Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул

Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИФРАКЦИОННЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ, ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА И РАВНОВЕСНых ВЗАИМОДЕЙСТВИй БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

Введение

Процессы, связанные с обменом липидов в организмах, относятся к важнейшим метаболическим процессам. Известно, что различные типы нарушений липидного обмена сопровождаются изменениями фракционного и субфракционного состава сывороточных липопротеинов (ЛП) крови [1-13]. Выявлено участие ЛП в механизмах нарушения липидного обмена, сопровождающих развитие не только атеросклероза, но и целого ряда других патологий (диабет, гепатит, панкреатит и др.). Поэтому для диагностики и профилактики заболеваний людей и животных, а также для оценки эффектов лечений имеется острая необходимость точно и быстро (экспрессно) определять фракционный состав липопротеинов в сыворотках крови. Авторами работ [16-20] была разработана новая методика анализа структуры и фракционного состава ЛП на основе дифракционного метода МУРР. Методика не требует применения дорогостоящих реактивов и позволяет относительно быстро определять фракционный состав ЛП в прямой шкале размеров (радиусов) ЛП частиц и в абсолютных единицах концентраций (мг/дл). В работах [3, 4, 21] было показано, что кровь здоровых людей также содержит до 40% так называемых модифицированных липопротеинов. В связи с этим для диагностики дислипопротеинемий (ДЛП) необходимо измерять концентрации не только общих, но и модифицированных липопротеинов, причем во всех основных фракциях и подфракциях липопротеинов.

Для препаративного выделения модифицированных ЛП из сывороток крови используют полиэтиленгликоли (ПЭГ). Известно, что растворы полиэтиленгликолей способны осаждать из сывороток крови агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы [1-6]. При различных концентрациях ПЭГ происходит преципитация различающихся по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Так, например, низкие концентрации ПЭГ (< 3%) осаждают комплексы крупных размеров, высокие концентрации (> 6%) вызывают преципитацию и низкомолекулярных соединений, а 3,5% ПЭГ осаждают наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров.

Дифракционные методы изучения строения нано-частиц вещества, основанные, в частности, на рентгеновском или световом рассеянии, позволяют проводить всесторонние исследования макромолекул в растворе. При рассеянии под малыми углами можно изучать их общее строение, а под средними и большими - особенности их внутренней структуры [14, 15]. Благодаря этому данные методы получили весьма широкое распространение. Дифракционные методы дают информацию о структуре и взаимном распределении рассеивающих масс (неоднородностей электронной или оптической плотности) - информацию, которую невозможно получить другими (недифракционными) методами. Эти физические методы анализа позволяют проводить научные исследования внутренней структуры и дисперсного состава веществ и материалов различных типов: коллоидные растворы и гели биополимеров (белки, нуклеиновые кислоты, вирусы, клетки), а также взвеси органических и неорганических частиц. Исследования и анализы дифракционными методами проводятся с использованием специальных приборов - дифрактометров [14, 15].

Метод малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) позволяет непосредственно определять значения структурных параметров частиц размером от единиц до нескольких тысяч ангстрем. В этот диапазон, как известно, попадают все белки, нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды, липопротеиды и другие макромолекулярные комплексы, а также малые и средние вирусы. С использованием метода МУРР могут быть получены такие важные характеристики биополимеров, как молекулярный вес, размеры, объём, форма частиц, дисперсный состав (распределение по размерам) и целый ряд других параметров [14].

Метод светорассеяния (СР) отличается высочайшей чувствительностью, а применение более длинноволнового излучения (по сравнению с МУРР; отличие может составлять тысячи раз) позволяет определять структурно-дисперсные характеристики рассеивающих частиц размером от 40 нм до нескольких микрон и более [15]. Кроме того, существуют и чисто физические отличия в механизмах взаимодействия излучений с веществом анализируемых частиц: рассеяние в МУРР происходит на неоднородностях электронной плотности, а в СР - на неоднородностях оптической плотности, отличающихся показателями преломления. Поэтому эти два дифракционных метода хорошо дополняют друг друга [14, 15].

Целью настоящей дипломной работы является изучение равновесных и неравновесных молекулярных взаимодействий биологических макромолекул (сывороточных белков крови) с полиэтиленгликолями различной молекулярной массы, включающее следующие задачи:

1.       Освоение двух дифракционных методов анализа (МУРР и СР) и новых методик анализа сывороточных белков крови, в частности, липопротеинов (общих и модифицированных).

2.       Исследование эффектов молекулярных взаимодействий белков сывороток крови с различными полиэтиленгликолями в допреципитационных и преципитационных стадиях.

.        Математический и статистический анализ полученных экспериментальных данных.

.        Выбор «оптимального» полиэтиленгликоля (определенной молекулярной массы) и определение его оптимальной концентрации для препаративного выделения и анализа модифицированных липопротеинов.

