Идентификация сырьевого состава плодово-ягодной продукции молекулярно-генетическим методом

Идентификация сырьевого состава плодово-ягодной продукции молекулярно-генетическим методом

Оглавление

Введение

. Генетически модифицированная продукция растительного происхождения

.1 Состояние и перспективы развития генетически модифицированных товаров

.2 Преимущества и опасности производства генетически модифицированной продукции растительного происхождения

.3 Правовое регулирование производства и использование генетически модифицированных продуктов

.4 Создание генно-модифицированных растений как основной фактор, формирующий их качество

.5 Экспертиза пищевых продуктов полученных их генетически модифицированных организмов

.6 Методы исследования генетически модифицированных продуктов

.7 Список ГМО, одобренных и запрещенных продуктов в России для использования, в том числе в качестве пищи населением

Выводы

Список литературы

Приложение

Введение

Актуальность исследования. В последние десятилетия на мировом продовольственном рынке произошли коренные изменения, связанные с созданием генетически модифицированных организмов и активным их внедрением в производство. Генная инженерия затронула различные отрасли народного хозяйства: медицину экологию, сельское хозяйство, химическую текстильную, пищевую промышленность, торговлю и другие.

Новые сорта растений завоевывают популярность в среде производителей. Это - пример наиболее быстрого распространения, как новых продуктов, так и новых методов во всей многовековой истории народного хозяйства. модифицированный продукт пища

Основным достоинством, вызвавшим широкое распространение генной инженерии, является возможность быстрого создания растений с необходимыми свойствами. Другими преимуществами производства и использования транс генных растений являются: увеличение пищевой ценности продуктов, возможность их использования в медицине для получения средств профилактики и лечения болезней и прочие.

Общество с настороженностью относится к генетически модифицированным продуктам, что обусловлено недостаточной изученностью их потребительских свойств и безопасности для организма человека в длительной перспективе.

Законодательная база регулирования производства и исследования транс генных продуктов находится в процессе формирования.

В связи с особыми требованиями к качеству генетически модифицированных продуктов, они должны учитываться в производстве и торговле отдельно от традиционных, войти в Общероссийский классификатор продукции в виде отдельных категорий, иметь свои стандартные, торговые и учётные классификации.

На стадии разработки находятся методы идентификации генетически модифицированных продуктов. Отсутствуют товароведные характеристики конкретных генетически модифицированных товаров, поступивших в продажу. Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение и анализ потребительских свойств и безопасности, генетически модифицированных пищевых продуктов растительного происхождения, исследование на основе метода полимеразной цепной реакции амплификации ДНК, позволяющей качественно идентифицировать плодово-ягодное сырье.

Для достижения доставленной цели необходимо решить следующие задачи:

изучить потребительские предпочтения к продуктам переработки плодово-ягодного сырья

исследовать современное состояние и определить основные направления развития рынка генетически модифицированных продуктов.

охарактеризовать основные преимущества и недостатки производства и потребления транс генных пищевых продуктов

дать оценку отечественным и международным законодательным и нормативным документам по регулированию производства и сбыта транс генных продуктов.

-            охарактеризовать получение генетически модифицированной продукции как основной фактор, оказывающий влияние на формирование её потребительских свойств.

-            исследовать влияние технологической обработки плодово- ягодного сырья на эффективность видовой идентификации ПЦР.

1. Генетически модифицированная продукция растительного происхождения

Продовольственная проблема является одной из важнейших проблем человечества. Особенно остро она стоит в развивающихся странах, где происходит стремительный рост населения до 100 млн. человек в год, и очень слабо развито сельское хозяйство. [1]Постоянные поставки гуманитарной помощи со стороны развитых стран и международных организаций являются явно недостаточными для борьбы с голодом. [2]

По прогнозам ЮНЕСКО к 2050 г численность населения в мире приблизится к 10 млрд. человек, что потребует резкого увеличения объёмов производства продуктов питания в других товаров широкого потребления. Не смотря на то, что за последние 40 лет производство сельскохозяйственной продукции выросло более, чем в 2 раза, дальнейший его рост представляется маловероятным.[3] В течение последних 20 лет человечество потеряно свыше 15% плодородного подвесного слоя. Большая часть пригородных к возделыванию земель уже вовлечена в сельскохозяйственное производство.

Каждую неделю население нашей планеты в среднем увеличивается на 12 млн. человек, при этом темпы производства пищевой продукции все более отстают от темпов роста населения. Уже сейчас дефицит пищевых продуктов в мире превышает 60 млн. тонн, а число людей, страдающих от недостаточности питания, выросло на 25 млн. лишь за период с 2002 по 2003, а общая цифра голодающих приближается к 1 млрд. человек. Таким образом, современная стратегия производства пищевых продуктов должна быть направлена на поиск выхода из продовольственного кризиса в кратчайшие сроки.[4] Возникла необходимость в применении принципиально новых подходов к созданию высоко продуктивных агросистем, обеспечивающих значительное повышение урожайности сельскохозяйственных культур и продуктивности скота.

