц после приема этих препаратов, а так же у пациентов имеющих кокковые формы Helicobacter pylori.

Быстрый уреазный тест:

Уреазный тест («кампи-тест») относится к числу экспресс-методов выявления Helicobacter pylori.

Стандартный «кампи-тест» состоит из:

содержащего мочевину геля-носителя;

раствора азида натрия;

раствора фенол-рота - используется в качестве индикатора рН, который при сдвиге рН среды в щелочную сторону меняет свой цвет от желтого к малиновому; сдвиг рН происходит в том случае, если под действием хеликобактерной уреазы происходит гидролиз мочевины с образованием аммиака. В качестве источника хеликобактерной уреазы используют биоптаты слизистой оболочки, которые помещают в луночку специальной плашки из синтетического материала, заполненную готовой стерильной средой. Появление малинового окрашивания теста свидетельствует о наличии в биоптате микробных тел Helicobacter pylori.

О количестве Helicobacter pylori в биоптате косвенно судят по времени изменения окраски теста:

•значительное инфицирование слизистой оболочки НР (+++) - малиновая окраска теста появляется в течение 1 часа от начала исследования;

•умеренное инфицирование слизистой оболочки НР (++) - окраска индикатора изменяется через 2-3 часа;

•незначительное инфицирование слизистой оболочки НР (+) - малиновое окрашивание теста появляется к концу суток.

Более позднее окрашивание теста относят к отрицательным результатам.

При проведении уреазного теста нужно учитывать и тот факт, что он может быть положительным у лиц, желудок которых колонизирован Helicobacter heilmanii, имеющим близкое сродство с Helicobacter pylori.

Фазо-контрастная микроскопия:pylori может быть обнаружен до микробиологического или гистологического исследования при помощи фазово-контрастной микроскопии. Этот метод весьма удобен для обнаружения Helicobacter pylori, при условии достаточно высокой степени обсеменения.

Преимущества фазово-контрастной микроскопии:

•нет необходимости проводить фиксацию материала и дополнительных окрасок ткани

•исследование можно проводить в обычных лабораторных условиях

•результат может быть получен через 1-2 мин.

Микроскопия проводится с увеличением в 100 раз с использованием иммерсионного масла. В препарате - типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.

Иммунологические методы:

Иммунологические методы основаны на выявлении у больных, инфицированных Helicobacter pylori, специфических антител, которые можно обнаружить в сыворотке крови уже через 3-4 недели после инфицирования. Достаточно высокий титр антител сохраняется даже в периоде клинической ремиссии заболевания. Отрицательным тест становится после успешного антибактериального лечения, что позволяет использовать метод для контроля эффективности такой терапии. Для выявления специфических антител используют различные методики, в частности, метод иммуноферментного анализа (ИФА) с определением антител IgG и IgA классов в сыворотке крови.

При оценке результатов иммунологического анализа следует помнить, что антитела к различным антигенам бактерии могут присутствовать в крови на протяжении года после эрадикации бактерий, что не позволяет применять методы для контроля результатов антигеликобактерного лечения.

Бактериологический метод:

Наибольшую информацию о Helicobacter pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. Это единственный метод исследования, обладающий 100% специфичностью. При этом виде исследования возможно не только выделение чистой культуры Helicobacter pylori и ее идентификация, но и изучение морфологических, биохимических и биологических свойств возбудителя.

Бактериологический метод исследования дает возможность определять антибиотикорезистентность у Helicobacter pylori и проводить за ней динамические наблюдения. Без бактериологического метода планировать клиническое испытание лекарственных препаратов, учитывая причины неудачи эрадикации, нельзя, так как основная причина, снижающая процент эрадикации - антибиотикорезистентность Helicobacter pylori.

