Технология получения искусственных семян

Технология получения искусственных семян

КУРСОВАЯ РАБОТА

На тему: Технология получения искусственных семян

СОДЕРЖАНИЕ

ОПРЕДЕНИЕ

СОКРАЩЕНИЕ И ОБОЗНАЧЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

.1 История развития проблем и методов получения искусственных семян

.2 Подходы к созданию «искусственных семян»

.3 Современный метод получения искусственных семян - способ получения "искусственных семян" из культуры корня шлемника байкальского

.3.1 Область применения.

1.3.2 Уровень техники

1.3.3 Задача. Решение задачи

.3.4 Сущность изобретения.

1.3.5 Результаты изобретения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящей курсовой работе используются следующие определения:

In vitro (с латинского - «в стекле») - это технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» - вне живого организма

Меристема - образовательная ткань, ткань растений, долго сохраняющая способность к делению и образованию новых клеток

Культивирование - процесс наращивания биомассы с целью получения конечного продукта

Культура - видимая глазом совокупность бактерий на питательных средах. Культуры могут быть чистыми (совокупность бактерий одного вида) и смешанными (совокупность бактерий двух или более видов).

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

В настоящей курсовой работе используются следующиесокращения и обозначения:

% - процентное содержание

г - грамм

°С - температура по шкале Цельсия

мг/л - миллиграмм на литр

мм - миллиметр

об/мин - оборотов в минуту

ИС - искусственные семена

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время интенсивно развиваются технологии получения искусственных семян из размножаемых in vitro растений. Данная технология позволяет получать большое количество однородного растительного меристемного материала, обладающего способностью к формированию целого растения. Искусственные семена могут служить способом сохранения генетического материала редких видов растений, тем самым способствуя сохранению биоразнообразия. Кроме того, они являются удобной формой обмена стерильным растительным материалом в исследовательских целях.

Технология искусственных семян перспективна для размножения сельскохозяйственных культур. Размножение некоторых видов культур не принесло успехов вследствие гетерозиготности семян, их мелкого размера, наличия недоразвитого эндосперма, требования семян в микоризных грибах для прорастания (например, орхидеи), а также в случае некоторых бессемянных сортов культур, таких как виноград, арбуз и др. Некоторые из этих видов могут размножаться вегетативными способами, однако технология вегетативного in vivo размножения является трудоемкой и дорогостоящей. Разработка технологии получения искусственных семян рассматривается как эффективный альтернативный метод размножения некоторых важных сельскохозяйственных культур, а также элитных видов растений с высокой коммерческой ценностью.

Термин "искусственное семя" часто определяется как аналог ботанического семени, состоящего из соматического эмбриона, окруженного искусственной семенной оболочкой. Это определение основано на схожести соматического эмбриона с зиготным в морфологическом, физиологическом и биохимическом отношении. Redenbaugh et al. отмечают, что соматический эмбрион, заключенный в искусственную семенную оболочку, наиболее эквивалентен незрелому зиготному эмбриону. У многих видов растений в незрелом эмбрионе на этой стадии все еще присутствует эндосперм, ткань эндосперма разрушается, когда зиготный эмбрион достигает стадии полной зрелости. Следовательно, соматический эмбрион должен быть окружен не только искусственной семенной оболочкой, но также и искусственным эндоспермом для того, чтобы быть определенным как аналог ботаническому семени, состоящему из соматического эмбриона [1].

Цель курсовой работы: Изучение способов получения большого количество однородного растительного меристемного материала, обладающего способностью к формированию целого растения

Задачи курсовой работы: Охарактеризовать условия при созданий «искусственных семян», Выяснить проблемы и методы получения искусственных семян, Охарактеризовать ряд преимуществ искусственных семян перед натуральными.

искусственный семя шлемник натуральный

І. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1.1    История развития проблем и методов получения искусственных семян

Многие распространенные сельскохозяйственные культуры не давали или почти не давали семян. Продуктивные и устойчивые сорта, отобранные селекционерами, зачастую обладали тем же недостатком и потому не находят широкого применения в сельскохозяйственном производстве. Виды растений, полученные методами генной инженерии, нередко имели нарушенное воспроизводство семян, а порою и просто стерильны. Вместе с тем известен принцип вегетативного (без оплодотворения) воспроизводства растений; его широко используют для разведения земляники, роз и другх культур. Известно также что любое растение имеет ткани и органы, содержащие клетки с повышенной склонностью к регенерации, из которых при определенных условиях можно вырастить новое растение - копию исходного. Это свойство растительных клеток, очевидно, и натолкнуло ботаников на мысль о создании искусственных семян. Работу в этом направлении ведут сегодня многие лаборатории многих стран мира. Есть и первые результаты.

