Полихлорированные бифенилы в жировой ткани атлантического моржа Печорского моря – концентрации и предполагаемые последствия

Полихлорированные бифенилы в жировой ткани атлантического моржа Печорского моря – концентрации и предполагаемые последствия

Полихлорированные бифенилы в жировой ткани атлантического моржа Печорского моря - концентрации и предполагаемые последствия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В XXI веке, растущие потребности развивающегося человечества вынуждают исследовать новые месторождения ресурсов, таких как углеводороды. Русская Арктика располагает крупным потенциалом и вызывает к себе заслуженный интерес. Однако увеличение масштабов подобных работ и освоение новых участков влечет за собой рост антропогенного фактора влияния на окружающую среду. Распоряжение Минприроды России от 22.09.2015 N 25-р "Об утверждении перечня видов флоры и фауны, являющихся индикаторами устойчивого состояния морских экосистем Арктической зоны Российской Федерации" призвано наладить мониторинг состояния среды и помочь человеку гармонично воспользоваться ресурсами вышеуказанных территорий. Среди морских млекопитающих, в этот перечень вошли гренландский кит (Balaena mysticetus), кольчатая нерпа (Phoca hispida), белуха (Delphinapterus leucas), белый медведь (Ursus maritimus) и морж (Odobenus rosmarus).

Исследованная в этой работе популяция атлантического моржа отлично подходит как индикатор состояния экосистемы юго-востока Баренцева моря

она растет и развивается только здесь, и прочно связана со всеми звеньями экосистемы этого района, то есть Печорского моря.

В рамках прошедших летом 2015-16 годов экспедиций Совета по Морским Млекопитающим были проведены работы по выявлению концентраций стойких органических загрязнителей в жировой ткани 13 моржей. Группа полихлорированных бифенилов рассмотрена в этой работе.

Цель исследования. Изучить концентрации полихлорированных бифенилов в жировой ткани атлантических моржей популяции печорского моря, интерпретировать их возможные эффекты на состояние популяции и охарактеризовать динамику изменения этих параметров, опираясь на исследования прошлых лет.

Задачи исследования. бифенил жировой морж

Собрать пробы жировой ткани моржа в естественных местах обитания.

Провести лабораторные токсикологические исследования для выявления качественного и количественного конгенерного состава полихлорированных бифенилов в жировой ткани моржа.

Сравнить полученные результаты с опубликованными данными по содержанию ПХБ в тканях моржа и других арктических морских млекопитающих.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

.1 Атлантический морж как предмет исследования

Вид морж (odobenus rosmarus) относится к cемейству моржовых (odobenidae) отряда хищных (carnivora) и включает в себя 3 подвида: Тихоокеанский (Odobenus rosmarus divirgens Linnaeus, 1785); самая крупная форма (Арсеньев, 1976). Максимальная длина тела самцов - 450 см, самок - 367 см, череп массивнее и крупнее, чем у других подвидов (Огнев, 1935; Никулин, 1941). Распространен в морях: Беринговом, Чукотском и восточной части Восточно-Сибирского (Смирнов, 1929; Чапский, 1941). Атлантический (Odobenus rosmarus rosmarus Islliger, 1815); наименее крупный подвид. Максимальная длина тела самцов достигает 375 см, самок -338 см. Бивни короче и тоньше других подвидов (Соколов, 1986). Распространен в Северной Атлантике от Карского моря на востоке до Канадского архипелага на западе (Арсеньев, 1976).

Лаптевский (Odobenus rosmarus laptevi Chapsky, 1940); средний по размерным параметрам (Арсеньев, 1976). Максимальная длина тела самцов -

см, самок 370 см (Попов, 1960). Распространен в море Лаптевых, западной части Восточно-Сибирского (Чапский, 1941; Арсеньев, 1976) и в акваториях восточной части Карского моря вблизи Северной Земли (Павлов, Бычков, 2001).

Ареалы указанных подвидов изображены на картосхеме (Рисунок ).

Рисунок 1. Ареалы подвидов моржей

Облик моржа значительно отличается от других видов ластоногих (Рисунок ). Это животное с крупным, массивным телом, толстой морщинистой кожей со множеством складок, конечности в виде ласт - широкие. Голова относительно тела небольшая, с тупо срезанной спереди мордой. Маленькие глаза посажены сильно сзади. На морде имеются многочисленные толстые и жесткие вибрисы, расположенные в 13-14 рядов, боковые длинной до 12 см, посередине, будучи сильно стертыми, до 1 см.

Пятипалые конечности моржей относительно меньше по размером, чем у ушастых тюленей. Передние ласты достигают в длину менее 25% длины тела. Они несколько крупнее задних ласт и имеют пять маленьких когтей. Как передние, так и задние конечности утолщены по переднему краю. Ласты безволосые, только у молодых особей тыльная сторона задних и передних конечностей может иметь волосяной покров. Задние ласты участвуют в передвижении по твердому субстрату, передние используются для плавания. В воде развивают скорость до 24 км/ч, маневренны.

Сосков 2 пары. Семенники располагаются под кожей. Боковые стенки у взрослых моржей преимущественно у самцов, образуют большие парные мешки. Воздух поступает в них из легких. Вокруг отверстий мешков имеются сфинктеры. Эти полости имеют гидростатическую функцию и являются резонаторами (Соколов, 1979).

Окраска животных варьирует в зависимости от возраста: от грязновато оливковой до рыжевато коричневой.