Одним из способов решения поставленных задач является применение новейших способов селекции. Этому способствуют огромные возможности, появившиеся в результате революционных достижений в области генетики и биотехнологии.[5]

1.1 Состояние и перспективы развития генетически модифицированных товаров

Рождение генетической инженерии условно относится к 1922 года, когда в лаборатории Берга впервые была синтезирована рекомбинатная молекула ДНК. Дальнейшим этапами развития генетической инженерии являются 1975-1977 гг., время разработки Ф. Сэнгером, Р. Баррелом, А. Максамом и В. Гилбертом методом быстрого определения нуклеотидной последовательности.[6]

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала о самых первых своих шагов. [7]

ГМО - организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии. Это определение может применяться для растений, животных и микроорганизмов. Генетические изменения, как правило, производятся в научных или хозяйственных целях. Генетическая модификация отличается целенаправленным изменением генотипа организма в отличие от случайного, характерного для естественного и искусственного мутационного процесса.[8]

Основным видом генетической модификации в настоящее время является использование транс генов для создания транс генных организмов.

В сельском хозяйстве и пищевой промышленности под ГМО подразумеваются только организмы, модифицированные внесением в их геном одного или нескольких транс генов.[9]

Специалистами получены научные данные об отсутствии повышенной опасности продуктов из генетически модифицированных организмов как таковых по сравнению с традиционными продуктами.

Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (FAO) рассматривает использование методов генетической инженерии для создания транс генных сортов растений либо других организмов как неотъемлемую часть сельскохозяйственной биотехнологии. Прямой перенос генов, отвечающих за полезные признаки, является естественным развитием работ по селекции животных и растений, расширивших возможности селекционеров управляемости процесса создания новых сортов и расширения его возможностей, в частности, передачи полезных признаков между нескрещивающимися видами.[9]

Использование, как отдельных генов различных видов, так и их комбинаций в создании новых транс генных сортов и линий является частью стратегии FAO по характеризации, сохранению и использованию генетических ресурсов в сельском хозяйстве и пищевой промышленности.

Исследование 2012 года (основанное в том числе на отчетах компаний - производителей семян) использования транс генных сои, кукурузы, хлопка и канолы в 1996-2011 годах показало, что устойчивые к гербицидам культуры оказываются более недорогим в выращивании и в ряде случаев более урожайными. Культуры, содержащие инсектицид давали больший урожай, особенно в развивающихся странах, где использовавшиеся до этого пестициды были малоэффективными.[10]

Также устойчивые к насекомым культуры оказывались более дешевыми в выращивании в развитых странах, по данным метаанализа, проведенного в 2014 г., урожайность ГМО-сельхозкультур за счет снижения потерь от вредителей на 21,6 % выше, чем у не модифицированных, при этом расход пестицидов ниже на 36,9 %, затраты на пестициды снижаются на 39,2 %, а доходы сельхозпроизводителей повышаются на 68.2%.[11] Основные этапы создания ГМО:

1.  Получение изолированного гена.

2.       Введение гена в вектор для переноса в организм.

.         Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

.         Преобразование клеток организма.

5.    Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы. [11]

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза.

В настоящее время не вызывает сомнения, что полноценное питание определяется не только энергетической ценностью пищи, но и обеспеченностью витаминами, пектиновыми веществами, микро- и макроэлементами. [12]

Сбалансированное питание, включающее в себя продукты растительного происхождения с высоким содержанием биологически активных веществ, является важной оставляющей в формировании здорового подрастающего поколения страны.

Свежие плоды и ягоды имеют большое пищевое значение. Они являются источником ряда необходимых организму веществ, прежде всего витаминов, углеводов и минеральных элементов и должны быть в питании человека в течение всего года в широком ассортименте. Так, если калорийность питания обеспечивается за счет богатых белками и жирами продуктов животного происхождения, то источником биологически активных веществ являются плоды и ягоды. [13]

В связи с увеличением объемов потребления населением плодово- ягодных культур, в мире наблюдается тенденция роста их возделывания. Сегодня все большее внимание уделяется малине, землянике, крыжовнику и шиповнику, отличающихся от других культур высоким содержанием важнейших биологически активных веществ. Ведущей культурой мира остается земляника. На ее долю приходится более 2/3 общемирового объема. Лидируют по выращиванию земляники такие страны как США (83 тыс. т), Испания (3 0 тыс. т), Япония (208 тыс. т); Южная Корея (204 тыс. т) и Польша (96 тыс.т) . Россия, по данным FAO, занимает третье место в мире по производству земляники (230 тыс.т).

Россия занимает первое место в мире по производству малины, ее доля составляет четверть мирового рынка (7 тыс. тон). Далее следуют Сербия (93 тыс. т), Польша (тыс. т), Германия (30 тыс. т). Все перечисленные страны, занимаются активно экспортом, данной культурой. [15]

Употребление в пищу плодов и ягод в свежем виде носит сезонный характер. В связи с чем возникает проблема длительного хранения и подбора способов переработки с возможностью максимального сохранения пищевой и биологической ценности исходного сырья в течение всего года. [15]

Сохранение данного природой натурального сырья и произведенных человеком продуктов питания эта одна из основных целей в технологии переработки пищевой промышленности. В настоящее время известно достаточно большое количество способов и методик переработки плодово-ягодного сырья. Эти способы основаны на принципах биоза, анабиоза и абиоза в соответствии с классификацией, предложенной Никитинским Я.Я.