1. Обзор литературы

.1 Физико-химические свойства полиэтиленгликолей

полиэтиленгликоль липопротеин кровь сывороточный

Полиэтиленгликоли - полимеры окиси этилена, используются в качестве растворителей, эмульгаторов, связывающих элементов, загустителей, структурообразующих компонентов [22]. Их общая химическая формула: НО - [СН₂СН₂О -] n. Как правило, ПЭГ синтезируют с молекулярными массами от 150 до 40000 Да. При молекулярных массах менее 400 Да ПЭГ находятся в жидкой фазе, а при больших - в порошкообразном состоянии. ПЭГ в растворе способен связываться с протеином различными способами, но существуют преобладающие, например, наиболее часто связывание с белком происходит в азот-содержащих местах или в областях структуры белков, содержащих имидазольную группу гистидина. Кроме того, химические связи ПЭГ с лизином и аргинином, например, препятствуют расщеплению модифицированных молекул трипсином. Одно из важнейших свойств ПЭГ - их высокая гидрофильность [22]. Высокое содержание атомов водорода в молекуле ПЭГ создает водородные связи с молекулами воды, что влечет за собой образование «водного облака» вокруг комплексов «ПЭГ - белок». За счет этого значительно повышается их гидродинамический радиус.

1.2 Сывороточные белки крови, их классификация и функции

Сыворотки крови состоят из сложной смеси белков с разной структурой и функциями [5]. Разделение на фракции белков методом электрофореза (ЭФ) основано на различной подвижности белков в разделяющей среде под действием электрического поля. Обычно методом ЭФ выделяют 5-6 основных стандартных фракций сывороточных белков: альбумины и 4-5 типов глобулинов (альфа-1 (2), бета-1 (2), и гамма-глобулины.

Фракция альфа-глобулинов включает в себя острофазные белки: альфа1-антитрипсин - ингибитор многих протеолитических ферментов - трипсина, химотрипсина, плазмина. Они обладают широким спектром защитных функций. К альфа-глобулинам также относятся транспортные белки (тироксинсвязывающий глобулин, транкортин, альфа - липопротеины). Их функции: связывание и транспорт кортизола, тироксина и обратный транспорт липидов, соответственно.

Фракция бета-глобулинов содержит трансферрин (белок-переносчик железа), гемопексин (связывает гем, что предотвращает его выведение почками и потерю железа), компоненты комплемента (участвующие в реакциях иммунитета), бета-липопротеины (участвуют в прямом транспорте холестерина и фосфолипидов) и часть иммуноглобулинов.

Фракция гамма-глобулинов состоит из иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, IgE. Функционально эти макромолекулы представляющих собой антитела, обеспечивающие гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ. Гамма-глобулины используются в качестве препаратов для профилактики и лечения, главным образом, инфекционных заболеваний. Препараты из них называют также иммуноглобулинами. Гамма-глобулины оказывают губительное действие на вирусы, бактерии, спирохеты и простейшие. Этим определяется их важная роль в предупреждении и лечении ряда инфекционных заболеваний. При введении гамма-глобулинов искусственно создается состояние так называемого пассивного иммунитета. Обычно их получают из крови людей, переболевших определенным заболеванием, или из крови животных, которым специально вводили соответствующие вакцины. Как правило, гамма-глобулины образуются (синтезируются) на второй неделе после начала иммунизации или болезни.

При многих заболеваниях встречается нарушение «нормального» соотношения концентраций фракций белков плазмы крови (диспротеинемии). Диспротеинемии при наблюдении в динамике могут характеризовать стадию заболевания, его длительность, а также эффективность проводимых лечебных мероприятий.

1.3 Общие и модифицированные ЛП

Известно, что поступление и вывод из организма липидов осуществляется с участием липопротеинов (ЛП) крови - сложных белков, транспортирующих липиды к органам тела и от них в печень [4-6]. В настоящее время огромен интерес к изучению структуры и функции ЛП крови, а также к их роли в развитии ряда патологических состояний (дислипопротеинемий (ДЛП)), таких, как инфаркты, инсульты, артериальная гипертензия, диабет и многих других. Сегодня ЛП привлекают внимание ученых и медиков-практиков и как транспортная форма, которая осуществляет перенос не только липидов, но и витаминов, гормонов, различных ксенобиотиков [1-6].

Липопротеины - это очень гетерогенный класс соединений [4-6]. Различают 4 основных фракции ЛП крови, отличающиеся друг от друга соотношением белкового и липидных компонентов, средней плотностью и размером частиц: хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой (ЛПОНП), низкой (ЛПНП) и высокой плотности (ЛПВП). Сывороточные липопротеины крови представляют собой компактные мицеллообразные структуры - комплексы с гидрофобным ядром из триглицеридов (ТГ) и этирифицированного холестерина (ЭХС) и с гидрофильной оболочкой из аполипопротеинов (апол-белки), фосфолипидов (ФЛ) и свободного (неэтирифицированного) холестерина (НЭХС) [4, 20]. Причем гидрофильная оболочка у ЛП всех классов имеет практически одинаковую толщину, близкую к 22 А, а размеры гидрофобного ядра варьируют в широких пределах [16-20]. Также известно, что липопротеины крови имеют строение, сходное с жидкими кристаллами, но при этом образующие их компоненты (БК, ТГ, ФЛ, ЭХС и НЭХС) связаны друг с другом нековалентно [6].

Модифицированные ЛП образуются в организме из нормально синтезированных и секретированных в кровь ЛП. Причиной модификации обычно является появление свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также некоторых метаболитов [3, 4]. Таким образом, к модифицорованным in vivo ЛП относятся перекисно-модифицированные и гликозилированные ЛП, аутоиммунные комплексы ЛП-антитело и агрегированные ЛП.