В эпидемиологической практике выделение чистой культуры Helicobacter pylori необходимо для внутривидового типирования штаммов, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, которое может быть обусловлено тем же штаммом. В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности Helicobacter pylori, изготовлять препараты для серологической диагностики, создать банк штаммов для эпидемиологических и других исследований, так как штаммы бактерии в замороженном виде при температуре -70°С могут храниться в течение 5-7 лет. Без этого метода невозможно дальнейшее научное изучение микроорганизма. Однако этот метод достаточно дорогой. Кроме того, он сопряжен с определенными трудностями, обусловленными необходимостью наличия специальных сред, оптимальной температуры, влажности, качества атмосферного воздуха и т.д. Это приводит к тому, что рост колоний микроорганизмов удается получить далеко не всегда. Неудобство метода связано и с тем, что его результатов приходится ждать, как правило, не менее 10-14дней. В клинической практике он применяется в основном в случаях инфекции Helicobacter pylori, резистентной к обычным схемам антигеликобактерной терапии. Helicobacter pylori крайне «капризен», требует специальных условий культивирования и дорогостоящего оборудования. Большой шаг вперед в успешном культивировании Helicobacter pylori принадлежит транспортным средам, которые дают возможность продлить срок транспортировки биоптата из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию до суток (среды Стюарта, Кэри-Блэйера, Био Мерьо).

Посевы инкубируются при температуре 37°С, влажности 98%, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. Helicobacter pylori растет в атмосфере, содержащей 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Многие штаммы Helicobacter pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +32°С... +39°С, но не растут при +27°С ...+42°С. Время инкубации: первичное исследование - 7 дней, контроль лечения - 14 дней.

На неселективной питательной среде Helicobacter pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Helicobacter pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида. При появлении колоний, сходных по морфологии с Helicobacter pylori (диаметром до 0,5 - 2 мм в виде «капель росы» или при сплошном росте, образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Предложена методика полуколичественного определения обсеменения слизистой оболочки желудка в зависимости от числа выросших микробных колоний: до 10 колоний в чашке (1+), 10-20 колоний (2+), 20-50 колоний (3+), более 50 колоний (4+).

Для идентификации мазки окрашивают по Граму. Под микроскопом в случае Helicobacter pylori обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование - уреазная, каталазная, оксидазная активность, Helicobacter pylori не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР):

Метод предназначен для качественного обнаружения ДНК Helicobacter pylori в биологических образцах (биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана, слюна).

Позволяет оценить генотипические и фенотипические характеристики возбудителя. Почти у каждого пациента имеется уникальный штамм Helicobacter pylori. Выявлено, что вирулентность Helicobacter pylori во многом обусловливает клинические проявления инфекции.

Существует ряд генов, продукты которых - белки Cag A, Vac A, Ice A, Bab A - полагают факторами патогенности.

В зависимости от их наличия выделяют два типа штаммов Helicobacter pylori. Экспрессирующие Cag A- и Vac A-токсин относятся к первому типу, штаммы второго типа не экспрессируют указанные гены и считаются менее патогенными. Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.

ПЦР (относится к молекулярно-биологическим методам) представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.

Метод ПЦР в средах позволяет идентифицировать Helicobacter pylori без выделения чистой культуры по присутствующим в исследуемом материале фрагментам его генома.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Эта реакция носит название репликации ДНК.

Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

.1 Материалы исследования

В исследовании участвовало население гомельской области:

Случайная репрезентативная выборка взрослого населения: 71 человек в возрасте 13-83лет, из них 22 мужчины (средний возраст 38,4 года) и 49 женщин (средний возраст 40,6 года).

Для выявления гастроэнтерологической патологии у обследуемых лиц использовали данные эндоскопических и гистологических исследований, а так же данные полученные в молекулярно-генетической лаборатории, на наличие у обследуемых Helicobacter pylori.

Биопсийный материал обследуемых лиц исследовался методом ПЦР-Хеликопол НПФ «ЛИТЕХ», г. Москва, для определения присутствия Helicobacter pylori в исследуемых образцах, а выявление гена CagA H. pylori проводили при помощи двух наборов: первый коммерческий набор реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА, второй набор состоит из последовательности праймеров взятых нами из открытого источника, которые были синтезированы ОДО «Праймтех» г. Минск, Беларусь.[23]

.2 Методы исследования

Методика проведения исследования клинического материала (биоптат слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки) на наличие ДНК Хеликобактер пилори методом ПЦР:

«Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ (Helicobacter pylori)».

Принцип работы метода:

В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК микроорганизма путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК-мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК.