Рисунок 2. Взрослые самцы моржа на лежбище о. Вайгач

Половой и возрастной диморфизмы выражены в размерах тела, форме и размерах клыков и волосяном покрове - у молодых он густой и темно- коричневый, но, по мере взросления, он становится буро-желтым, с большими участками, лишенными волос (Гептнер и др., 1976).

Верхние клыки имеют неограниченный рост, и функционируют как огромные бивни: прямые или дугообразно изогнутые. Могут достигать в длину у самцов до 82 см, а у самок до 70 см. Все остальные зубы примерно однотипны: округлые в поперечнике, с низкой коронкой, плоской или слабо

конической жевательной поверхностью, приспособленной к дроблению и перетиранию твердой пищи. Зубы имеют по одному корню. Позвонков обычно 14 грудных и 6 поясничных. Лопатка высокая и узкая (Соколов, 1979).

Тихоокеанский подвид является промысловым, его численность насчитывает около 200 тысяч особей, их жир и мясо потребляются коренными народами севера, а бивни используются как прочный материал для поделок.

Морж питается в основном бентосом. В зависимости от района кормления, времени и условий, пищевой состав его рациона может варьироваться, но в подавляющем большинстве случаев будут преобладать двустворчатые моллюски (Bivalvia). Кроме них, значительную долю составляют ракообразные, а такие группы, как черви, иглокожие, асцидии и рыбы являются второстепенными. Не редко взрослые моржи нападают на детёнышей гренландских тюленей, например на их скоплениях в Белом море. За сутки взрослый морж потребляет в среднем 35-50 кг корма, что составляет примерно 4-4,5% от его веса (Fay, 1985; Born et al., 2003).

Для моржа характерно сезонное разделение популяции на две поло- возрастные группировки. В российской части своего ареала атлантические моржи в безледовый период могут формировать практически исключительно самцовые скопления и береговые лежбища. Одним из них является лежбище на м. Лямчин нос (о. Вайгач). Рост популяции очень медленный - самка рожает одного детёныша раз в 2-3 года, достигая половой зрелости в 6-10 лет. Период гона растянут с января по июнь, имплантация зародыша проходит в июне-июле. Весной самка рожает на льду одного детёныша, вскармливает его 2 года. С возраста 5 месяцев, кроме материнского молока, моржонок начинает потреблять бентосную пищу. Моржата самцы держатся с самкой от 2 до 5 лет, а самки остаются в стадах. Продолжительность жизни моржа - около 45 лет. Наибольший вклад в численность популяции самка делает в возрасте с 10 до 20 лет, принося до 5 детёнышей. При этом основные

популяционные параметры, такие как возрастной и половой состав, смертность в разных возрастных категориях и скорость роста популяции для изучаемой группы неизвестны. (Болтунов и др., 2010).

Атлантический морж распространён в Северной Атлантике от Карского моря до Канадского архипелага на западе (Павлов, Бычков, 2001). Дискретность популяционной структуры выражается в наличии, по меньшей мере, 8 субпопуляций (Born et al., 1995). Одна из этих группировок населяет юго-восточную часть Баренцева моря и прилегающие районы Белого и Карского морей. Популяционная структура атлантического моржа в этой области пока не изучена. Однако известно, что особи из этой субпопуляции не предпринимают длительных миграций и живут в своём районе круглый год (Зырянов, Воронцов, 1999; Горяев, Воронцов, 2000; Светочев, Светочева, 2008), что делает их хорошими видами-индикаторами для этой территории. Возможен частичный обмен с группировками моржей на севере Баренцева моря, но интенсивность этого процесса не изучена. Часть моржей, летом, перемещается в юго-западную часть Карского моря, но осенью они возвращаются на места зимовки, расположенные в юго-восточной части Баренцева моря (Болтунов и др., 2010).

Атлантический морж, как было описано ранее - крупное морское млекопитающее, обитающее в холодных водах арктических морей. Такие условия располагают к накоплению большой жировой массы - в целях теплоизоляции и депонирования энергии. В данном исследовании это - ключевой момент, так как именно жир животного накапливает неполярные стойкие органические загрязнители. Их физико-химические свойства затрудняют естественную детоксикацию и выведение из организма, приводя к росту их концентраций в тканях. Стоит так же отметить, что атлантический морж находится в вершине трофической цепи своей экосистемы, а значит, накапливает наивысшие результирующие концентрации веществ.

.2 Полихлорированные бифенилы

Стойкие органические загрязнители и общая характеристика полихлорированных бифенилов

Стойкие органические загрязнители (СОЗ) - группа химических соединений, способных к биоаккумуляции внутри пищевой цепи и подверженные минимальному разложению в условиях живого организма. Они являются токсикантами антропогенного происхождения. 22 мая 2001 года в Швеции приняли Стокгольмскую конвенцию, которую подписало подавляющее большинство развитых стран мира. Она предполагает отказ от производства и использования 12 веществ:

альдрин - хлорированное полициклическое соединение. Используется для борьбы с почвенными вредителями. В СССР применение альдрина было запрещено;

хлордан - хлорированное полициклическое соединение, смесь изомеров.