В связи с чем, на рынке наблюдается положительная тенденция в отношении продажи продуктов переработки плодово-ягодного сырья. За последнее время доля продаж данной продукции выросли на 2 %. Большое влияние на его увеличение оказывает расширение ассортимента в рознице. Кроме этого на рынке присутствуют товара импортируемые из стран дальнего и ближнего зарубежья. [16]

1.2 Преимущества и опасности производства генетически модифицированной продукции растительного происхождения

Генетически модифицированные продукты перед выпуском на рынок подробно и тщательно исследуются на предмет безопасности для людей и животных. Растения с ГМО можно выращивать в районах рискованного земледелья при низкой температуре и высокой температуре. В условиях засухи, избытка солнечного излучения. Растения ГМО способствуют снижению расхода пестицидов, поскольку они не повреждаются паразитами.

Генетические модификации позволяют получать высокие урожаи зерновых при плохих почвенных условиях. Продукты с ГМО часто имеют лучшие вкусовые или ароматические качества. Чем традиционная пища. Генетически модифицированная пища дольше остается свежей, что имеет большое значение при ее транспортировке и хранении. Модифицированная генетическая еда имеет усовершенствованный химический состав. благодаря чем некоторые ГМО действуют как лекарства, имея повышенное количество витамина А.почти в двадцать раз.[17]

В настоящий момент независимые ученые уже пришли к выводу, что активное употребление ГМ-продуктов в пищу связано с существенными рисками. Во-первых, введение в пищевую цепочку человека транс генной еды может привести к распространению новых болезнетворных бактерий: при вставке "полезных" генов в определенную цепочку ДНК туда же может попасть и различный технологический "мусор", например ген устойчивости к антибиотикам. В результате широко распространенные лекарственные препараты просто окажутся бессильными против "мутировавших" бактерий. Трансформация живых организмов может сопровождаться непредсказуемыми изменениями и способствовать накоплению в организме человека токсичных веществ.[18]

Именно это произошло в США, где 37 человек погибли, а еще около 1, 5 тысяч остались инвалидами после того, как в качестве пищевой добавки они употребляли триптофан, полученный из транс генных бактерий. Это ГМ-вещество вызвало острое заболевание - эозинофилии-миалгии, сопровождающееся мышечными болями, спазмами дыхательных путей и даже иногда приводящее к смерти. Употребление ГМ-пищи может вызвать и сильную аллергию, так как чужеродные белки, синтезируемые транс генными организмами, являются потенциальными аллергенами. В частности, известно, что ГМ- соя, устойчивая к гербициду раундапу, производимая американской компанией Monsanto, вызывает сильную аллергию.

О небезопасности транс генных культур активно заговорили с конца 1998 года. Сначала британский иммунолог Арманд Пуцтаи (Armand Putztai) в телевизионном интервью объявил, что он обнаружил снижение иммунитета у крыс, которых кормили модифицированным картофелем. Исследование было опубликовано, а тему быстро подхватили журналисты в Европе, а затем и в США и Канаде. Вскоре в авторитетном журнале Nature появилась статья, авторы которой пришли к выводу, что посевы транс генной кукурузы могут угрожать популяциям охраняемого вида бабочек-монархов. Пыльца оказалась токсичной для их гусениц.[19]

Самым ярким примером токсичности ГМО стал случай с японской компанией, которая стала поставлять на рынок пищевую добавка триптофан, полученную из транс генных бактерий, полагая, что он является эквивалентом натуральному аналогу. Аминокислота (полученная с помощью генной инженерии) стала причиной смерти 37 человек, еще около полутора тысяч пострадали.

Большинство сельскохозяйственных ГМ-культур помимо генов, придающим им желаемые свойства, содержат гены устойчивости к антибиотикам в качестве маркеров. Обычные антибиотики, как например ампициллин (используется для лечения инфекций дыхательных путей, синуситов и инфекций мочевыводящих путей) и канамицин (используется для лечения туберкулеза, инфекций верхних и нижних дыхательных путей, при обработке ран) используются при производстве пищи. Существует опасность того, что они могут быть перенесены в болезнетворные микроорганизмы, что может вызвать их устойчивость к антибиотикам. В этом случае традиционные методы лечения воспалительных процессов с помощью антибиотиков будут малоэффективны.[20]

1.3 Правовое регулирование производства и использование генетически модифицированных продуктов

Расширение оборота товаров. содержащих ГМО, вызывает необходимость особого подхода к правовому регулированию соответствующих отношений. учитывающего специфику данных объектов гражданских прав.[21]

Важность научного изучения оборота ГМО в аспекте гражданско- правового регулирования данных отношений объясняется сложившейся необходимостью выработки обоснованных рекомендаций по совершенствованию действующего законодательства направленных на обеспечение интересов всех участников рынка ГМО. Необходимо отметить, что состояние имущественных отношений в сфере оборота ГМО характеризуется наличием нравственно-правового конфликта, сутью которого является имеющееся противоречие между публичным интересом государства в обеспечении продовольственной безопасности и здоровья населения и частными интересами производителей продовольственных товаров, содержащих ГМО.[21] Данное противоречие в настоящее время не урегулировано нормами права, что порождает на практике проблемы, связанные с гражданским оборотом ГМО. В то же время нельзя не принимать во внимание то обстоятельство, что появление генно-инженерных технологий является важнейшим достижением молекулярной биологии и генетики. Разработанный учеными способ получения биологических структур с программируемыми, наиболее нужными человеку признаками, передающимися по наследству, позволяет существенно ускорить процесс создания новых сортов растений с заранее заданными свойствами, которые невозможно получить традиционными селекционными способами. Генная инженерия предоставляет возможность получить новые виды растений, минуя стадию половой репродукции, что позволяет комбинировать гены растений, не обладающих половой совместимостью.[22]