Специалистам университета, расположенного в местечке д'Орсей под Парижем, удалось получить искусственные семена люцерны, пшеницы, риса, моркови и камелии. По внешнему виду они правда сильно отличаются от натуральных и похожи скорее на лягушачью икру: такая же неоднородная желатинообразная масса. Однако, если их высадить в землю, они благополучно прорастут и дадут, в конце концов нормальные растения.

Технология получения искусственных семян упрощенно выглядит так. Эксплант, специально выбранный кусочек ткани исходного растения, помещают в ферментер, своего рода в инкубатор, заполненный раствором питательных веществ. Дней через десять бурно размножающиеся клетки образуют сгусток, а потом отделяются друг от друга, но не гибнут. Часть из них продолжают развиваться до образования зародыша.

Полученный таким образом зародыш очень похож на естественный, содержащийся в семени: под микроскопом можно разглядеть и зачатки семядоли, и корешок, и центральную почку. Однако, чтобы не путать с натуральными, искусственные зародыши принято было называть эмбриоидами.

Клейкая смесь питательных веществ - оболочка, в которую помещают сегодня выращенные эмбриоиды, превращая их таким образом в семена, пока еще существенно уступает природной. В первую очередь тем, что в ней зародыши не могут сохранять способность к прорастанию столь же долго, как в натуральной. Экспериментальные образцы искусственных семян, которые получают сегодня, необходимо высаживать в почву и проращивать сразу же - иначе нежные эмбриоиды погибнут.

Вторая трудность - неоднородность получаемых эмбриодов. Для промышленного производства семян требуются одинаковые, стандартные зародыши, достигшие оптимальной стадии развития. Тогда, заключив их в оболочку, можно будет распологать полноценным семенным материалом, не уступающим естественному. А для этого нужна система специальных сит, способная отсеивать слишком маленькие, недоразвитые, либо наоборот, переросшие эмбриоиды.

Кроме того, необходимо распологать ферментерами, позволяющими получать зародыши для будущих семян в промышленных мастшатабах. Эта задача правда, решается проще предыдущих: за основу можно взять лабораторные ферментеры, производство которых налажено во многих европеских странах. Достаточно увеличить их емкость.

Есть на пути создание искусственных семян и другие препятствия, например мутации, приводящие к отклонению части потомства от родительских растении. Однако довольно о трудностях. Уже сейчас очевидны некоторые преимущества искусственных семян перед натуральными.

Во-первых, размножение сельскохозяйственных культур искусственными семенами позволит избежать потери нужных признаков в основной массе потомства, что нередко случается при обычном половом размножении. Достаточно взять у однажды созданного гибрида кусочек ткани - и клетки его станут источником всех будущих растений, которые можно будет размножать соматическим путем практически бесконечно. Это очень существенно при работе с гибридами пшеницы, ячменя, риса, салата, фасоли, гороха и других важных культур, ибо дает возмодность передать их потомству все совйства выбранного гибрида.

Во-вторых, ферментер - отличное место для термотерапии. Этот метод широко применяется в виноградстве для получения здоровых подвоев и в картофелеводстве для оздоровления посадочного материала. Суть его в том, что повышенную температуру клетки переносят гораздо лучше, чем поразившие их вирусы, и поэтому полностью освобождаются от вирусной инфекци. Кроме того, в ферментере очень удобно обрабатывать эмбриоиды специальными вакцинами.

В-третьих, выращивание зародышей из здоровы клеток и создание для них оболочки в стерильной среде гарантирует получение здоровых семян. Поместив в оьолочку микроскопические дозы инсектицидов, гербицидов и фунгицидов, можно будет защитить прорастающий зародыш на самых ранних стадиях развития. Оболочка может также содержать гормоны и удобрения, стимулирующие рост эмбриоидов и способствующие их оптимальному, сбалансированному питанию. Наконец, в оболочку искусственного семени можно поместить симбиотические грибы или бактерии, необходимые для возделывания некоторых культур (например, сои), и таким образом решить проблему азотфиксации.