В настоящее время для анализа ЛП крови и диагностики нарушений липидного обмена применяют ряд физических и химических методов (ультрацентрифугирование, ЭФ и др.) [6]. В работах [16-20] был предложен новый подход к анализу фракционно-компонентного состава сывороточных ЛП крови с использованием метода МУРР. Кроме того, авторами была предложена единая математическая модель строения частиц сывороточных ЛП крови человека. Полученные в данных работах [19, 20] результаты свидетельствуют об эффективности применения метода МУРР для определения фракционно-компонентного состава общих и модифицированных ЛП непосредственно в цельных плазмах или сыворотках крови. Новая методика анализа ЛП в сыворотках крови отличается экспрессностью (0.5 ч на анализ), простотой подготовки образцов для анализов, использованием всего одного вспомогательного реактива (вещества-контрастера типа сахарозы), высокой точностью и разрешением вплоть до отдельных субфракций.

Аутоиммунные комплексы липопротеид-антитело

О наличии циркулирующих в крови иммунных комплексов, содержащих ЛП в качестве антигена, известно давно, однако долгое время оставалось неясным, имеют ли эти комплексы какое-либо отношение к атеросклерозу [3]. Образование циркулирующих в крови иммунных комплексов (ЦИК) «модифицированный ЛП - антитело» можно рассматривать как проявление защитной реакции организма, направленной на быстрое удаление из кровотока модифицированных (т.е. ставших чужеродными) ЛП. Это происходит путем активного захвата иммунных комплексов купферовскими клетками печени [3, 4].

Перекисно-модифицированные ЛП

Из всех классов ЛП перекисное окисление липидов (ПОЛ) затрагивает в первую очередь именно ЛПНП [3, 4]. Легкая подверженность ЛПНП пероксидации, очевидно, объясняется особенностями их липидного состава. Основными антиоксидантами этих ЛП являются: α-токоферол, γ-токоферол, β-каротин и убихонон-10. ПОЛ в частицах ЛПНП - сложный многоступенчатый и еще не до конца выясненный процесс. Постоянно возникающие в живом организме свободные радикалы O₂^-, HO₂^* и НО^* генерируют образование гидроперекисей ненасыщенных ЖК, входящих в состав ФЛ, ТГ и ЭХС липопротеидов низкой плотности. В окисленных ЛПНП обнаружены в повышенных количествах 7-кето-холестерин, 7α- и 7 β-гидроксихолестерины. Перекисной модификации подвергаются также подфракции ЛПОНП, что, несомненно, повышает их атерогенность [4].

Отдельно следует сказать о перекисной модификации фракции ЛПВП. В опытах in vitro изолированные ЛПВП также подвергаются окислению, причем при равных концентрациях холестерина в пробе степень окисления ЛПВП и ЛПНП оказалась практически одинаковой. В частицах ЛПВП окислению подвергаются ненасыщенные ЖК фосфолипидов и эфиров холестерина, а также стероидное ядро и боковая цепь ХС. Кроме того, образование продуктов ПОЛ часто ведет к повреждению апобелков ЛПВП. В первую очередь повреждаются остатки триптофана, а затем уже тирозина и лизина. Это ведет к изменению функциональных свойств ЛПВП и, прежде всего, к ослаблению холестерин-акцепторной функции.

Гликозилированно-модифицированные ЛП

Гликозилирование - весьма распространенный тип модификации белков, в ходе которой происходит неферментативное ковалентное присоединение моносахаридов (преимущественно глюкозы) к аминогруппам белков [5]. Гликозилированию подвергаются все классы ЛП, но по объему наибольшая доля падает на ЛПНП и ЛПВП. Гликозилирование ЛП имеет место и в норме, но особенно активно оно протекает у лиц с повышенным уровнем глюкозы в крови, в частности у диабетиков. Так, если в норме у человека гликозилировано 1,3-2% лизиновых остатков ЛПНП, то у диабетиков эта величина возрастает в 2-3 раза.

Следует особо отметить еще один важный фактор: в ответ на появление в крови гликозилированных ЛП может развиться аутоиммунный ответ с образованием антител на эти ЛП. Было показано [6], что если кроличьи ЛПНП подвергнуть гликозилированию in vitro (блокирование глюкозой 12% e-аминогрупп) и затем вернуть их тому же кролику внутривенно, то в ответ на введение аутологичных гликозилированных ЛПНП образуются антитела.

1.4 Методы рентгеновской и оптической дифракции

Рассеяние плоской волны веществом

Пусть плоская монохроматическая волна A₀exp(ik₀r) падает на рассеивающий центр О, который под действием излучения становится источником сферической волны (рис. 1). Тогда в точке наблюдения L, результирующая волна имеет вид [14].

                          (2.1)

Здесь k₀ и k - волновые векторы падающей и рассеянной волн, |k₀| = |k|= 2π/λ, λ - длина волны, А₀ и А₀b/|r| - амплитуды этих волн, r - вектор, соединяющий точку L с рассеивающим центром в точке О. Амплитуда рассеянной сферической волны равна произведению амплитуды падающей волны и коэффициента b/|r|, где значение b определяется видом падающего излучения и природой рассеивающего центра, находящегося в точке О. Чем сильнее взаимодействие падающей волны с центром О, тем больше коэффициент b. Он имеет размерность длины и носит название длины рассеяния, или амплитуды рассеяния точечного центра. Рассеяние плоской монохроматической волны на реальных объектах, состоящих из совокупности ядер и электронов, можно рассматривать как точечные рассеивающие центры.