Инсектицид широкого спектра действия;

дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ) - хлорпроизводное дифенилметана, вероятно, один из самых известных СОЗ. Инсектицид широкого спектра действия;

дильдрин - хлорированное полициклическое соединение. Используется для борьбы с почвенными и другими вредителями. В СССР применение дильдрина было запрещено;

диоксины - производные ароматических углеводородов. Образуются непреднамеренно в результате неполного сгорания, а также в результате производства некоторых пестицидов и других веществ. К выбросу диоксинов в атмосферу могут приводить некоторые виды переработки металлов и целлюлозно-бумажных отходов;

эндрин - хлорированное полициклическое соединение. Используется для борьбы с черносмородинным почковым клещом, а также как зооцид;

фураны - относятся к классу гетероциклических соединений. Образуются непреднамеренно в результате тех же процессов, которые приводят к выбросу диоксинов. Они также обнаружены в технических смесях полихлорированных бифенилов;

гептахлор - хлорированное полициклическое соединение. Применяется для борьбы с обитающими в почве вредителями (проволочники, личинки майского и июньского жуков, долгоносики и др.). Защищает всходы от повреждения насекомыми и стимулирует всхожесть семян. Обладает сравнительно высокой острой и хронической токсичностью;

гексахлорбензол - уничтожает грибки, применяется как протравитель семян;

мирекс - хлорированное полициклическое соединение. Этот инсектицид используется для борьбы с муравьями и термитами;

токсафен - полихлортерпен. Используется как инсектицид. Применяется для борьбы с грызунами;

полихлорированные бифенилы (ПХБ) - используются в промышленности в качестве жидкостей для теплообмена, в электрических трансформаторах и конденсаторах и т.д. (Мартынов, 2010).

Наиболее проблемными из этих соединений для России являются полихлорбифенилы, которые производились в нашей стране с 1939 г. С 1993 г. их производство прекращено, однако, согласно данным инвентаризации, в электротехническом оборудовании, которое используется во многих отраслях промышленности, до сих пор находится около 30 тыс. тонн ПХБ, выполняющих функции диэлектриков (Всероссийская конференция по проблеме стойких органических загрязнителей... 2002).

Полихлорированные бифенилы относятся к классу ароматических соединений, состоящих из двух бензольных колец, соединенных через межъядерную связь С-С и замещенных от одного до десяти атомами хлора в орто-, мета- или пара- положениях (Рис. 3). Существует 209

индивидуальных конгенеров ПХБ, отличающихся числом и положением атомов хлора в молекуле (Юфит С.С. 2001), имеющих общую формулу:

Рисунок 3. Структура молекул полихлорированных бифенилов

Существуют большие различия в токсичности, свойствах биоаккумуляции и биопревращения для различных конгенеров ПХБ. Конгенеры, не содержащие атомы хлора в орто- положениях молекулы (орто- незамещенные ПХБ), могут принимать планарную конфигурацию, которая энергетически наиболее выгодна (McKinney et al., 1983). Такие конгенеры изостереоизомерны ПХДД и ПХДФ. Примеры изображены на Рис. 4-6.

Рисунок 4. 3,3',4,4'-Тетрахлорбифенил

Рисунок 5. 3,3',4,4',5-Пентахлорбифенил

Рисунок 6. 3,3',4,4',5,5'-Гексахлорбифенил

ПХБ обладают рядом уникальных физических и химических свойств: исключительными теплофизическими и электроизоляционными характеристиками, термостойкостью, инертностью по отношению к кислотам и щелочам, огнестойкостью, хорошей растворимостью в жирах, маслах и органических растворителях, высокой совместимостью со смолами, отличной адгезионной способностью (Занавескин, Аверьянов, 1998). Это обуславливало их широчайшее применение в качестве диэлектриков в трансформаторах и конденсаторах, гидравлических жидкостей, теплоносителей и хладоагентов, смазочных масел, компонентов красок, лаков и клеевых составов, пластификаторов и наполнителей в пластмассах и эластомерах, антипиренов, растворителей (Юфит, 2001; Занавескин, Аверьянов, 1998; Клюев, Бродский, 2000).

По данным Всемирной организации здравоохранения (Гигиенические критерии состояния окружающей среды…), существуют следующие пути поступления полихлорированных бифенилов в среду:

испарения из пластификаторов;

выделение при сжигании бытовых и промышленных отходов, а также при возгорании трансформаторов, конденсаторов и другого промышленного оборудования, в котором используются ПХБ;

утечки с другими промышленными отходами; вывоз ПХБ на свалки и поля аэрации;

другие неконтролируемые пути.

Основными путями из вышеперечисленных являются первые три.

Влияние ПХБ на организм

Влияние планарных полихлорированных бифенилов на организм млекопитающего, в частности на иммунную систему, схоже с таковым у 2,3,7,8-тетрахлор-дибензо-р-диоксина (2,3,7,8-ТХДД). Однако это относится только к планарным молекулам ПХБ, которые потому и являются наиболее токсичными. Для характеристики уровня токсичности того или иного конгенера диоксиноподобного ПХБ его токсичность выражают в отношении к токсичности 2,3,7,8-ТХДД, принимаемо за единицу. Это отношение называется диоксиновым эквивалентом. Молекула такого токсиканта имеет сродство к Ah-рецептору (рецептору ароматических углеводородов), связываясь с которым, она инициирует цепь внутриклеточных реакций, результатом которых является продукция большого количества окисляющих ферментов (таких как CYP-450, CYP1A). Однако, в связи с тем, что сами молекулы недиоксиноподобных полихлорированных бифенилов и ТХДД устойчивы к биологическим процессам окисления, высвободившиеся оксигеназы действуют во вред организму, окисляя не те соединения, какие нужно. Это влечёт за собой дегенерацию механизмов клеточной защиты, образование свободных радикалов, формирование предраковых поражений, изменение метаболизма витамина А и перокисление липидов (Todd et al., 2002). То есть их влияние способствует падению иммунитета в целом.