В Российской Федерации также мог бы быть создан Национальный Координационный центр по биобезопасности (агро -) биоразнообразия и контроля за распространением ГМО, который по примеру Координационных центров Казахстана и Беларуси мог бы решать задачи по:

1)                 сбору, анализу, систематизации информации о законодательстве и научных исследованиях по вопросам биобезопасности, полевых испытаниях, ввозе/вывозе, использовании генно-инженерных организмов и продуктов из них в хозяйственной деятельности; [23]

2)       формированию информационного банка данных о генно-инженерных организмах и представлению этой информации заинтересованным органам госуправления, средствам массовой информации, гражданам и общественным объединениям; [23]

)         обмену информацией с Координационными центрами других стран и международными организациями;

5)                 организации проведения научных экспертиз безопасности генно-инженерных организмов совместно с экспертами государственного реестра; [24]

6)       оказанию консультативных услуг в разработке законодательных актов и руководств по биобезопасности, в подготовке предложений по заключению двусторонних и региональных соглашений; [25] целый ряд других задач так или иначе связанных с проблемой распространения и использования ГМО.

Основные положения о биобезопасности определены следующими актами:

Конвенцией о биологическом разнообразии от 5 июня 1992 г. <4>;

<4> Конвенция о биологическом разнообразии от 5 июня 1992 г. // Собрание законодательства Российской Федерации. 1996. N 19. Ст. 2254.[24]

Конвенцией Совета Европы о защите прав человека и человеческого достоинства в связи с применением биологии и медицины: Конвенция о правах человека и биомедицине от 19 ноября 1996 г. <5>;

<5> Конвенция Совета Европы о защите прав человека и человеческого достоинства в связи с применением биологии и медицины: Конвенция о правах человека и биомедицине от 19 ноября 1996 г. N 164 // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).[26]

<6> Всеобщая декларация ЮНЕСКО о биоэтике и правах человека от 19 октября 2005 г. // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).[27]

Однако до настоящего времени положения указанных выше международно-правовых актов в полной мере не имплементированы в систему действующего законодательства Российской Федерации, а Конвенция Совета Европы от 19 ноября 1996 г. не ратифицирована Российской Федерацией.

Представляется, что эффективное правовое регулирование оборота ГМО невозможно без законодательного закрепления положений о биобезопасности, гарантирующих право каждого человека на защиту от потенциально негативного воздействия биотехнологий. Нормы о биобезопасности в современных условиях являются неотъемлемым элементом правового статуса человека. Следовательно, обеспечение безопасности человека от несанкционированного воздействия ГМО является основополагающим принципом в правовом регулировании отношений в данной сфере[27]В Российской Федерации законодательство, регулирующее оборот ГМО, до сих пор находится на стадии формирования. Так, в России действует Федеральный закон от 5 июля 1996 г. N 86-ФЗ "О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности"

<7>. Однако, данный Закон носит рамочный характер и содержит большое количество отсылок к другим нормативным правовым актам, которые до настоящего времени не приняты или не вступили в силу. Например, статья 7 указанного Закона устанавливает, что генно-инженерно-модифицированные организмы, предназначенные для выпуска в окружающую среду, а также продукция, полученная с применением таких организмов или содержащая такие организмы, подлежит государственной регистрации в порядке, установленном Правительством Российской Федерации. Однако до настоящего времени такой порядок не установлен. Правительством РФ принято Постановление от 23 сентября 2013 г. N 839 "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированные организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" <8>. Согласно первоначальной редакции, данное Постановление должно было вступить в силу с 1 июля 2014 г. Однако Постановлением Правительства РФ от 16 июня 2014 г. N 548 <9> были внесены изменения, согласно которым вступление в силу Постановления отложено до 1 июля 2017г.[28]

<7> Федеральный закон от 5 июля 1996 г. N 86-ФЗ "О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" // Собрание законодательства Российской Федерации 1996. N 28. Ст. 3348 (в редакции Федерального закона от 19 июля 2011 г. N 248-ФЗ // Собрание законодательства Российской Федерации 2011. N 30 (часть I). Ст. 4596).

<8> Постановление Правительства РФ от 23 сентября 2013 г. N 839 "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированные организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" // Собрание законодательства Российской Федерации. 2013.N39.Ст.4991.[29]

<9> Постановление Правительства РФ от 16 июня 2014 г. N 548 "О внесении изменения в Постановление Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. N 839" // Собрание законодательства Российской Федерации. 2014. N 25. Ст. 3317.

Налицо непоследовательность законодателя в принятии принципиального решения. В результате до настоящего времени оборот товаров, содержащих ГМО, в РФ в достаточной степени не регламентирован. Необходимо отметить, что в Российском законодательстве закреплены положения об обязательной маркировке некоторых видов товаров, содержащих ГМО. Так, согласно абз. 3 ч. 2 ст. 10 Закона РФ от 7 февраля 1992 г. N 2300-1 "О защите прав потребителей" <10> изготовитель (исполнитель, продавец) обязан указывать информацию о наличии в продуктах питания компонентов, полученных с применением генно- инженерно-модифицированных организмов, в случае, если содержание указанных организмов в таком компоненте составляет более девяти десятых процента.[30]

<10> Закон РФ от 7 февраля 1992 г. N 2300-1 "О защите прав потребителей"