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозид-трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94оC происходит разделение цепей ДНК, затем при 57-62оС - присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72оC протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5’-3'.

В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 35 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для его детекции с помощью электрофореза.

Проведение ПЦР-анализа включает 3 лабораторных этапа:

. обработка клинических проб (выделение ДНК);

. постановка реакции ПЦР (амплификация);

. детекция продуктов амплификации (в данной методике - электрофоретическое разделение продуктов в агарозном геле).

Необходимое оборудование и расходные материалы:

этап - выделение ДНК из биопроб:

ламинарный бокс 2 класса защиты;

твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорф, поддерживающий температуру до 99оС;

высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8-12 тыс.об/мин;

центрифуга для пробирок 50 мл 1,5-3тыс.об/мин;

микроцетрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин (или вортекс);

пипетки-дозаторы переменного объема ( 5-50; 20-200; 100-1000 мкл);

вакуумный аспиратор (насос) с колбой-ловушкой;

штатив для хранения пробирок 1,5 мл;

штатив для пробирок 1,5 мл «рабочее место»;

одноразовые наконечники для дозаторов до 200 мкл и до 1000 мкл;

холодильник с морозильной камерой для хранения клинического материала;

одноразовые перчатки;

комплект «Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ»

этап - проведение ПЦР (амплификация):

ПЦР-бокс с УФ-лампой;

программируемый термостат амплификатор;

микроцентрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин;

пипетка-дозатор переменного объема 5 - 50 мкл для работы с биопробами;

пипетки-дозаторы переменного объема (0,5 - 10; 5-50; 20-200; 100-1000 мкл) для приготовления рабочей смеси реагентов;

одноразовые полипропиленовые микропробирки 0,5 мл (или 0,2 мл) для амплификации;

одноразовые наконечники до 200 мкл и до 1000 мкл для приготовления рабочей смеси реагентов;

одноразовые наконечники с фильтром (аэрозольным барьером) до 100 или до 200 мкл для биопроб;

штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»;

штативы для наконечников 200 мкл;

одноразовые перчатки;

емкость для сброса использованных наконечников;

холодильник с морозильной камерой для хранения исходных реагентов;

комплект реагентов для проведения ПЦР (индивидуален для каждого возбудителя);

этап - детекция продуктов амплификации:

камера для горизонтального электрофореза;

источник постоянного тока с напряжением не менее 150 В;

УФ-трансиллюминатор;

СВЧ-печь для плавления агарозы;

технические весы для взвешивания агарозы;

видеосистема для документирования гель-электрофореграмм со светозащитным кабинетом или тубусом, подключенная к персональному компьютеру;

пипетка-дозатор переменного объема 5-50 мкл для нанесения образцов на гель;

пипетка-дозатор переменного объема 100-1000 мкл;

одноразовые наконечники до 200 мкл для нанесения образцов;

одноразовые наконечники до 1000 мкл;

штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»;

агароза, раствор бромистого этидия, 50хТАЕ буфер для приготовления геля и проведения электрофореза (или готовый комплект реагентов для электрофоретической детекции);

пластиковая емкость большого объема для дезактивации буфера и гелей.

СОСТАВ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ для ПЦР

В состав набора реагентов входят три комплекта:

. Комплект для пробоподготовки (выделения ДНК)

«Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ» (кат № 020104) (на 50 образцов):

. Лизирующий раствор 5 мл

. Раствор I 25 мл

. Раствор II 10 мл

. Раствор III 100 мл

. Cорбент 1 мл

. ТЕ буфер 2.5 мл

Комплекты для проведения ПЦР (амплификации).

Рассчитаны на проведение анализа 50 исследуемых образцов, 5 положительных контрольных образцов и 5 отрицательных контрольных образцов.

ХЕЛИКОПОЛ (кат № 010111):

Реакционная смесь 150 мкл полимераза (5 ед/мкл) 15 мкл

Разбавитель 1 мл

Минеральное масло 1 мл

ДНК контрольная H.pylori 25 мкл

. Комплект для детекции продуктов амплификации

Для детекции продуктов амплификации можно использовать как готовые комплекты, так и отдельные реагенты.