Непланарные ПХБ по-другому влияют на организм, что связано с их строением. Они не могут принимать планарную форму, что лишает их сходства с диоксинами и возможности активировать Ah-рецепторы, взаимодействующие с ариловыми углеводородами. Все недиоксиноподобные полихлорированные бифенилы, при лабораторных исследованиях, продемонстрировали способности к деактивации рецепторов андрогеновых гормонов и подавлению межклеточных контактов (Hamers et. al, 2011), а некоторые из них могут подавлять работу дофамина (Wigestrand et al., 2013).

.3 Ранее проведенные исследования

В 80-х и 90-х годах XX века было проведено много работ, направленных на изучение концентраций стойких органических загрязнителей в тканях морских млекопитающих, в частности ластоногих. Так, в одной из работ, где 19 из 53 изученных моржей показали концентрации ПХБ выше 1000 нг/г, выдвигается предположение, что подобное различие в концентрациях стойких органических загрязнителей среди моржей одного района исследования может быть обусловлено разной трофической базой. Те особи, что включают в свой рацион гренландского тюленя (Pagophilus groenlandicus) - находятся на более высокой ступени трофической цепи. Это означает, что их пища содержит более высокие концентрации токсикантов, чем пища моржей, питающихся бентосом (Muir et al, 1995). В исследовании атлантических моржей востока Шпицбергена были изучены 17 взрослых самцов. Средние показатели для ПХБ были равны 2000 нг/г при разбросе от 1165 до 4005 нг/г липидов. Отмечается, что несмотря на один и тот же район взятия проб, разброс значений стойких органических загрязнителей в жировой ткани велик. Авторы работы предполагают, что причина этой разницы - уровень в пищевой цепи, занимаемый конкретной особью (Walkers et al, 2006).

Многократно показана зависимость концентраций стойких органических загрязнителей в жировой ткани от пола животного. Например, половозрелые самки теряют часть накопленных токсикантов через плацентарный барьер (Jones et al., 1976) или с молоком в период лактации, что показано на самках длинномордого тюленя (Addison, Brodie, 1977). В связи с этим, неполовозрелые самки имеют большие средние концентрации ПХБ, что показано на атлантических моржах: 0,272 мг/кг для неполовозрелых и 0,130 мг/кг для половозрелых (Born E.W. et al, 1981).

Для гексахлорбифенилов отмечена сравнительно более высокая биоаккумуляция относительно других соединений группы бифенилов: в работе 2000 года, где были изучены атлантические моржи Гренландии,

концентрации гексахлорбифенилов были заметно выше других (Derek C.G. Muir et. al, 2000).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Район исследования. В Баренцевом море морж формирует несколько береговых лежбищ, но самое крупное и удобное, для проведения работ - лежбище на мысе Лямчин острова Вайгач. Он расположен в области арктических тундр, южнее Новой Земли, омывается Баренцевым и Карским морями. Вытянут с юго-востока на северо-запад и в длину имеет 105 км, наибольшая ширина - 44 км, общая площадь 3380 км. Является одноименным заказником.

Биологический материал. Работы проводились в дикой природе, на береговом лежбище, состоявшем из взрослых самцов. На момент начала работ насчитывалось около 600 особей (Рис. 7) Возраст и вес животных было возможно определить только приблизительно. По оценке специалистов вес взрослых особей достигал от 700 до 900 кг.

Рисунок 7. Лежбище на острове Вайгач, мыс Лямчин

Методы получения биопсии подкожного жира. В рамках проведённой экспедиции было проведено много работ разного профиля, и часть из поставленных задач требовала обездвиживания моржа. В связи с этим, в зависимости от состояния особи, у которой изымали пробы жировой ткани, было разработано три метода получения биопсии.

Работа с обездвиженным животным. В связи с разнонаправленностью задач и целей экспедиции, среди которых было мечение специальными спутниковыми метками и взятие микробиологических мазков, часть животных были обездвижены. Иммобилизацию, а также реабилитацию моржа проводил приглашенный специалист ветеринар. В случае отбора биопсии жировой ткани с обездвиженной особи использовался электрический шуруповерт со стерильной полой насадкой для фиксирования полученной ткани (Рис. 8, 9).

Рисунок 8. Взятие биопсии подкожного жира с обездвиженного моржа

Отбор пробы производился во время действия транквилизаторов, из

района поясничного отдела. Образовавшуюся ранку обрабатывали антисептиком, кровотечение было непродолжительным. Полученный таким

способом образец жировой ткани с глубины около 5 см упаковывался в фольгу, маркировался, и отправлялся на хранение в холодильную установку при температуре +4 градуса.

Рисунок 9. проба жировой ткани от обездвиженного моржа

Дистанционное получение биопсии. Второй способ взятия биопсии жировой ткани моржа - дистанционный. Для него мы использовали арбалет с усилием 43 кг, стрелы которого были привязаны к нему длинной веревкой (15 м). Каждая стрела имела специальный наконечник из нержавеющей стали (Рис. 10, 11). Устройство такого наконечника позволяет при попадании в тело пробивать внешние покровы и животного, проникать вглубь примерно на 3 см и фиксировать полученную пробу жировой ткани в полом конце при помощи замыкающего слабоподвижного крючка. Для регулировки глубины проникновения пробоотборника он оборудован широким пояском, препятствующим излишнему погружению в ткани, и способствующим отскакиванию стрелы после забора пробы.

Рисунок 10. Схема строения наконечника: 1 - резьба для крепления к стреле; 2 - дисковидный поясок, «тормоз»; 3 - крючок-фиксатор образца; 4 - полость пробоотборника

Рисунок 11. Наконечник с биопсией

Каждый наконечник использовался многократно, отбора проб их стерилизовали, проваривая в воде и для повторного несколько минут.