Рис. 1. Рассеяние плоской волны точечным центром (а) и ограниченной областью, задаваемой потенциалом φ(r') (б)

Рассеивающую способность произвольного скопления ядер, электронов при облучении их рентгеновскими лучами или светом можно характеризовать рассеивающей плотностью φ(r) - скалярным полем, заданным в ограниченной области пространства. Для рентгеновского рассеяния φ(r) - плотность распределения заряда, в случае света - это оптическая плотность вещества, зависящая от показателя преломления. Взаимодействие волны (рентгеновского излучения или света) с веществом можно представить себе таким образом, что волна электромагнитного излучения взаимодействует со всеми ядрами, электронами и валентными оболочками, которые становятся источниками сферических волн. Суперпозиция этих волн представляет собой первое приближение к реальному рассеянию. Можно показать, что функция

                            (2.2)

является амплитудой упругого рассеяния на скалярном поле φ(r). Это - так называемое первое борновское приближение, иными словами - приближение однократного рассеяния.

Выражение (2.2) представляет собой интеграл Фурье, т.е. разложение функции f(h) по базисной системе ортогональных функций - экспоненциальных функций exp(ihr). Решение обратной задачи - нахождения φ(r) при известной функции f(h) - дается обратным преобразованием [14]

                (2.3)

Таким образом, преобразования Фурье лежат в основе расчетов амплитуд рассеяния по заданной системе рассеивающих центров и плотности поля рассеяния по заданной амплитуде рассеяния, если, разумеется, выполнены условия первого борновского приближения. При определении атомной и молекулярной структуры вещества стараются всегда так поставить эксперимент, чтобы это приближение (и тем самым взаимные интегральные фурье-преобразования (2.2) и (2.3) для амплитуды и плотности рассеяния) выполнялось. Экспериментально определяется не сама амплитуда рассеяния, а интенсивность I(h), пропорциональная квадрату амплитуды рассеяния:

                               (2.4)

Ω - телесный угол). Функция I(s) называется интенсивностью рассеяния (название, принятое в рентгеноструктурном анализе и в светорассеянии). Видно, что размерность этой функции - квадрат длины. Важной характеристикой объекта является полная интенсивность (или полное сечение) рассеяния, которая дается интегрированием (2.4) по всем углам:

                                             (2.5)

Главной задачей структурного анализа вещества является восстановление распределения рассеивающей плотности φ(r) по измеренной функции I(h) [14, 15].

Формула Гинье. Угловое разрешение

С точностью до h⁴ имеем разложение интенсивности I(h) в близи точки h = 0 [14, 15]:

                                    (2.6)

Выражение в скобках в правой части (2.6) можно рассматривать как первые два члена разложения в ряд Маклорена функции ехр(-h²R²_g/3). Поэтому с точностью до членов, пропорциональных h⁴, для начальной части кривой рассеяния можно записать

                                (2.7)

Это - так называемая формула Гинье, выведенная им еще в 1939 г. [14]. Для установления связи параметров I(0) и R_g со строением частицы подставим разложение:

sin(hr)/hr = 1 - h²r²/6 + h⁴r⁴/120 - h⁶r⁶/5040 +…

в формулу Дебая [14]:

.

Это - известное выражение для радиуса инерции частицы относительно ее центра массы.

Таким образом, начальная часть кривой рассеяния вне зависимости от конкретного строения частицы описывается с помощью двух параметров: I(0), который характеризует общее количество рассеивающей материи, и R_g, который несет информацию о ее распределении относительно центра массы частицы [14, 15].

Цель дифракционного эксперимента - это измерение интенсивности рассеяния I(h) при определенных величинах модуля вектора рассеяния h = 4 ∙ π ∙ n ∙ (sin θ)/λ, где n - показатель преломления окружающей частицу среды [14, 15]. Для исследования структуры частиц или вообще каких-либо неоднородностей плотности определенного масштаба нужно иметь возможность вести измерения рассеянного излучения в определенном интервале значений шкалы h, А^-1. Для дисперсных систем с более крупными размерами частиц надо использовать меньшие значения h и наоборот. Поэтому измерения рассеянного излучения необходимо проводить при таких углах рассеяния 2θ, при которых реально используемые длины волн (λ) излучения не могут существенно превышать межплоскостные расстояния: для рентгеновского излучения это 1 ÷ 2 А [14].

Формирование весьма узкого пучка первичного излучения, падающего на образец, достигается коллимационной системой первичного монохроматического пучка (рис. 2).

иc. 2. Схема формирования первичного и рассеянного излучения при малых углах рассеяния в прямом (а) и обратном (б) пространствах: 1 - источник излучения; 2, 3, 4 - круглые отверстия коллиматора; 5 - образец; 6 - плоскость приемника излучения

Система двух круговых диафрагм малого размера, разнесенных на большое расстояние (по сравнению с размером отверстий), позволяет приблизиться к условиям плоской волны. Величина проекции первичного пучка в плоскости приемника, а в сочетании с выбранным расстоянием от образца до детектора и тот наименьший угол 2θ_min (соответственно h_min), начиная с которого ведутся измерения интенсивности рассеянного излучения, и определяют разрешение конкретной коллимационной системы. Таким образом, верхний предел размеров неоднородностей, которые могут быть исследованы на данных установках (дифрактометрах), определяется углом 2θ_min, а нижний предел разрешения всегда соответствует величине 2θ = 180^о [14, 15].