Готовые комплекты:

Комплект №1 (кат №030106) (на 100 -150 образцов)

агароза-2х2г, 50хТАЕ буфер-25 мл, раствор бромистого этидия-30мкл

Комплект №2 (кат №030107) (на 120 образцов)

% агарозный гель (40 лунок) - 3 шт, 50хТАЕ буфер-25 мл

Отдельные реагенты:

Агароза (100г/уп; 2г/уп) (кат №030101)

Раствор бромистого этидия (1мл/уп) (кат №030104)

50хТАЕ буфер (200 мл/уп; 120мл/уп) (кат №030102)

2% агарозный гель для электрофореза (40 лунок) (1шт/уп; 5шт/уп) (кат №030108).

3.3 Проведение исследования

Взятие, доставка и хранение материала:

Исследуемый биопсийный материал опускается в стерильную сухую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.

Пробу доставить в лабораторию в течение 2-х часов (в термосе со льдом) для выделения ДНК или заморозить и хранить при температуре - 20°C не более 2 недель.

Выделение ДНК из биопроб:

. В 1.5 мл пробирку с биоптатом добавить 100 мкл лизирующего раствора и инкубировать, периодически встряхивая, при 55оС до полного растворения ткани (это процесс занимает от 2 до 4 часов , при необходимости инкубацию можно проводить в течение ночи при 37оС).

. Осадить сконденсированные на внутренней поверхности пробирки капли жидкости центрифугированием в течение 5 сек при 8-12 тыс. об/мин. К полученному лизату добавить 20 мкл суспензии сорбента (перед добавлением суспензию тщательно перемешать) и 500 мкл раствора I . (Раствор I перед использованием прогреть на водяной бане 10 мин. при температуре 50-60оС и тщательно перемешать). Полученный раствор перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин., периодически встряхивая на вортексе.

. Осадить сорбент центрифугированием на микроцентрифуге в течение 15 сек при 8-12 тыс. об/мин. Удалить супернатант.

На всех стадиях обработки клинического материала удаление супернатанта производят одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи вакуумного насоса в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т.п.)

. К осадку добавить 200 мкл раствора II, перемешать смесь, осадить сорбент центрифугированием в течение 15 сек на микроцентрифуге при 8-12 тыс. об/мин., удалить супернатант.

. Промыть сорбент 2 раза 1 мл раствора III , как описано в п.2.4

. Пробирки поместить в твердотельный термостат и подсушить сорбент 5-10 мин при температуре 55-60оС, оставляя пробирки открытыми.

. В пробирки с сорбентом добавить 50 мкл ТЕ буфера, закрыть их, тщательно перемешать на вортексе и инкубировать в течение 5 минут при 55-60оС.

. Пробирки центрифугировать 15 сек при 8-12 тыс.об/мин..

Водную фазу (супернатант) использовать в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

Водную фазу снятую с сорбента можно хранить при температуре -20оС в течение 6 месяцев.

Проведение ПЦР (амплификация):

. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл), включая пробирки для положительных и отрицательного контрольных образцов

. За 20-30 минут до приготовления амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для амплификации из морозильника, разморозить содержимое (желательно поместить пробирку с Taq-полимеразой в ледяную баню). Размороженные пробирки тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

. Из компонентов набора приготовить смесь реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

ХЕЛИКОПОЛ:

Разбавитель17,5 мкл,

Реакционная смесь32,5 мкл,полимераза0,2мкл

Рекомендуется готовить смесь реагентов не менее чем на 5 реакций для достоверной дозировки объема фермента

Для каждой смеси праймеров готовится отдельная амплификационная смесь. Все компоненты добавлять отдельными наконечниками.

. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.

. Добавить по 20 мкл амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации (для ХЕДИКОПОЛ СА, VA, BA и IA-по 25 мкл).

. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.

. Внести 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы (см п. выделение ДНК) в соответствующую пробирку с амплификационной смесью для проведения амплификации под слой масла.

. Внести в пробирки для положительных контрольных образцов по 5 мкл соответствующего положительного контрольного образца ДНК из состава набора, а в пробирку для отрицательного контрольного образца - 5 мкл разбавителя или деионизованной воды из состава набора.

. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 2250 - 4000g (1,5 -3000 об/мин) при комнатной температуре (+18 - 25оС) на микроцентрифуге-вортексе.

. Перенести пробирки в прогретый до температуры +93оС программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по следующим программам:

Таблица 2 - Программа амплификации для выявления H. pylori

3.4 Детекция продуктов амплификации:

Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза.

. Залить в аппарат для электрофореза ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз.

. К 2,0 г агарозы добавить 2 мл 50х ТАЕ буфера и 100 мл дистиллированной воды.

. Приготовленную смесь расплавить на электрической плите или в СВЧ-печи. Добавить к 100 мл расплавленной агарозы 10 мкл 1% раствора бромистого этидия. Перемешать.

. Охладить расплавленную агарозу до температуры 50-60оС и залить в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов установить на планшет гребенку, используя зажим типа «бульдог». После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перенести планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза.

. Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата в последовательности соответствующей нумерации проб. Нанести положительные и отрицательные контроли.

. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2см.

Визуализация результатов электрофореза

. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло УФ-трансиллюминатора.

ВНИМАНИЕ! С гелем агарозы следует работать в перчатках. Бромистый этидий является сильным мутагеном.

. Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм.

3.5 Анализ результатов

. В отрицательном контрольном образце (К-) полосы должны отсутствовать.

Появление полосы на уровне положительного контроля свидетельствует о контаминации (загрязнении) компонентов набора.

. В положительных контрольных образцах (К+) должна выявляться одна полоса, соответствующая ПК.

. Анализируемые пробы:

отсутствие полосы оранжево-красного цвета строго на уровне положительного контроля (ПК) свидетельствует об отсутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе; наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю - о присутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе.

. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра.

Таблица 3 - Размер фрагментов ДНК

Рис. 1 - Визуализация результатов электрофореза, при исследовании биопроб на наличие Хеликобактер пилори методом ПЦР

3.6 Выявление гена CagA H. pylori

Первое выявление гена CagA H.pylori проводили с использованием коммерческого набора реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА. Ниже представлены условия проведения ПЦР выявления генотипа CagA H.pylori с использованием коммерческого набора реагентов

Состав компонентов реакционной смеси для выявления генотипа CagA H.pylori

ХЕЛИКОПОЛ СА:

Вода деионизованная14,3 мкл

ПЦР-буфер3 мкл

Раствор дНТФ3 мкл,5 мкл

Смесь праймеров cagA2 мклполимераза (5ед/мкл).0,2 мкл

Таблица 4 - Программа амплификации для выявления генотипа CagA H. pylori

Проведение ПЦР (амплификацию) и электрофоретическую детекцию проводили аналогично предыдущему исследованию.[23]

Полученные результаты:

Рис. 2 - Детекция ПЦР-продукта методом гель-электрофореза, при определении генотипа CagA H.pylori, с использованием коммерческого набора реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА

Вторично проводили выявление генотипа CagA H.pylori характеризующего западный тип при помощи последовательности праймеров взятых нами из открытого источника.

Используемые нами праймеры были синтезированы ОДО «Праймтех» г. Минск, Беларусь. Каждая пара праймеров имела паспорт, где указывались последовательность, концентрация, температура плавления, молекулярный вес, соотношение GC и OD260/OD280.

Последовательность праймеров для выявления гена CagA H.pylori характеризующего западный тип размером 501 нуклеотидная пара.

CagAWestеrn F

/- GGA ACC CTA GTC GGT AAT G 3/-еrn R

/- TTT CAA AGG GAA AGG TCC GCC 3/-

Состав компонентов реакционной смеси для выявления генотипа CagA H.pylori,характеризующего западный тип из расчета на 1 анализ.

-х DreamTag PCR Master Miх (DreamTag PCR Green buffer, DreamTag DNA polymerase , 4мМ MgCl2, Смесь нуклеотидов дНТФ 10 мМ) -12,5 мкл.