Подобный метод не наносит вреда моржу. В подавляющем большинстве случаев, он даже не двигается со своего места. Оглядевшись по сторонам, и не заметив потенциальной угрозы, он снова ложится дремать. Выстрел производится с расстояния 5-10 м. К моржу приближались медленно против ветра, пригнувшись, что снижало возможность спугнуть животных.

Другие методы получения жировых проб. Во время экспедиции, при обследовании береговой линии и прилежащих районов, нами было обнаружено 2 трупа погибших животных. Состояние их тканей позволило нам произвести отбор проб подкожного жира для анализа на стойкие органические загрязнители. Взятие образца проводилось стерилизованным ножом, затем его поместили в фольгу и маркировали. Условия хранения, так же, как и у всех других образцов: +4°C в холодильной установке.

Лабораторные методы анализа полученных образцов. В лаборатории, для определения концентраций полихлорированных бифенилов, использовался хромато-масс-спектрометр высокого разрешения Agilent Technologies GC System 7890 7200 Q-TOF. Обнаружение планарных и непланарных ПХБ проходило отдельно, по разным методикам: ГОСТ 31792- 2012 и РД 52.18.668-2005 соответственно, чувствительность: от 0,1 нг вещества на 1 г липидов.

Определение ПХБ в пробах биологического материала. Идентификация и определение количественного содержания ПХБ в пробах биологического материала проводится методом хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. Для контроля полноты извлечения аналитов и последующих количественных расчетов, в анализируемый образец на стадии пробообработки вводится суррогатный стандарт - ПХБ, изотопно-меченые по углероду 13С. При анализе непланарных ПХБ используют один изотопно-меченый стандарт для каждой группы конгенеров. Для планарных ПХБ вводят изотопно-меченый стандарт для каждого определяемого аналита.

Экстракция ПХБ из образца биоматериала. Для извлечения ПХБ навеску гомогенизированного образца массой 1-3 г перетирают с безводным Na2SO4 в фарфоровой ступе. Половину полученной сухой смеси помещают в стеклянную колонку на слой кварцевой ваты и добавляют к ней

раствор изотопно-меченых суррогатных стандартов в н-нонане, затем добавляют остаток анализируемой пробы.

Экстрагируют ПХБ пропуская через колонку с пробой 300 см3 смеси

гексан-дихлорметан 1:1 со скоростью 3-4 мл/мин. Экстракт концентрируют на роторном испарителе до объема около 1 см3, добавляют около 1 см3 дихлорметана и очищают методом колоночной хроматографии.

Очистка экстракта. Очистка экстракта проводится в два этапа, первый из которых включает удаление из пробы липидов и стероидов методом гель-фильтрации на колонке Bio-Beads S-X3. На втором этапе экстракт после гель-фильтрации очищают от примесей, мешающих анализу методом колоночной хроматографии, последовательно, на мультислойной колонке заполненной кислым и щелочным силикагелем и колонке с активированной окисью алюминия. При анализе непланарных ПХБ целевые аналиты в элюируют из колонки с окисью алюминия раствором гексан- дихлорметан 97:3% об. Планарные ПХБ элюируют смесью гексан- дихлорметан 40:60% об. Полученный элюат концентрируют на роторном испарителе до объема 1мл, вносят в элюат раствор внутреннего стандарта (ПХБ#155) и доводят объем раствора до 100 мкл отдувая избыток растворителя потоком азота.

Хромато-масс-спектрометрическое определение ПХБ. Анализ ПХБ выполняется на хромато-масс-спектрометре Agillent 7200Q-TOF в режиме масс-спектрального разрешения R>9000. Разделение компонентов анализируемой смеси проводится на кварцевой капиллярной колонке типа DB-5MS 30м х0,25мм х 0,25мкм в режиме программирования температуры от 80 до 280°С. Идентификация аналитов ПХБ проводится на основании наличия в масс-спектре характеристических ионов для каждой группы конгенеров ПХБ, масса которых определяется с точностью до 0,003 Da и хроматографическим временам удерживания, определяемым с точностью

±1с.

Верхняя хроматограмма - нативные пентахлорированные ПХБ, внизу - суррогатные изотопно-меченые стандарты в той же пробе (Рис. 12).

Рисунок 12. Масс-хроматограмма пробы жировой ткани моржа

В таблице 1 приведены массы аналитических ионов нативных и изотопно-меченых ПХБ, используемые при анализе планарных конгенеров.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

В процессе экспедиции летом 2015 года было отобрано 4 пробы жировой ткани взрослых самцов моржей, летом 2016 года - 9 проб. Все пробы отобраны у разных моржей. Анализы проведены в соответствии с вышеуказанными методиками в лаборатории ФГБУ «НПО «Тайфун» Института проблем мониторинга окружающей среды. Ниже приведены полученные результаты анализов.

Непланарные полихлорированные бифенилы.

Среди непланарных ПХБ, часть соединений определялась попарно: #4 и #10, #17 и #18, #28 и #31, #153 и #168, что объясняется близостью физико- химических свойств данных пар конгенеров. Полный список определенных веществ и их концентраций приведен в таблице. Для каждого образца рассчитана сумма концентраций полихлорированных бифенилов (нг/г липидов).