// Ведомости Съезда народных депутатов Российской Федерации и Верховного Совета Российской Федерации. 1992. N 15. Ст. 766 (в редакции Федерального закона от 5 мая 2014 г. N 112-ФЗ "О внесении изменений в Федеральный закон "О национальной платежной системе" и отдельные законодательные акты Российской Федерации" // Собрание законодательства Российской Федерации. 2014. N 19. Ст. 2317).[31]

Аналогичные нормы содержатся в разделе 4.11 Технического регламента Таможенного союза "Пищевая продукция в части ее маркировки"

<11> Решение Комиссии Таможенного союза от 9 декабря 2011 г. N 881 "О принятии Технического регламента Таможенного союза "Пищевая продукция в части ее маркировки" // Комиссия Таможенного союза. #"897455.files/image001.jpg">

Методику проводят в канале FAM (470-525 nm), внутреннего контроля в канале ROX (535-605 nm). По наличию сигнала флуоресценции, превышающего пороговое значение отрицательного контроля, судят о присутствии ДНК возбудителя в анализируемом клиническом образце. Регистрацию и сохранение результатов исследования проводится с помощью управляющей программы флуоресцентного ридерса или реал-тайм терма циклера.

Специфичность. При использовании в качестве исходного материала ДНК возбудителя (положительный контрольный образец) происходит существенное повышение сигнала флуоресценции, по сравнению с пороговым значением отрицательного контроля. При использовании метода гель-электрофореза должна быть видна полоса оранжевого цвета соответствующего размера PCR продукта.

При использовании в качестве исходного материала отрицательного контрольного образца (бидистиллированной воды или другого растворителя 50 ДНК) значения сигнала флуоресценции PCR продукта не превышают порогового значения отрицательного контроля, а при использовании формата гель-электрофореза полоса оранжевого цвета соответствующего размера, должна отсутствовать, а полоса, соответствующая внутреннему контролю, 90 по, должна быть отчетливо видна.

Аналитическая чувствительность набора составляет около 10 копий матрицы ДНК в 10 мкл анализируемого образца (от 500-1000 копий мишени в 1 мл анализируемого образца). Диагностическая чувствительность набора составляет 99%, диагностическая специфичность набора составляет 100%..

Меры предосторожности

Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе с набором и с анализируемыми биологическими образцами следует пользоваться одноразовыми медицинскими перчатками.

Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор.

Потенциальный риск применения набора - класс 3 в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51609.

Для предотвращения контаминации основные виды работ, при использовании набора GenPak® DNA-PCR test (подготовка анализируемых проб и проведение PCR), рекомендуется физически изолировать друг от друга, т.е. размещены в разных помещениях (зонах). При работе с клиническими образцами или с выделенной для исследования ДНК следует работать с наконечниками с антиаэрозольными фильтрами.

При работе с набором GenPak® DNA PCR test в формате "конечная точка" или "реал-тайм" допускается проведение постановки PCR и детекции PCR продукта в одном помещении.

Постановку PCR следует проводить в ламинарном шкафу, PCR боксе или в помещении "только для постановки PCR".

Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда и др., а также рабочие растворы, должны быть строго стационарными, т.е. запрещается их перемещение из одного помещения в другое. Перемещение персонала или перенос оборудования из комнаты для пробоподготовки в другие помещения должны проходить под строгим контролем. Смена верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при окончании одного типа работы или при выходе из помещения для пробоподготовки.

Поверхности рабочих столов, а также помещения, в которых проводится постановка PCR, должны обязательно облучаться 25-30 мин. ультрафиолетовым светом до начала и после окончания работ. Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 51609-2000.

Химическая посуда и оборудование, которые используются при работе с набором реагентов, должны быть соответствующим образом маркированы и должны храниться отдельно.

Работа с набором должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно- эпидемических правил СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", методических указаний МУ 1.3.2569-09

"Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности" и ГОСТ Р 529205-2007 "Лаборатории медицинские. Требования безопасности".

Удалять неиспользованные реактивы необходимо в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений" и МУ 287-113 по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения.

Материалы и оборудование

Образцами для исследования послужили:

В качестве отрицательного контроля использовали дезоионизированную воду

В качестве положительного контроля использовали раствор положительного контроля реакции на терминатор nos "ПКО-1" коммерческого набора "Растение / 35S+FMV / NOS скрининг" (Компания "Синтол" Россия, Москва), плодово-ягодные: крыжовник, малина, клубника, смородина, черника, кизил, земляника, арбуз

Оборудование

Зона выделения ДНК

1.       Ламинарный бокс Lamsystems БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,5 ("Ламинарные системы" Россия);

2.  Весы аналитические Explorer pro ("OHAUS" США);

3.       Термостат твердотельный Термо 24 ("Биоком" Россия);

.         Центрифуга Eppendorf Minispin ("Eppendorf" Германия);

.         Вортекс V-1 plus ("Biosan" Латвия);

.         Ротатор RS-24 ("Biosan" Латвия);

7.    Автоматические дозаторы LabMate+ ("Hightech Lab" Польша) с переменным объёмом: 100-1000 мкл, 20-200 мкл, 2-20 мкл.

Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР

. ПЦР-бокс БАВ-ПЦР-"Ламинар-С" ("Ламинарные системы" Россия);

. Вортекс V-1 plus ("Biosan" Латвия);

3.  Центрифуга FVL-2400N ("Biosan" Латвия);

4.    Автоматические дозаторы LabMate+ ("Hightech Lab" Польша) с переменным объёмом: 20-200 мкл, 0,5-10 мкл;

5.  Амплификатор "Терцик" ("ДНК-Технологии" Россия) Зона электрофореза

.    Камера для горизонтального электрофореза SE-1 ("Helicon" Россия)

2.       Трансиллюминатор UVT-1 ("Биоком" Россия). Реактивы и расходные материалы

1.  Набор для выделения ДНК "Универсальная пробоподготовка" ("Лаборатория Изоген" Россия)

2.   Набор для приготовления реакционной смеси GenPak PCR-Core 0.5 ("Лаборатория Изоген" Россия)

3.    Лабораторный одноразовый пластик: наконечники для дозаторов V=1000 мкл, 200 мкл, 20 мкл; эппендорфы V=1,5 мл, 0,5 мл ("Axygen" США).

•   MasterMix (МастерМикс), готов к применению - бесцветные пробирки с лиофилизованным сухим содержимым синего цвета для анализа исследуемых проб, 80 шт;

•        PCR Diluent (Растворитель для ПЦР), 1 пробирка, 1,0 мл;

•        PCR Oil (Масло для ПЦР), 1 пробирка, 2,0 мл.

Отбор, хранение и подготовка образцов пищевых продуктов для анализа

Отбор проб проводят в соответствии с методическими документами, устанавливающими порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-2000, 10852-86, 13979.0-86, 26313-84, 26312.1-84, 9792-73, 7631-85. 55.Подготовка образцов продуктов к анализу

Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые пробирки, ступки и пестики, предварительно обработанные хромовой смесью и фламбированные инструменты - пинцеты, скальпели, ножницы

Пробы плотных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 5-10 г помещают в ступку, измельчают ножницами, затем растирают пестиком до гомогенного состояния. Для анализа необходимо 50 - 150 мкг образца.

Образцы скоропортящихся продуктов рекомендуется хранить в замороженном состоянии (при температуре минус 20оC) в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа).

Транспортирование образцов осуществляют при температуре, рекомендованной для хранения сырья или пищевого продукта.

Длительность транспортирования не должна превышать сроков годности продукта.

В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК растения (фрукта или овоща) путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК - мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК.

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК - мишени в присутствии термостабильной ДНК - полимеразы, дезоксинуклеозид - трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК - мишени.

Для получения достаточного для визуального количества копий целевого фрагмента ДНК необходимо провести 20-40 амплификации, каждый цикл из которых включает в себя 3 стадии:

Этап 1. лизис клеток (или разрушение физическим, механическим способом); ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизацию клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа; центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе.

Этап 2-Денатурация - реакционную смесь нагревают при 93 - 95 С в течение 30 - 40 секунд, происходит расплетение двойной спирали ДНК с образованием одноцепочечных молекул.

Этап 3: Отжиг праймеров - комплементарное связывание праймеров с ДНК - матрицей, температура отжига специфична для каждой пары праймеров, ее значение располагается в интервале 50 - 65 С, протекает в течение 10 - 40 секунд.

Этап 4: Элонгация цепи - синтез новых цепей ДНК Taq - полимеразой путем удлинения праймеров. Протекает эта реакция при температуре 69 - 72.

С, время её зависит от размера амплифицируемого фрагмента. За 30-40 циклов амплификации в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Такого количества достаточно для визуального обнаружения ПЦР-продукта методом электрофореза в агарозном геле.

Клонирование генов и полимеразная цепная реакция (ПЦР), два биотехнологических прорывов 1970-х и 1980-х годов, по-прежнему играют важную роль в современной науке. Сегодня метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации (Real Time) становится одним из наиболее популярных методов как в клинической геннодиагностике, так и в научных исследованиях. Появление генетически модифицированных организмов (ГМО) на продовольственном рынке несколько лет назад, и спрос на более точные и надежные методы для обнаружения иностранных (транс генных или патогенных) ДНК в съедобных растениях, были движущей силой для внедрения ПЦР в реальном времени методы исследований в растениеводстве. За этим последовали многочисленные фундаментальные исследовательские задачи, направленных на изучение профилей экспрессии эндогенных генов и мультигенных семей. С тех пор научный интерес к этой технике возрос в геометрической прогрессии.

Количественное определение ГМО растительного происхождения основано на расчёте отношения количества ДНК определенной линий ГМ растения к общему количеству ДНК анализируемого растения, выраженного в процентах. В каждой тест-системе для количественного определения ГМО одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке. Одна реакция позволяет обнаружить ДНК анализируемого растения (соя, кукуруза и т. п.). Другая реакция позволяет обнаружить последовательность, специфичную для конкретной линии ГМ растения. Протекание каждой реакции детектируется с помощью специфического зонда. Для обнаружения ДНК анализируемого объекта (соя, кукуруза) используется зонд, меченный красителем R6G, а для обнаружения генетической вставки - красителем FAM или ROX в зависимости от типа прибора. Определение процентного содержания ГМО происходит с использованием калибровочных образцов (КО), которые представляют собой смеси ДНК растения дикого типа (0 % ГМО) и ДНК ГМ линии (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении. Разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых образцах.

Реактивы.reagent (Лизирующий реагент), готов к применению - 1 флакон, 30 мл;buffer (Солевой буфер) - 10-кратный буфер, 1 флакон, 10 мл;. Е™ (ЭкстраГен Е, суспензия смеси гранул ионообменников), готов к применению - 1 флакон, 10 мл;™ (Нуклеос, суспензия сорбента ДНК), готов к применению - 2 пробирки по 1,0 мл.