Праймер CagA Westеrn F 10 мМ - 1 мкл

Праймер CagA Westеrn R 10 мМ - 1 мкл

Вода деионизованная - 8,5 мкл

Препарат ДНК с концентрацией 20 - 40 нг/мкл - 1мкл

Программа амплификации для выявления генотипа CagA H. pylori характеризующего западный тип

С пауза

С 5 мин. 1 цикл

С 30 сек

С 30 сек 35 циклов

С 40 сек

С 5 мин 1цикл

С хранение

Проведение ПЦP - исследования

В ПЦР-пробирку вносили 24мкл реакционной смеси, добавляли 1 мкл образца исходной ДНК с концентрацией 20-40нг/мкл и помещали пробирки в амплификатор Palm Cycler фирмы «Corbett Research» (Австралия) для проведения амплификации по соответствующей программе.

Детекция ПЦР-продукта методом гель-электрофореза

Детекцию ПЦР-продуктов проводили в горизонтальной электрофоретической камере типа «Хеликон», Россия, используя 1,7-2% агарозные гели.

Для приготовления агарозных гелей агарозу растворяли в 1,5 M Трис-ЭДТА-боратном буфере c бромистым этидием (0,5мкг/мл) путем нагревания смеси. Затем горячий раствор заливали в специальную камеру и с помощью гребенок формировали лунки. После застывания гель помещали в камеру для проведения электрофореза, содержащую Трис-ЭДТА-боратный буфер и вносили в лунки геля продукты амплификации. После загрузки гелей камеру подключали к источнику питания типа Эльф-4 и устанавливали нужные параметры напряжения и силы тока.

Фотодокументирование результатов проводили видеосканированием в УФ-свете при помощи специальной системы Gel - DосXR «BioRad» (Франция). Величина размера каждой амплифицированной зоны вычислялась относительно электрофоретической подвижности маркеров с известной молекулярной массой GeneRulerTM 100 bp или 50bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). [23]

Полученные результаты:

Таблица 5 - Сравнение полученных данных при исследовании на наличие CagА белка, при использовании двух методов («Праймтех» г. Минск, Беларусь, и НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА)

Выводы по полученным результатам:

Из приведенных в таблице данных можно сделать вывод о том что набор «Праймтех» г. Минск, Беларусь, является более специфичным и чувствительным, т.к если сравнивать процентное соотношение отрицательных и положительных результатов в двух наборах(«ЛИТЕХ» :+36,3%,-63,6%;«Праймтех»:+56,8%,-43,1), то количество положительных результатов на наличие CagA белка во втором наборе было выше в 1,5 раза, чем в первом.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Таблица 6 - Эндоскопические и гистологические проявления инфекции H. pylori у носителей

4.2 Анализ полученных материалов эндоскопического исследования

Как показали проведённые исследования 62%-х обследуемых лиц были положительными в отношении хеликобактерной инфекции. Частота обнаружения H. pylori у мужчин 46,2% ,а у женщин 57,8% ,т.е. существенно не отличалась.

Таблица 7 - Эндоскопические проявления инфекции H. pylori

При дальнейшем анализе 44-х положительных в отношении H. pylori сывороток было установлено, что 25(56,8%) из них CagA + положительны, а 19(43,1%) образцов были CagA- отрицательны. Анализ эндоскопических особенностей проявления хеликобактерной инфекции в зависимости от наличия CagA белка в данных двух группах был проведён на следующем этапе.Такие признаки, как хронический гастрит , эрозии антрального и препилорического отдела желудка и ДПК отмечались с несколько большей частотой ,как в группе (Нр+),так и внутри самой группы.

Рис. 4 - Частота (%) встречаемости гастритов, эрозий антрального и препилорического отдела желудка и ДПК зависимости от наличия H. pylori и CagA-статуса

У лиц с результатом анализа (Нр+, CagA+) отмечена тенденция к более частому появлению: хронического гастродуоденита(40%),что в 2,5 раза больше, как в (Нр+,СagA-),так и в Нр- группах, хронических язв ДПК(8%),что существенно выше чем в двух остальных группах, рубцово-язвенной деформации луковицы ДПК(12%),что в 12 раз выше чем в CagA-,и в 3 раза выше чем в Нр- группах, а так же хронического эрозивного рефлюкс-эзофагита(20%),что от 3-4 раз выше, чем в остальных группах.