Таблица . Концентрации непланарных полихлорированных бифенилов в образцах жировой ткани моржей за 2015 и 2016 года

Примечание: Погрешность методики составила ±28 %. Жирным шрифтом выделены концентрации ПХБ #153 и

#168, а так же чрезвычайно высокая суммарная концентрация непланарных полихлорированных бифенилов, обнаруженная для образца «2016-32».

По данным анализа, образец «2016-32» имеет самые высокие концентрации обнаруживаемых конгенеров. Средняя концентрация полихлорированных бифенилов, по сравнению с 2015 годом, сильно возросла (6964,6 нг/г против 298,7 нг/г). Качественный состав за год тоже значительно изменился: в 2015 было обнаружено в среднем по 11, а в 2016 году уже по 20 конгенеров на образец. Несколько образцов («2016-08» и «2016-36», учитывая возможную ошибку метода, так же образец «2015-04») демонстрируют суммарные концентрации ПХБ ниже 100 нг/г.

Рассмотрим суммарные концентрации непланарных полихлорированных бифенилов для всех образцов на общей диаграмме (Рис. 13).

Рисунок 13. Суммарные концентрации непланарных ПХБ

На приведенной выше диаграмме сильно отличается от остальных уже упомянутый ранее образец «2016-32». Его суммарная концентрация непланарных полихлорированных бифенилов равна 49704,4 нг/г. На следующей диаграмме приведены те же самые данные, однако из обзора

исключен образец «2016-32», что позволяет нагляднее представить

полученные значения суммарных концентраций других образцов (Рис. 14).

Рисунок 14.

Суммарные концентрации непланарных ПХБ за

исключением образца 2016-32

Из диаграммы, представленной на рисунке 16, видны две выделяющиеся группы образцов:

те, чьи суммарные концентрации непланарных

полихлорированных

бифенилов выше 1000 нг/г, и те,

чья сумма ПХБ не

превышает этого значения. В группу образцов, сумма

ПХБ которых выше

нг/г относятся «2016-30», «2016-31», «2016-33», «2016-32» (исключен из

диаграммы выше, однако имеет концентрацию выше

нг/г). Образец

«2016-38», если учитывать ошибку метода в 28%, так же может быть причислен к этой группе. Возможные причины подобного различия в суммарных концентрациях будут рассмотрены в разделе Обсуждений.

Особое внимание привлекают концентрации ПХБ

#153 (2,2’,4,4’,5,5’- гексахлобифенил) и парно (Рис. 15 а, б).

#168 (2,3’,4,4’,5’,6-гексахлорбифенил), определенных

Рисунок 15а. ПХБ #153 Рисунок 15б. ПХБ #168

Метод не позволял разделить их, хотя это возможно, однако

потребовало бы отдельного и более продолжительного анализа. Затруднения в разделении этих конгенеров связаны с высокой схожестью их химических и

физических свойств, оба этих бифенила имеют по 6 атомов хлора.

Концентрации, обнаруживаемые для этой пары соединений, в большинстве образцов значительно превышают концентрации других (Рис. 16).

Рисунок 16. Концентрации (нг/г) полихлорбифениловой пары 153+168 в образцах 2015 и 2016 годов

Одной из причин, по которым данная пара конгенеров рассмотрена в

этой работе отдельно от прочих, является высокая токсичность ПХБ #168 и

ПХБ #153. Они представляют опасность для репродуктивной и иммунной систем за счёт конкурентного ингибирования андрогенов и гормонов щитовидной железы соответственно. (Hamers et. al, 2011).

Кроме высоких относительных концентраций и доказанной токсичности, важная отличительная черта ПХБ #168 и #153 - это наличие 6 атомов хлора. В приведенной ниже таблице наглядно показано, что бифенилы, имеющие 6 атомов хлора, располагают наивысшими способностями к биоаккумуляции

Возможные причины подобного различия в результативности биоаккумуляции бифенилов, имеющих разное количество атомов хлора в орто-, мета- и пара- положениях могут скрываться в их расположенности или устойчивости к ферментативному разложению в организме или периоду полураспада в среде, а так же изначальные количества попавших в среду полихлорированных бифенилов различны, так как объемы их производства не были одинаковыми.

Используя суммарные концентрации непланарных полихлорированных бифенилов для проанализированных образцов, за исключением аномально насыщенного СОЗ «2016-32», построена модель нормального распределения сумм орто-незамещенных ПХБ для исследованной популяции атлантических моржей (Рис. 17).

Рисунок 17.

Нормальное распределение сумм непланарных полихлорированных бифенилов в жире 12 исследованных моржей Примечание: δ - среднеквадратичное отклонение.

В графике нормального распределения (рис. 17) видно, что нормальным для моржей исследованной популяции можно считать значения от 0 до 2682 нг/г, а случаи превышения этого порога могут трактоваться как выходящие за границы нормы. Отсутствующий в расчетах образец «2016-32», чья сумма непланарных ПХБ равна 49704 нг/г, явно не попадает

в зону нормальных значений, что лишний раз указывает на исключительность этого случая.

Планарные полихлорированные бифенилы.

Обнаружение планарных полихлорированных бифенилов проходило по методике, отличающейся от примененной для выявления непланарных. В связи с тем, что механизм воздействия орто-незамещенных ПХБ на организм аналогичен таковому у диоксинов, для каждого образца вычислен диоксиновый эквивалент - показатель суммарной токсичности относительно 2,3,7,8-тетрахлор-дибензо-n-диоксин, известного как диоксин I. Результаты анализа показаны в таблице 4.

Таблица 4. Концентрации планарных полихлорированных бифенилов в образцах жировой ткани моржей за 2015 и 2016 года

Примечание: Погрешность методики составила ±13%.