2. Описание экспериментов

.1 Измерение рентгенограмм рассеяния от анализируемых образцов

Измерения малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы Siemens (Германия) методом пошагового сканирования с использованием гониометра и рентгеновского сцинтилляционного детектора [14]. Малоугловые рентгенограммы измеряли в угловом диапазоне: h = 0.013 - 0.22 А^-1, где h = 4 ∙ π ∙ sin(Θ)/λ; 2Θ - угол рассеяния. Для измерения рентгеновского рассеяния использовалась кювета из кварцевого капилляра диаметром 0.65 мм и с толщиной стенок 0.01 мм, установленная в металлическую оправу. Длина волны используемого излучения λ = 1.54 А, температура образцов при измерении рентгенограмм 20^оС. Непосредственное измерение рентгенограмм МУРР проведено в.н.с. ГНЦ ВБ «Вектор» Тузиковым Ф.В., имеющим соответствующие допуски работы с рентгеновским оборудованием. В рентгенограммы вносились поправки на фоновое рассеяние, поглощение, коллимацию, проводилось сглаживание. Первичная математическая обработка экспериментальных данных МУРР и вычисление функций распределения сферических частиц по размерам выполнялись на ЭВМ PC по алгоритмам, описанным в [14], а также с использованием процедур оптимизации.

На рис. 3 приведена общая схема дифрактометров, в частности, малоуглового дифрактометра.

Рис. 3. Общая схема дифрактометров. 1 - источник излучения (рентгеновская трубка, лазерный источник) с коллиматором; 2 - анализируемый образец; 3 - падающий пучок излучения; 4 - рассеянное рентгеновское или световое излучение, вызванное образцом 2; 5 - приемная щель; 6 - рентгеновский или световой детектор (приёмник рассеянного излучения)

Чтобы исключить рассеяние рентгеновских лучей другими (кроме ЛП) белками крови, в анализируемые образцы плазмы предварительно вводили нейтральное (для структуры биополимеров) рентгеноконтрастное вещество - NaNO₃, создавая плотность, равную средней плотности гидратированных белков. Плотность растворителей в образцах обеспечивали с помощью формулы [16-20]: m = V ∙ (ρ₀ - ρ_с) ∙ ρ_к/(ρ_к - ρ₀), где V, ρ₀ - объем и требуемая конечная плотность растворителя в образце (в сыворотке, плазме и контрольном буфере); ρ_с - исходная плотность жидкого образца; m, ρ_к - масса и плотность используемого сухого вещества-контрастера. Плотность растворителей контролировали пикнометрически. В сыворотках крови учитывали их разбавление за счет объема вещества сухого контрастера и вводили соответствующие поправки на концентрацию.

2.2 Измерение индикатрисс светорассеяния

Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатриссы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2Θ = 33,75 ÷ 67,5⁰ (h = 0.0011 ÷ 0.0022 А^-1), где h = 4 ∙ π ∙ n · sin(Θ)/λ; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения λ = 4300 А, температура образцов при измерении индикатрисс 20⁰С. В индикатриссы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом.

Калибровку прибора проводили для контроля влияния факторов, влияющих на точность измерений эффектов светорассеяния (состояние чистоты кюветы, аппаратные искажения и помехи). Для этого регулярно измерялись индикатриссы рассеяния (зависимости интенсивности рассеяния от угла) для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). Известно, что радиус инерции (Rg) и радиус (R) для однородной сферы связаны, как [14].

Для всех полученных в работе экспериментальных данных был проведен математический и статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических (результаты считали достоверными при Р < 0,05).

2.3 Титрование сывороток крови полиэтиленгликолями

Для титрования и анализа модифицированных ЛП методом МУРР предварительно в сыворотки и плазмы крови добавляли растворы ПЭГ до необходимой концентрации, после чего эти смеси инкубировали при 8^оС в течение 18 ч [1, 2]. Осадки отделяли центрифугированием (центрифуга Т-51, Германия) при 6000 об/мин в течение 30 мин. Для растворения осажденных иммунных комплексов к осадку добавляли физиологический раствор (pH 7,4) в объеме исходной сыворотки [3]. Окончательную диссоциацию иммунных комплексов, включающих и модифицированные ЛП, проводили путем добавления сухого NaNO₃, используемого в качестве контрастера.

При титровании сывороток крови ПЭГ методом светорассеяния пластмассовую или стеклянную цилиндрическую кювету заполняли буферной смесью (физиологический раствор, 750 мкл, pH 7,4). Далее добавляли 100 мкл сыворотки и тщательно перемешивали, после чего производили титрование растворами ПЭГ по 5 или 10 мкл вплоть до достижения запланированных конечных концентраций. При каждой концентрации ПЭГ производили измерение интенсивностей рассеянного света (по четырем точкам углов рассеяния). Из полученных данных с использованием специальной программы вычислялись средние значения радиусов инерции (Rg) образованных комплексов «ПЭГ - белки», а также значения интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) [14, 15].