Рис. 5 - Частота (%) встречаемости гастродуоденита, хронических язв ДПК, рубцово-язвенной деформации луковицы ДПК, и хронического эрозивного рефлюкс эзофагита в зависимости от присутствия H. pylori и CagA-статуса

4.3 Анализ полученных материалов эндоскопического исследования

Таблица 8 - Гистологические проявления инфекции H. pylori

Данные анализа отдельных гистологических признаков гастроэнтерологической патологии в обследуемой группе представлены в таблице 7. Видно, что степень выраженности и активности хронического гастрита, увеличиваются в группе (Нр+, CagA+) здесь же преобладают выраженный, умеренноактивный и высокоактивный гастрит с атрофией, то же самое и с фовеолярной и лимфоидноклеточной гиперплазией. В двух остальных группах преобладает маловыраженный, не активный или малоактивный гастрит без атрофии.

Рис. 6 - Процентное соотношение по степени выраженности хронического гастрита в зависимости от присутствия H. pylori и CagA-статуса

Рис. 7 - Процентное соотношение по степени активности хронического гастрита в зависимости от присутствия H. pylori и CagA-статуса

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ген инфекция вирулентность helicobacter

В проведении данного исследования принимал участие 71 пациент, который обратился с жалобами на проблемы связанные с желудочно-кишечным трактом, нами в лаборатории исследовались биоптаты полученные от данных больных. Нами было установлено что из 71 образца, 44 оказались Нр+(что составляет 62%),при дальнейшем исследовании на наличие CagA-белка, было установлено что 25 из 44-х образцов были положительны. В дальнейшем мы продолжили исследования данных эндоскопического и гистологического исследования.

Из полученных эндоскопических данных четко видно что хронический гастродуоденит (в 2,5 раза), хронические язвы ДПК(от 2-8 раз),а так же рубцово-язвенная деформация луковицы ДПК(от 3-12 раз) встречаются во много раз чаще в группе (Нр+CagA+),чем в двух остальных группах ,что касаемо хронического гастрита, эрозий антрального и препилорического отдела желудка и ДПК, то они отмечались с несколько большей частотой ,как в группе (Нр+),так и внутри самой группы. Так же мы исследовали данные гистологических исследований где так же видно, что степень выраженности и активности хронического гастрита, увеличиваются в группе (Нр+, CagA+) здесь же преобладают выраженный, умеренноактивный и высокоактивный гастрит с атрофией, то же самое и с фовеолярной и лимфоидноклеточной гиперплазией. В двух остальных группах преобладает маловыраженный, не активный или малоактивный гастрит без атрофии.

Таким образом, полученные данные подтверждают инфицирование человека штаммами H. pylori, обладающими различной патогенностью (вирулентностью). Определение CagA-статуса, по нашему мнению, должно служить дополнительным диагностическим критерием при обследовании инфицированных H. pylori пациентов, а выявление CagA-белка у больного - веским доводом в пользу необходимости проведения ему как обязательной эрадикационной терапии, так и проведения дополнительного исследования на присутствие возбудителя после её проведения.

Диагностический алгоритм

Какой именно метод выбрать для первичной диагностики инфекции, зависит от конкретной клинической ситуации, возможностей лечебного учреждения, состояния пациента. Полученные результаты во многом зависят от соблюдения правил забора биологического материала, условий и сроков его хранения, консервации и транспортировки в лабораторию для каждого конкретного исследования. Даже при соблюдении этих правил, каждый из методов имеет свои пределы диагностических возможностей, которые отражены в их основных рабочих характеристиках. Точность метода определяется его чувствительностью (инфекция диагностируется, когда она есть) чем она выше, тем меньше процент ложноположительных результатов и специфичностью (инфекция не диагностируется, когда ее нет) чем она выше, тем меньше процент ложноотрицательных результатов.