Жирным шрифтом выделен диоксиновый эквивалент, рассчитанный для образца «2016-32», так как он значительно выше остальных.

По данным, приведенным в таблице 4 видно, что в 2015 году обнаруживалось от 1 до 4 конгенеров планарных ПХБ, а в 2016 - от 5 до 10: в среднем 9 различных соединений.

Выявленные в лаборатории значения диоксиновых эквивалентов превышают многие значения полулетальных доз при острых отравлениях, известных для млекопитающих: мышь - 0,114 нг/г; крыса - 0,02 нг/г; морская свинка - 0,0005 нг/г; хомяк - 1,157 нг/г; кролик -0,115 нг/г; собака 0,001 нг/г; обезьяна - 0,002 нг/г (внутрижелудочно). Диапазон рассчитанных эквивалентов для исследованных моржей колеблется от 0,001 до 0,27 нг/г.

Как и в анализе на непланарные полихлорированные бифенилы, самые высокие концентрации планарных ПХБ относятся к образцу «2016-32».

На диаграмме ниже, представлены суммарные концентрации обнаруженных планарных полихлорированных бифенилов (Рис. 18).

Рисунок 11. Суммарные концентрации планарных полихлорированных бифенилов, нг/г

Предположения о причинах различий в накопленных концентрациях ПХБ у разных моржей одной популяции приведены в разделе обсуждений.

ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам двухлетних исследований уровня содержания полихлорированных бифенилов в жировой ткани моржей, выявлена значительная разница в уровнях концентраций как планарных, так и непланарных ПХБ. К возможным причинам такого различия могут быть отнесены миграции между разными субпопуляциями атлантического моржа или изменения в пищевой базе внутри изучаемой группы особей. Они могут менять точки кормления от года к году, выедая бентос и изменяя его фаунистический состав. Например, увеличение доли ракообразных в рационе, и уменьшение доли моллюсков - находясь на разных трофических уровнях морской экосистемы эти группы бентосных организмов могут аккумулировать разные концентрации стойких органических загрязнителей, в частности полихлорированных бифенилов. Однако, наиболее вероятной причиной, на наш взгляд, является возраст моржа и его индивидуальные трофические предпочтения.

Среди проанализированных за два года образцов жировой ткани моржей выделяется группа с суммарными концентрациями выше 1000 нг/г. В других работах (Muir et al. 1995; Wolkers et. al., 2006) высказывается предположение, что моржи, имеющие сумму ПХБ выше этого уровня, включали в свой рацион других млекопитающих, таких как тюлень. Данные о хищничестве моржа не раз подтверждались наблюдениями и анализами состава жирных кислот (Muir et al. 1995). В данном исследовании, есть пять моржей, суммарные концентрации ПХБ у которых превышают отметку в 1000 нг/г:

«2016-30», «2016-31», «2016-32», «2016-33» и «2016-38». Предположительно, это последствия хищнического образа питания. За 2015 год ни один из образцов не показал подобного результата, что может быть следствием малого объема выборки, а так же тем, что хищничество характерно лишь для небольшого числа особей в популяции.

В других исследованиях также не раз встречались образцы, подобные

«2016-32» - с критически высокими показателями концентраций ПХБ и прочих токсикантов. Например, в работе Skaare et. al. (1994), был обнаружен самец с концентрацией непланарных  полихлорированных  бифенилов порядка 39400 нг/г. Биология вида не исключает хищный образ питания, и возможно это и является причиной проявления  подобных случаев. Вследствие  хищной манеры поведения,  животное занимает положение консумента более высокого  порядка,  приравниваясь к соседям по трофической нише, например - к белым медведям (Ursus maritimus). Однако, морж «2016-32» имеет сумму непланарных ПХБ, равную 29106,6 нг/г, что крайне много даже для белого медведя - согласно Henriksen et. al. (2001), у белых медведей средняя концентрация ПХБ #153 составляет около 5000 нг/г. Концентрации конгенера #168 в образцах определены совместно с #153,

при этом, согласно примечанию лаборатории, в подобных смесях ПХБ #168 - минорный, и составляет порядка 3 % от смеси. При таком соотношении конгенеров в паре, концентрация ПХБ #168 для образца «2016-32», показавшего самые высокие значения, должна быть примерно равна 873 нг/г, что тоже достаточно высоко.

Используя суммарные концентрации непланарных полихлорированных бифенилов в жировой ткани исследованных моржей за 2015 и 2016 годы, было смоделировано нормальное распределение сумм орто-незамещённых ПХБ для данной популяции. График (рис. 17) представлен выше, в разделе результатов исследования. На нем отмечено значение, ограничивающие расчетную норму для содержания непланарных ПХБ в жире моржа - 2682 нг/г. В будущем, любые данные, дополняющие выборку, могут быть оценены с точки зрения нормы уровня концентрации этих токсикантов. Подобный анализ поможет отслеживать общее состояние загрязнения среды полихлорированными бифенилами, опираясь на их содержание в жире атлантического моржа на исследуемой территории, а в связи с его включением в список видов индикаторов состояния арктической экосистемы

- описывать ее благополучие в целом.