3. Результаты

.1 Экспериментальные данные по светорассеянию

На рис. 4 приведена индикатрисса светорассеяния от стандартного образца в координатах Гинье (ln I(h), h²). Видно, что точки индикатриссы рассеяния хорошо соответствуют линейному графику и высокой монодисперсности частиц латекса. Значение радиуса инерции (Rg = 912 ± 15 А), вычисленное из наклона этого графика оказалось близко к ожидаемому (Rg = 906 А) для данного стандартного образца (частицы стандартизованного латекса - однородные сферы).

Для изучения особенностей взаимодействия различных ПЭГ с белками сывороток крови нами были выбраны ПЭГ с молекулярными массами от 1000 до 20000 Да. Были приготовлены растворы ПЭГ в физрастворе с максимальными концентрациями (с учетом их растворимости). Для удобства экспериментов необходимо было привести все ПЭГ к одной объемной концентрации. Для этого измеряли индикатриссы светорассеяния от каждого из приготовленных исходных растворов ПЭГ. Как и следовало ожидать, для частиц в растворе с молекулярными массами от 1 до 20 кДа индикатриссы светорассеяния практически не отличались от констант (из-за соотношения длины волны света (4300 А) и размера молекул ПЭГ (20-100 А)). Поскольку известно, что , где С, М - концентрация и средняя молекулярная масса рассеивающих частиц, соответственно, то это позволяет определять необходимые коэффициенты разведения [15]. На рис. 5 приведены графические зависимости экспериментальных интенсивностей светорассеяния в нулевой угол (I(0)) до и после приведения их к одной концентрации.

Рис. 4. График Гинье для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). .

Рис. 5. Зависимость интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) для различных ПЭГ в исходном (черные точки) и приведенном состоянии концентраций (светлые кружочки).

(кроме ПЭГ-20000, у которого предельная концентрация разведения оказалась существенно ниже, чем у других ПЭГ). Таким образом, все концентрации используемых ПЭГ были приведены к концентрации 250 мг/мл, что соответствует примерно 25% объемной и весовой концентрации.

Таблица 1. Результаты титрования объединенной сыворотки ПЭГ-6000. Объем исходного буфера V = 750 мкл (метод светорассеяния)

Рис. 6. Графики Гинье для объединенной сыворотки, титруемой ПЭГ-6000 (метод светорассеяния). Нижние графики соответствуют меньшим концентрациям ПЭГ-6000, а верхние - большим, соответственно

Рис. 7. Значения интенсивностей светорассеяния (I(0)) от комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с различными ПЭГ

Рис. 8. Средние значения радиусов инерции (Rg) комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с ПЭГ-4000, ПЭГ-6000 и ПЭГ-8000

Рис. 9. Значения параметра 10¹⁴*I(0)/Rg⁶, пропорционального среднему физическому титру комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с ПЭГ различной молекулярной массы

На рис. 7-8 приведены сводные графики изменения средних значений параметров I(0) и Rg при титровании объединенной сыворотки (разведение в буфере 1:16) различными ПЭГ.

Для получения дополнительной информации о молекулярных механизмах взаимодействия ПЭГ с сывороточными белками на рис. 9 приведены графики рассчитанных значений параметра 10¹⁴*I(0)/Rg⁶, пропорционального среднему значению физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сыворотки крови с ПЭГ.

3.2 Анализ общих и модифицированных ЛП методом МУРР

Далее были исследованы реакции взаимодействия сывороточных белков с различными ПЭГ при концентрациях, при которых достигается эффект осаждения. Этот эффект и будет использоваться нами далее для препаративного отделения модифицированных ЛП от общих.

Для анализа общих и модифицированных ЛП методом МУРР также использовали объединенную сыворотку от 11-ти пациентов с нормолипемией. Подготовку образцов к измерениям, измерения рентгенограмм МУРР и математическую обработку данных проводили, как описано в работах [16-21]. В табл. 2 приведены результаты анализа по определению концентраций фракций и подфракций общих сывороточных ЛП в объединенной сыворотке крови. Из сравнения со статистическими данными нормолипемии

Рис. 10. Зависимость концентраций основных фракций модифицированных ЛП в преципитатах объединенной сыворотки (n = 11) от концентрации ПЭГ-6000

Таблица 2. Результаты анализа по определению спектра общих сывороточных ЛП в объединенной сыворотке крови пациентов с нормолипемией (n = 11). Средний возраст пациентов 38 лет

Примечание: ЛПВП₃, ЛПВП₂ - подфракции ЛП высокой плотности (ЛПВП); ЛПНП_1-3, ЛППП - подфракции ЛП низкой плотности (ЛПНП); ЛПОНП_3-5, ЛПОНП_1-2 - подфракции ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП).

Таблица 3. Сравнительные данные о концентрациях фракций модифицированных ЛП в объединенной сыворотке после преципитации с различными ПЭГами. Анализ методом МУРР

Видно, что полученные результаты действительно близки к нормальным значениям концентраций ЛП.

В табл. 3 и на рис. 10 приведены конечные результаты титрования методом МУРР цельной объединенной сыворотки крови различными ПЭГ при концентрациях, при которых термодинамическое равновесие смещается в сторону образующихся комплексов и происходит их осаждение (преципитация).