Если имеются показания к проведению диагностической эндоскопии (язвенная болезнь желудка, язвенное кровотечение, геморрагический гастрит, новообразования желудка и др.), то на фоне прицельной биопсия слизистой оболочки из преддверия привратника (из одного участка) и тела (из двух участков - передняя и задняя стенки) желудка - наиболее предпочтительными методами для выявления Helicobacter pylori считаются:

•проведение гистологического исследования - фиксация и окраска препаратов для гистологического исследования обычно занимают несколько дней

•определение уреазной активности (ускоренные уреазные тесты) - оценка результата уреазного теста занимает несколько часов

По особым показаниям могут быть проведены (перечисленные исследования являются трудоемкими, дорогостоящими и пока еще используются редко):

•посев бактериальной культуры

•полимеразная цепная реакция (ПЦР)

•уреазный дыхательный тест

Если диагноз, например язвенная болезнь желудка, был установлен ранее, во время эзофагогастродуоденоскопии, то методом выбора для выявления инфицирования слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori могут быть (данные методы неинвазивны и достаточно точны):

•серологический (иммунологический) тест

•уреазный дыхательный тест

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1.     Лазебник Л.Б. Роль Н. pylori в развитии аллергических заболеваний у больных с поражением желудка и ДПК/Лазебник Л.Б. // Тар. Архив - 2008-№12-с. 63-66.

2.      Мараховский К.Ю. Инновации диагностики эндоскопии желудочно-кишечного тракта / Белявская Г.В., Мараховский К.Ю. // Медицина-2009-№4-с. 30-35.

.        Татаринов П.А. Н. pylori: роль в патологии желудочно-кишечного тракта,методы диагностики,подходы к лечению / Татаринов П.А. // Педиатрия-1998-№2 - с. 92-97.

.        Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Диагностика и лечение хронических болезней органов пищеварения / Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. // Медицина-1990 - с. 384.

.        Григорьев П.Я. Болезни желудка и ДПК ассоциированные с Н.pylori / Григорьев П.Я. // Клиническая медицина-1998-№6 - с. 11-15.

.        Островский И.М. Роль хеликобактериоза в поражении желудка и ДПК/ Островский И.М. // Тер.архив-1998-№2-с. 73-76.

.        Григорьев П.Я. Практические рекомендации по диагностике и лечению патологии желудка и ДПК,ассоциированные с Н.pylori ./ Григорьев П.Я. // Леч.врач-2001-№5-6-с. 4-7.

.        Войтенко Н.А. Диагностика и лечение больных язвенной болезнью желудка и ДПК, ассоциированных с хеликобактерной инфекцией / Войтенко Н.А.//Вестник новых медицинских технологий-2002-№1 - с. 81-82.

.        Григорьев П.Я. Диагностика и лечение язвенной болезни и активного хеликобактерного гастродуоденита./ Григорьев П.Я. // Рос. мед. журнал-1996-№6-с. 56-59.

.        Исаков В.А. Использование непрямого иммуноферментного анализа для определения эрадикации Н.pylori при язвенной болезни. / Исаков В.А. // Рос. журн. гастроэнтерологии-200-№2 - с. 11-14.

.        Лазарев И.А. Современные подходы к выявлению Н.pylori у больных с осложненными формами язвенной болезни желудка и ДПК./ Лазарев И.А. // Рос. мед. вести-2000-№3 - с. 55-59.

.        Лапий Г.А. Структурно-функциональные изменения эпителия желудка при хронической гастродуоденальной патологии, ассоциированной с Н.pylori./ Лапий Г.А. // Бюд. эксп. биол. и мед.-2004-№10-с. 470-474.

.        Мельникова В.А. Н.pylori при желудочно-кишечных заболеваниях и у здоровых лиц/ Мельникова В.А. // Журнал микробиология, эпидемиология, и иммунология-2000-№6 - с.108-122.

.        Сучков С.В. Иммунодиагностика Н.pylori гастроэнтерологической практике/ Сучков С.В. // Мед.консультация-1999-№2 - с. 19.

.        Гончарик И.И. Клиническая гастроэнтерология/ Гончарик И.И.//2002.

16.    Causal role of Helicobacter pylori infection in gastric cancer.

17.    World J Gastroenterol 2006; 12(2): 181-186.

18.    Л.В. Кудрявцева, П.Л. Щербаков, И.О.Иваников, В.М. Говорун Helicobacter pylori - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии- 2004 - Режим доступа: <http://www.lytech.ru/data/file/helicobacter/pdf>.