•      (+) control (положительный контрольный образец), готов к применению - красные пробирки с лиофолизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.

•   (-) сontrol (отрицательный контрольный образец), готов к применению

-         синие пробирки с лиофилизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.;

Результаты

В результате проведенного эксперимента ГМО в плодово-ягодных обнаружено не было, только показал ГМО праймер на 35s, в котором заранее было заложен измененный ген.

Праймеры на промотор 35S [26]: 35S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС A 3'; 35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT СА 3'.

.45 Праймеры на терминатор nos [27]: nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3'; nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'.

Таблица 1. Программа амплификации для праймеров 35S и nos

Таблица 2.Результаты исследований на содержание ГМИ в сырье и пищевых продуктах

Транс генные последовательности были обнаружены практически в каждой из групп данных продуктов, но при повторных поступлениях идентичных образцов, как правило, ГМИ не обнаруживались. Это свидетельствует об ответственном отношении производителей к качеству выпускаемой продукции

Таблица 3. Результаты исследований на содержание ГМИ в сырье и пищевых продуктах

Выводы

1. Всего нами было проанализировано 148 образцов, из них 44 - по добровольной маркировке на знак "Не содержит ГМО!".

В подавляющем большинстве исследуемых образцов (97,4%) генно-модифицированных последовательностей не обнаружено. Это свидетельствует об ответственном подходе производителей и заявителей - поставщиков детского и школьного питания - о недопустимости содержания ГМИ в продуктах для этих категорий потребителей.

В трех образцах из 148 были обнаружены генетические последовательности gus, nos, 35S, nptII в сочетаниях: gus, 35S, nptII- один образец и gus, nos, 35S- 2 образца.

Это означает применение генетически модифицированных источников в производстве данных продуктов питания (кондитерские изделия).

. Электрофарез и Метод ПЦР, позволяющий не только выявить наличие ГМИ в продуктах, но и определить их количество, на сегодняшний день является наиболее эффективным методом контроля. Предусмотрено дооснащение лаборатории комплектом оборудования для количественного определения ГМИ методом ПЦР в реальном времени.

Список литературы

1.               Вельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А,Б. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия, 2003,№ 2, с 74-96.

2.            Гинцбург А.Л., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса " Здоровое питание населения России" Москва, 2003, с. 123-124.

3.              ГОСТ Р' 52173-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения"

4.              ГОСТ Р 52174-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа"7. Директива ЕС 1829/20038. Директива ЕС 1830/2003

5.             Дубцова Г.Н., Кирюхина М.Н., Дубцов Г.Г. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком // Сб.трудов 7-говсероссийского конгресса " Здоровое питание населения России" Москва, 2003, с.166-168.

6.                Ю.Иванов A.A., Галкина И.И., Мясникова В.В. Деятельность учреждений госсанэпидслужбы России по гигиене питания (по надзору за ГМИ в 2003 году). // Информационный сборник М. - Федеральный центр Госсанэпиднадзора. - 2004г. - 17 стр. 64

7.             Ивановцев В.В., Светличкин В.В., Каверин A.B. / Идентификация транс генной сои в продуктах и кормах.// Журнал "Ветеринария и кормление", Москва 2006, №6 стр. 21-22

8.            Каверин A.B. / Количественное определение ГМИ методом ПЦР в реальном времени// Труды ВНИИВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии и экологии", Москва, 2006, стр. 34-37

9.            Киль В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука в Bt-защищенному картофелю// Arpo XXI Современное растениеводство России: практика и научные достижения., №7 с.22-24

10.              Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария 2000., №3., с. 59-62.

11.             Лушников, К.В. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевой продукции / Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В., Возняк В.М. // Партнеры и конкуренты. 2001. - №2,- С. 36-39.

12.             Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование//М., изд. "Мир"., 1994, с. 159-172.

13.             Методические указания "Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной • из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги" МУК 4.2.1917-04

14.     Методические указания "Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги" МУК 2.3.2.1935-04

15.             Методические указания "Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного' происхождения в продуктах питания". МУК 4.2.1913-04.

16.                  Методические указания "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции". МУК 4.2.1902-04.

18.               Постановление № 149 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 16.09.2003 .

19.            Постановление № 36 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 14.11.2001

20.              Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, 66 полученными из генетически модифицированных источников" от 31 декабря 2004г. № 13.

21.            Харченко П.Н. ДНК-технологии в биологической защите растений / П.Н. Харченко // Транс генные растения новое направление в биологической защите растений: материалы междунар. научно- практич. конференции. Краснодар, 19-22 июня 2002. Краснодар, 2003. - С. 100-105.

22.               Черкасова Н.Н. Метод получения трансгенных растений, устойчивых к патогенам / Н.Н. Черкасова, Т.П. Жужжалова, И.Л. Цветков // Сахарная свекла. 2003. - № 9. - С. 28.

23.            Чернин Л.С. Первые шаги в будущее: генная инженерия растений / Л.С. Чернин. - М.: Агропром.издат, 1990. 256 с.

24.               Чернышева О.Н. Идентификация ГМИ в пищевых продуктах: результаты мониторинга / О.Н. Чернышева, Е.Ю. Сорокина, О.В. Анисимова, Н.Н. Филатов // Пищевая промышленность. 2003. - № 6. - С. 22-23.