Обнаруженные концентрации орто- незамещенных и моно-орто замещенных полихлорированных бифенилов индивидуальны для каждого образца, при этом в 2016 году качественный и количественный состав конгенеров разнообразнее и выше, чем в 2015: вместо ранее обнаруживаемых

конгенеров было найдено в среднем 9. Рассчитанные диоксиновые эквиваленты (TEQ) варьируются от 0,001 до 0,048 нг/г липидов (отдельно выделен образец «2016-32», его TEQ равен 0,27 нг/г). На сегодняшний день мы не располагаем информацией, которая позволила бы интерпретировать обнаруженные уровни токсикантов и описать их влияние на организм моржа, однако известны полулетальные внутрижелудочные дозы для ряда млекопитающих: мышь - 0,114 нг/г; крыса - 0,02 нг/г; морская свинка - 0,0005 нг/г; хомяк - 1,157 нг/г; кролик - 0,115 нг/г; собака 0,001 нг/г; обезьяна - 0,002 нг/г. По-видимому, важны особенности метаболизма диоксиновых ксенобиотиков каждого вида животных, в частности работа ферментативной системы CYP450.

По результатам проведенных анализов жировых проб и выявления концентраций ряда конгенеров полихлорированных бифенилов, видно, что изученные моржи находятся в опасности и имеют высокие накопленные концентрации этих соединений, в частности морж «2016-32». Однако, как показывают наблюдения, популяция находится в нормальном состоянии, моржи репродуктивно здоровы и полноценно функционируют. Видимых нарушений или симптомов отравления вышеуказанными веществами не наблюдается. Ключом к разгадке этого несоответствия, скорее всего, является роль, которую выполняет жир у этих животных. Моржи, как и все арктические морские млекопитающие, имеют большое количество подкожного жира, выполняющего теплоизоляционную функцию. Метаболизму эти жировые запасы подвергаются, предположительно, только в случае голодания моржа. При нормальном доступе к кормовой базе, морж

лишь увеличивает концентрации депонируемых в своей жировой ткани стойких органических загрязнителей, не подвергаясь острому отравлению. Если же ему придется использовать свой жировой запас, то, предположительно, может образоваться кумулятивная доза смеси токсикантов, которая обусловит острое отравление со всеми вытекающими последствиями для конкретной особи. Таким образом, моржи, накопившие в своих жировых запасах большие концентрации токсичных ПХБ и других стойких органических загрязнителей, подвержены большему риску в случае дефицита питания и имеют меньшие шансы на выживание, нежели молодые особи, половозрелые самки или просто самцы, минимально прибегающие к хищничеству.

ВЫВОДЫ

За два года в летних экспедициях на береговое лежбище острова Вайгач собрано 13 образцов жировой ткани взрослых самцов атлантических моржей.

В лаборатории ФГБУ «НПО «Тайфун» Института проблем мониторинга окружающей среды проведен высокоточный анализ собранных проб на выявление состава и уровней планарных и непланарных полихлорированных бифенилов (ПХБ).

Полученные результаты представлены в виде таблиц, произведена статистическая обработка данных с построением диаграмм и графика нормального распределения для непланарных ПХБ.

Атлантические моржи изученной популяции накапливают в жировой ткани различные уровни бифенилов, все обнаруженные конгенеры представлены в разных концентрациях, что говорит о неоднородности их распределения в экосистеме и транспорте в трофических цепях. Предположительно моржи, питающиеся не только бентосными организмами, а отклоняющиеся от типового кормового состава, например, охотясь на тюленей, накапливают значительно более высокие концентрации стойких органических загрязнителей, в частности ПХБ.

Накопленные в жире моржа концентрации токсикантов, предположительно, не оказывают прямого воздействия на его организм, а лишь депонируются в нем. Создание кумулятивной дозы и острое отравление возможны только при прямом попадании веществ в кровь: например при метаболическом использовании жирового запаса. В случае если морж не вынужден использовать теплоизоляционную жировую прослойку для получения энергии, и благополучно насыщается в процессе активного питания, он избегает интоксикации растворенными в его жире ксенобиотиками.

Необходимо продолжать работы по мониторингу и сбору подобного материала в интересах сохранения благосостояния популяции атлантического моржа печорского моря и арктической экосистемы в целом.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Арсеньев В.А. Семейство моржей // Млекопитающие Советского Союза.М., 1976. Т. 2, ч. 3. С. 25-51.

Болтунов А.Н., Беликов С.Е., Горбунов Ю.А., Менис Д.Т., Семёнова В.С. Атлантический морж юго-восточной части Баренцева моря и сопредельных районов: обзор современного состояния. Москва, 2010.

Бурдин А.М., Филатова О.А., Хойт Э. Морские млекопитающие России: справочник-определитель. Киров 2009. стр. 124-127.

Всероссийская конференция по проблеме стойких органических загрязнителей. РФ. Москва. 2002.

Гептнер В.Г., Чапский К.К., Арсеньев В.А., Соколов В.Е.: Млекопитающие Советского Союза, Т.2, Ч.3, М., Высшая школа. 1976.

Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Протокол N2. Полихлорированные бифенилы и трифенилы. Совместное издание Программы ООН по окружающей среде и Всемирной организации здравоохранения, Женева, 1980.

Занавескин Л.Н., Аверьянов В.А. // Успехи химии, 1998, 67 (8), сс. 788-

.

Клюев Н.А., Бродский Е.С. Определение полихлорированных бифенилов в окружающей среде и биоте. Полихлорированные бифенилы. Супертоксиканты XXI века. Инф. выпуск № 5 ВИНИТИ, Москва, 2000, с. 31- 63.

Мартынов Б.И. Стойкие органические загрязнители, Вестник Московского Государственного Областного Университета, 2010, сс. 194-196.

Никулин П.Г. Чукотский морж // Изв. ТИНРО. Владивосток, 1941. Т. 20.С. 21-59.