Было важно определить диапазоны концентраций ПЭГ, при которых происходит полная преципитация всех основных фракций модифицированных ЛП.

4.     
Обсуждение результатов

Как видно из рис. 7-8, значения параметров I(0) и размеров (Rg) образующихся комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сначала почти линейно увеличиваются при повышении концентрации ПЭГ до 10 мг/мл (1%), а затем рост размеров комплексов замедляется и почти полностью прекращается, а значения I(0), наоборот, начинает резко возрастать. Также следует отметить, что полученные в экспериментах кривые титрования объединенной сыворотки различными ПЭГ заметно отличаются между собой.

Для получения информации о молекулярных механизмах взаимодействия ПЭГ с сывороточными белками использовали экспериментальные данные СР, приведенные на рис. 7-8, и рассчитанные из них значения параметра 10¹⁴*I(0)/Rg⁶, пропорционального среднему значению физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сыворотки крови с ПЭГ (см. рис. 9). Действительно, поскольку I(0) ~ n · M² ~ n · V², где M и V - средние молекулярные массы и объемы образующихся комплексов, то отношение I(0)/Rg⁶ с точностью до калибровочного коэффициента характеризует значение физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях. Из рис. 9 видно, что после первых же порций ПЭГ в смесях титр резко падает (это связано с образованием более крупных комплексов из отдельных сывороточных белков и аутоиммунных комплексов). Далее процесс падения замедляется, а при концентрациях 10 мг/мл и выше начинается резкое увеличение титра комплексов но, как видно из рис. 10, размер комплексов при этом остается почти неизменным. Следует отметить, что в отличие от графиков рис. 7 и 8, графики физического титра комплексов «ПЭГ-белки» на рис. 9 почти совпадают между собой. Поскольку представленные на рис. 7-9 экспериментальные данные соответствуют допреципитационным (равновесным) стадиям взаимодействия сыворочных белков с ПЭГ, то все они свидетельствуют о сходстве их молекулярных механизмов взаимодействия.

Как видно из рис. 10, при концентрациях ПЭГ-6000 в диапазоне 6 ÷ 8% (60 ÷ 80 мг/мл) происходит полная преципитация фракций модифицированных ЛП в нативной объединенной сыворотке крови и при дальнейшем увеличении концентрации ПЭГ-6000 эффект преципитации остается неизменным. А вот для других ПЭГ, а именно, ПЭГ-1000, 4000 и 8000 преципитация фракций модифицированных ЛП происходит при значительно более высоких концентрациях соответствующих ПЭГ и при том не полная (см. табл. 3). Для ПЭГ-20000 эксперименты с применением методов СР и МУРР вообще не удалось провести из-за сильной агрегации этого ПЭГ с сывороточными белками уже при самых малых концентрациях ПЭГ, в результате чего также резко повышается вязкость растворов. Поэтому применение именно ПЭГ-6000 для целей препаративного выделения и анализа модифицированных ЛП вполне обосновано [1-3]. Кроме того, подтвердились данные, что концентрация ПЭГ-6000, при которой происходит полное отделение модифицированных ЛП от немодифицированных, равна 6-8% [1, 2].

В табл. 3 приведены значения степени модификации фракций ЛП используемой в работе объединенной сыворотки пациентов с нормолипемией. Степень модификации наименьшей оказалось у фракции ЛПВП (44%), а наибольшей - у ЛПОНП (~100%) и в целом около 68% ЛП оказались «чужеродными» ЛП. Такой результат не соответствует ранее полученным данным [3, 4, 21], где только около 40% ЛП модифицированы у пациентов с нормолипемией. Связано это, по-видимому, с тем, что в данной работе использовали объединенную сыворотку, в которой образовалось много дополнительных комплексов ЦИК «ЛП - антитело», которые также преципитировали с ПЭГ и привели к завышенным значениям степени модификации.

Из полученных в работе результатов видно, что, как и отмечалось в работах [1, 2] при различных концентрациях ПЭГ происходит образование различающихся по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Так, например, низкие концентрации ПЭГ (< 10 мг/мл (1%)) приводят к образованию комплексов крупных размеров, 1-2% ПЭГ осаждают наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров, а более высокие концентрации (> 20 мг/мл) вызывают, по-видимому, преципитацию более низкомолекулярных белковых фракций.

Следует подчеркнуть, что методика детального анализа фракционно-компонентного состава сывороточных ЛП на основе метода МУРР появилась совсем недавно [19, 20]. Поэтому проведение данного исследования является важным этапом дальнейшего развития новых высокоинформативных методов анализа сывороточных ЛП крови, в частности, модифицированных ЛП, для научной и практической медицины.

1.       Успешное изучение основ теории и практики использования двух физических (дифракционных) методов анализа (МУРР и СР) позволило применить эти методы для анализа структуры и фракционного состава биологических макромолекул (суммарных сывороточных белков крови, общих и модифицированных ЛП), а также их комплексов.