25.            Чесноков Ю.В. Генетическая трансформация растений: некоторые особенности проведения / Ю.В. Чесноков // Достижения науки и техники АПК. 2003. - № Ю. - С. 30-34.

26.             Шевелуха B.C. Биоинженерия - стратегическое направление в биологии и иммунитете растений / B.C. Шевелуха // Вестник защиты растений. 2003. - № 1. - С. 3-7.

27.             Advance copy of working document of the commission services on traceability and labelling of GMOs and products derived from GMOs. ENV/620/2000 // europa.eu.int/comm./food/fess/biotech/biotech01en.pdf

28.             Amanda Kumar P. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis / Amanda P. Kumar, R.P. Sharma, V.S. Malice // Adv. Appl. Microbial. 1996. -Vol. 42.-P. 1-43.

29.             Anklam E. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant derived food products / E. Anklam // European Food Research and Technology. - 2002. - Vol. 214.-N.1.-P. 3-26.

30.             Brunke K.J. Insect control with genetically engineered crops / K.J. Brunke, R.L. Meeusen // Trends Riotechnol. 1991. - Vol. 9. - P. 197-200.

31.           Buanec B. Le. Genetically Modified varieties and the seed industry / B. Le. Buanec // Seed Testing International. 2003. - №> 125. - P. 12-15.

32.             Byrne D. The right to know about genetically modified food / D. Byrne //europa.eu.int/comm./food/fess/biotech/biotech07en.pdf

33.     Cheng J. Production of insect resistant potato by genetic transformation with a y-end toxin from Bacillus thuringiensis var. kurstaki / J. Cheng, M.G. Bolyard, R.C. Saxena, M.B. Sticklen // Plant Sci. 1992. - Vol. 81. -P. 83-91.

34.            Cockburn A. Assuring safety of genetically modified (GM) foods: the importance of an holistic, integrative approach / A. Cockburn // J. of Biotechnology. 2002. - Vol. 98. - P. 79-106.

35.            Dekker J. Herbicide-resistant field croups / J. Dekker, S.O. Duke // Adv. Agron. 1995. - Vol. 54. - P. 69-116.

36.             Di Donato A. A method for synthesizing genes and codas by the polymerase chain reaction / A. Di Donato, M. de Nigris, N. Russo et al. // Anal. Brioche. 1993. - Vol. 212. - P. 291-293.

37.            Duijn van G. Detection methods for genetically modified crops / Duijn van G., Biert van R. Bleeker Marcelis H. et al. // Food control. 1999. - Vol.10. - №6.-P. 375-379.

38.             EPA, Glyph sate; pesticide tolerance // Federal Register. 1999. - 64, 71.- P. 18360-18367.

39.            Gets J.M. Tolerance of transgenic soybean (Glycogen max) to heat stress / J.M. Gets, W.K. Vencill, N.S. Hill // 1999 Brighton crop protection conference. Brighton. UK. 1999. - V.3. - P. 835-840.

40.             Genetically modified byproducts check // China science and technology new letter. The Ministry of science and technology People's Republic of China.- 2002. -№287.

41.            Всеобщая декларация ЮНЕСКО о биоэтике и правах человека от 19 октября 2005 г. // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

42.    Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза 2001/18/ЕС от 12 марта 2001 г. о преднамеренном выпуске в окружающую среду генетически модифицированных организмов и об отмене Директивы Совета ЕС 90/220/ЕЭС // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

43.  Закон РФ от 7 февраля 1992 г. N 2300-1 "О защите прав потребителей" // Ведомости Съезда народных депутатов Российской Федерации и Верховного Совета Российской Федерации. 1992. N 15. Ст. 766 (в редакции Федерального закона от 5 мая 2014 г. N 112-ФЗ "О внесении изменений в Федеральный закон "О национальной платежной системе" и отдельные законодательные акты Российской Федерации" // Собрание законодательства Российской Федерации 2014. N 19. Ст. 2317).

44.  Конвенция о биологическом разнообразии от 5 июня 1992 г. // Собрание законодательства Российской Федерации. 1996. N 19. Ст. 2254.

45.   Конвенция Совета Европы о защите прав человека и человеческого достоинства в связи с применением биологии и медицины: Конвенция о правах человека и биомедицине от 19 ноября 1996 г. N 164 // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

46.    Петушкова Ю.А. Правовое регулирование в сфере биотехнологии в зарубежных странах // Экологическое право. 2013. N 2. С. 20 - 25.

47.   Постановление Правительства РФ от 23 сентября 2013 г. N 839 "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированные организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" // Собрание законодательства Российской Федерации. 2013. N 39. Ст. 4991.

48.  Постановление Правительства РФ от 16 июня 2014 г. N 548 "О внесении изменения в Постановление Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. N 839" // Собрание законодательства Российской Федерации. 2014. N 25. Ст. 3317.

49.  Регламент Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2003 г. N 1829/2003 о генетически модифицированных продуктах питания и кормах // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

50.   Решение Комиссии Таможенного союза от 9 декабря 2011 г. N 881 "О принятии Технического регламента Таможенного союза "Пищевая продукция в части ее маркировки" // Комиссия Таможенного союза. #"897455.files/image002.jpg">

Рисунок 2.1. Результаты анализа пищевых продуктов на ГМО после электрофореза

Рисунок 2.Результат анализа пищевых продуктов на ГМО после УФ