Отработанная технология производства искусственных семян обеспечит очень быстрое размножение растений и, главное, создаст возможность централизованно снабжать хозяйства семенами стабильного качества. Искусственные семена позволяют избежать потерь, неизбежных при выращивании, уборке и хранении естественных семян, существенно сократить расходы на строительство хранилищ и расширить посевные площади, освободив для этого земли, занятые ныне под семеновдство.

Сегодня искусственные семена получают только в лабораторных условиях. Предстоит еще тщательно проработать каждый этап их промышленного производства : выбрать оптимальную питательную среду для каждого вида или гибрида, найти материал и способ изготовления оболочек, научиться отбирать и стабилизировать выращенные зародыши, сохранять семена до времени посева. Понадобятся сотни, может быть и тысячи опытов, чтобы обоснованно предсказывать как поведут себя искусственные - потенциально сверхстабильные, сверходнородные и сверхзащищенные - семена в реальных условиях и как повлияют на их свойства неблагоприятные факторы окружающей среды [2].

1.2    Подходы к созданию «искусственных семян»

Методы получения in vitro «искусственных семян» из вегетативно размноженного материала в настоящее время могут быть рассмотрены как инновационные биотехнологические способы размножения и хранения ценных сортов и клонов растений. Разработка таких методов связана с необходимостью научных исследований и может привести к созданию коммерческих технологий размножения растений. При создании «искусственных семян» с помощью биореакторов или более традиционных методов размножения растений in vitro используют:

а) технологии размножения растений через получение соматических зародышей или изолированных апексов побегов, а также корней;

б) прием инкапсуляции соматических зародышей и изолированных апикальных верхушек в альгинате кальция;

в) методы дегидратации инкапсулированного растительного материала.

Концепция получения искусственных семян на основе эмбриоидов впервые была выдвинута Т. Мурасиге на Международном симпозиуме по ботанике в 1977 году. Позднее автор высказал идею, что применение специальных капсул с помещенными внутрь соматическими зародышами позволит упростить их перемещение из лаборатории в поле. Однако он не представил детального описания технологии «искусственных семян» (некоторые исследователи называют их «синтетическими», или «соматическими»). С тех пор были проведены многочисленные исследования с целью создания эффективного метода получения жизнеспособных «искусственных семян», которые могли бы быть использованы не только для высадки в грунт размноженного в асептических условиях растительного материала, но и для долговременного его хранения in vitro, необходимого для поддержания генетического разнообразия растений.

Широкомасштабному применению метода «искусственных семян» препятствуют не только технологические трудности, но и недостаток информации о физиологии развития и созревания соматических зародышей растений. Именно с этим связаны две проблемы: проблема низкого уровня выживания соматических зародышей после высадки их в нестерильные условия и проблема сохранения in vitro жизнеспособности соматических зародышей в течение длительного периода времени. В этой связи актуально повышение жизнеспособности инкапсулируемых зародышей, а также создание оболочек с улучшенными свойствами.

Технология создания «искусственных семян» земляники включает: размножение in vitro растений, полученных из апексов, что обеспечивает сортовую чистоту материала земляники, подготовку растительного материала к изолированию апексов, которые впоследствии будут использованы для формирования «искусственных семян» земляники, разработку состава оболочек «искусственных семян» земляники, разработку методов хранения и транспортировки «искусственных семян» земляники, приемы высева в почвенные субстраты, маркетинг и сбыт.

В предварительных экспериментах, проведенных на землянике садовой (Fragaria x ananassa Duch.) сорта Роксана были получены растения, способные прорастать из «искусственных семян» на агаризованной питательной среде и развиваться в полноценные растения, готовые к адаптации к нестерильным условиям.

Как показывает анализ литературных данных, в настоящий момент исследователи работают в направлении изучения возможности хранения «искусственных семян» в обезвоженном состоянии, изучают различные компоненты питательной среды, способные повлиять на длительное хранение «семян» в капсулах, дальнейший рост и жизнеспособность в нестерильных условиях. Комплекс разработанных приемов и методов создания «искусственных семян» позволит упростить этап адаптации к нестерильным условиям и сократить затраты на 15-20%, что приведет к общему снижению себестоимости размноженных растений, упростит хранение ценных сортов и форм земляники и их транспортировку [4].