2.       В результате исследования эффектов равновесных молекулярных взаимодействий суммарных белков, содержащихся в сыворотках крови, с различными полиэтиленгликолями (ПЭГ-1000, ПЭГ-4000, ПЭГ-6000, ПЭГ-8000, ПЭГ-20000) в допреципитационном диапазоне концентраций полиэтиленгликолей (0 ÷ 1,5%) установлено, что механизмы равновесного комплексообразования ПЭГ-4000, ПЭГ-6000 и ПЭГ-8000 с сывороточными белками очень близки и не зависят от молекулярной массы полиэтиленгликолей.

.        Изучение молекулярных взаимодействий белков сывороток крови с различными полиэтиленгликолями (ПЭГ-1000, ПЭГ-4000, ПЭГ-6000, ПЭГ-8000 и ПЭГ-20000) в преципитационном диапазоне концентраций полиэтиленгликолей 3 ÷ 11% позволило выбрать в качестве оптимального ПЭГ-6000 с концентрацией 6 ÷ 8% для препаративного выделения и анализа модифицированных ЛП.

.        Показано, что полиэтиленгликоли ПЭГ-4000 и ПЭГ-8000, хотя и дают близкие результаты, но не удовлетворяют методическим условиям: требуются высокие концентрации полиэтиленгликолей и происходит неполное отделение модифицированных от общих ЛП. Полиэтиленгликоли с молекулярными массами 1000 и 20000 Д из-за концентрационных и гидродинамических эффектов вообще не могут использоваться для целей препаративного выделения модифицированных ЛП.

Список литературы

1.   Канская Н.В., Карпов Р.С. Способ определения модифицированных липопротеидов крови. А.С. №1720015А1. МКИ G01N 33/92. Приоритет от 25.10.89. Опубл. 15.03.92 г. Бюлл. №10.

2.       Канская Н.В., Карпов Р.С. Способ выявления лиц с фактором риска ишемической болезни сердца. А.С. №1327007, МКИ G01N 33/564, Приоритет от 26.07.85, Опубл. 30.07.87 г., Бюлл. №28.

.        Карпов Р.С., Канская Н.В., Осипов С.Г. Роль иммунной системы в развитии гиперлипопротеидемий. Томск: Изд-во Томского Университета, 1990, 165.

.        Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Руководство для врачей. М., Харьков, Минск: Изд-во «Питер», 1999, 505.

.        Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. М.: Мир, 1993, 1, 225-298.

.        Холодова Ю.Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. Киев: Наукова думка, 1990, 208.

7.       Tardieu A., Mateu L., Sardet C., Weiss B., Luzzati V., Aggerbeck L., Scanu A.M. Structure of human serum lipoproteins in solution. //J. Mol. Biol. 1976. V.101. P.129-153.

.        Laggner P., Muller K.W. The structure of serum lipoproteins as analysed by x-ray small-angle scattering. //Quarterly Rev. of Biophys., 1978. V.11. №3. P.371-425.

.        Mills G.L., Lane P.A., Weech P.K. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. A guidebook to lipoprotein technique. //Elsevier. 1984. V.14. 512p.

.        Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липопротеиды, дислипопротеинемии и атеросклероз. Л: Медицина. 1984. С. 1-168.

11.     Gotto A.M., Pownal H.J., Havel R.J. Plasma lipoproteins. //Methods in Enzimology. 1986. V.128. Part A.P.3-122.

.        Bellamy M.F., Nealis A.S., Aitken J.W., Bruckdorfer K.R., Perkins S.J. Structural changes in oxidised low-density lipoproteins and of the effect of the anti-atherosclerotic drug probucol observed by synchrotron X-ray and neutron solution scattering. //Eur.J. Biochem. 1989. V.183. P.321-329.

.        Shen B., Scanu A.M., Kezdy F.J. Structure of human serum lipoproteins inferred from compositional analysis. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. №3. P.837-841.

14.     Cвергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986, 280 с.

.        Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. М.: Мир, 1984. Т.2. С. 309-429.

.        Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Мистюрин Ю.Н. Способ анализа липопротеидов в плазме крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Патент РФ №2099693, МКИ G01N 33/53, Приоритет от 22.12.93 г., Опубл. 20.12.97 г., Бюлл. №35.

.        Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Панин Л.Е., Никитин Ю.П., Крылова И.Н. Определение фракционного состава липопротеинов крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Биологические мембраны, 1998, 15 (4), 421-433.

.        Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Панин Л.Е., Никитин Ю.П. Новый метод диагностики нарушений липидного обмена. Вестник РАМН, 1998, 3, 42-47.

.        Тузиков Ф.В., Рагино Ю.И., Тузикова Н.А., Иванова М.В., Галимов Р.В., Никитин Ю.П. Определение фракционного и субфракционного составов липопротеинов крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Сравнение с биохимическим методом. // Вопросы медицинской химии. 2002. Т.48. №1. С. 84-93.

20.     Tuzikov F.V., Tuzikova N.A., Galimov R.V., Panin L.E., Nevinsky G.A. General model to describe the structure and dynamic balance between different human serum lipoproteins and its practical application. //Med. Sci. Monit. 2002. V.8 (6). №6. P.79-88.

21.     Сизиков А.Э., Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Галимов Р.В., Коненкова Л.П., Зонова Е.В., Королев М.А., Герцог О.А., Козлов В.А. Особенности нарушений липидного обмена у больных ревматоидным артритом. // Ревматология. 2004. (в печати).

.        http://www.invitro.ru/protein-fractions.htm «Белковые фракции».