1.3 Современный метод получения искусственных семян - способ получения "искусственных семян" из культуры корня шлемника байкальского (scutellaria baicalensis georgi)

Корни шлемника байкальского разрезают на сегменты размером 2-3-мм. Полученные сегменты капсулируют в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран. Концентрация клафорана составляет 300-550 мг/л. Способ позволяет получить оздоровленную культуру, не проявляющую признаков бактериальной инфекции в течение полутора лет и имеющую более высокие показатели ростовой активности и содержания основных флавонов, по сравнению с исходной культурой корня. Полученные «искусственные семена» сохраняют жизнеспособность корневых фрагментов при их длительном хранении в условиях низких положительных температур.

1.3.1 Область применения

Изобретение относится к области физиологии растений, биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в промышленном производстве лекарственного сырья корневого происхождения для фармакологической, пищевой и косметологической отраслей.

1.3.2 Уровень техники

Идея создания так называемых «искусственных семян» (ИС) возникла при культивировании соматических эмбрионов растений, которые заключали в искусственный эндосперм и ограничивали искусственной семенной оболочкой.

В настоящее время техника капсулирования растительного материала используется при изготовлении ИС в основном из соматических эмбрионов и надземных частей растений.

Имеется несколько японских работ по инкапсулированию фрагментов pRi Т-ДНК трансформированных корней (называемых также культурой корня) хрена обыкновенного.

Кроме того, проводились исследования возможного применения метода инкапсулирования фрагментов pRi Т-ДНК трансформированных корней для подготовки их к криосохранению на примере культуры корня барвинка малого (Vinca minor).

В вышеуказанных работах решались задачи микроклонального размножения растений и криосохранения растительного материала.

Однако при выращивании культуры корня шлемника байкальского основной задачей является периодическое оздоровление длительно культивируемых корней, элиминирование случайно внесенной или эндогенной бактериальной инфекции и сохранение жизнеспособности корней при длительном хранении в условиях низких положительных температур.

1.3.3 Задача. Решение задачи

Задачей создания нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) является оздоровление культуры корня, элиминирование бактериальной инфекции и сохранение жизнеспособности корней при длительном хранении в условиях низких положительных температур.

Поставленная задача решается использованием нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), заключающемся в сегментировании корней на 2-3 мм фрагменты, их капсулировании в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран в концентрации 300-550 мг/л, с последующим хранением.

1.3.4 Сущность изобретения

Сущность нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского заключается в иммобилизации при низких положительных температурах фрагментов молодых участков корней в гелевых капсулах, содержащих питательные вещества и антибиотик. Локальное действие антибиотика способствует более точному проникновению в клетки корней и элиминированию эндогенной бактериальной инфекции. Питательные вещества гелевого матрикса поддерживают жизнеспособность корневых фрагментов при их хранении в условиях низких положительных температур, а отсутствие в ИС экзогенных регуляторов роста не изменяет морфологию корней и состав их вторичных метаболитов. Таким образом, при воспроизведении культуры корня шлемника байкальского из ИС можно получить оздоровленную, хорошо растущую и продуктивную массу корней.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Искусственные семена получают из культуры корня шлемника байкальского, культивируемой в условиях in vitro, но содержащую случайно внесенную или эндогенную бактериальную инфекцию.

Периферийные участки корней вручную разрезают на фрагменты длиной 2-3 мм, которые затем смешивают с гелеподобным 3,5% раствором Na-альгината, содержащим питательные вещества культуральных сред без добавления гормональных регуляторов роста. В состав гелевого матрикса также входит антибиотик клафоран (cefotaxime) в концентрации 450 мг/л. Для закрепления геля и образования капсул используют 70 мМ раствор CaCl2 - время выдерживания капсул в растворе CaCl2 составляет 8-10 минут, после чего их промывают дистиллированной водой. Для избежания преждевременного прорастания ИС помещают на хранение в стерильные чашки Петри без питательной среды в условия низких положительных температур на 2-6 недель, проводя, таким образом, иммобилизацию корневых фрагментов. Состав питательной среды гелевого матрикса расписано в таблице 3.

Таблица 3. Состав питательной среды гелевого матрикса

При переносе ИС после хранения при пониженных положительных температурах на питательную среду в условия +26°С активизируются корневые меристемы инкапсулированных фрагментов, что на 3-4-й день приводит к прорастанию корней через альгинатную оболочку и образованию хорошо растущей массы ветвящихся корней.

Разный состав питательных веществ гелевого матрикса ИС приводит к различной всхожести ИС после хранения при низких положительных температурах. Корневые фрагменты шлемника байкальского лучше сохраняются в оболочке со средой Гамборга (В-5), чем с другими питательными средами.

Проросшие молодые корневые кончики отделяют и помещают в жидкую питательную среду того же состава и культивируют в условиях качания (90 об/мин) в темноте до образования хорошо растущей массы корней (3-4 недели). Для контроля стерильности полученных таким образом из ИС корневых культур берут пробы культуральной среды на контаминацию. Установлено, что даже после 2-недельной иммобилизации инфицированных корневых фрагментов в оболочке, содержащей антибиотик, ИС дают начало обновленной корневой культуре шлемника байкальского, сохраняющей стерильность в течение последующих пассажей.

Ростовая активность и масса обновленной культуры корня шлемника байкальского, полученной из ИС, в течение одного пассажа почти в 2 раза превышает массу исходной культуры корней того же возраста, а общее содержание основных флавонов в пересчете на 1 г сухой корневой массы становится почти в 3 раза выше. Таким образом, общая продуктивность культуры корня существенно возрастает.

Результаты примера 1 представлены в таблицах 1 и 2.

Пример 2.

Аналогично примеру 1, за исключением уменьшенной концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе - 300 мг/л.

При концентрации антибиотика клафоран ниже 300 мг/л элиминирования бактериальной инфекции не происходит.

Результаты примера 2 представлены в таблицах 1 и 2.

Пример 3.

Аналогично примеру 1, за исключением увеличенной концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе - 550 мг/л.

При концентрациях более высоких, чем 550 мг/л, всхожесть ИС снижается вследствие ингибирования прорастания корневых сегментов, что уменьшает выход оздоровленного растительного материала.

Результаты примера 3 представлены в таблицах 1 и 2.

1.3.5 Результаты изобретения

Как видно из таблицы 1, повышение концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе ИС приводит к снижению всхожести ИС при хранении в условиях низких положительных температур. Понижение же содержания антибиотика ведет к риску недостаточного элиминирования бактериальной инфекции в культуре корня шлемника байкальского.

В таблице 2 приведены основные показатели продуктивности культуры корня шлемника байкальского. Как можно видеть, обновленная культура корня, полученная из ИС, по ростовой активности и массе корней в течение одного пассажа почти в 2 раза превышает массу исходной культуры корня того же возраста, которая была ослаблена внезапно проявившейся бактериальной инфекцией. Кроме того, общее содержание основных флавонов в пересчете на 1 г сухой корневой массы в обновленной культуре корня шлемника байкальского становится почти в 3 раза выше, и соответствует содержанию флавонов в стабильно растущей исходной неинфицированной культуре.

С помощью способа получения ИС из длительно растущей культуры корня шлемника байкальского получена оздоровленная культура, не проявляющая признаков бактериальной инфекции в течение полутора лет и имеющая более высокие показатели ростовой активности и содержания основных флавонов, по сравнению с исходной культурой корня. В ИС сохраняется стерильность и жизнеспособность корневых фрагментов при их длительном хранении в условиях низких положительных температур.

Способ получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), заключающийся в сегментировании корней на 2-3-мм фрагменты, капсулировании их в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран в концентрации 300-550 мг/л, с последующим хранением.[3]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В курсовой работе изучена технология получения большого количества однородного растительного меристемного материала, обладающего способностью к формированию целого растения, рассмотрели технологию получения искусственных семян как эффективный альтернативный метод размножения некоторых важных сельскохозяйственных культур.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1.      Искусственные семена - Хорь Е. И Лох С. (материал из вестника КазНУ)

.        Материалы из журнала «Химия и жизнь»(1987г)

3.      Материалы с сайта: <http://www.findpatent.ru/patent/241/2415928.html>

4.      Материалы из диссертации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук. (Высоцкого В. А., Алексеенко Л. В., Белякова Л. В. )