Характеристика біосинтетичної активності мікробних продуцентів органічних кислот та вплив на неї основних факторів (на прикладі обраної культури)
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ і науки, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ "КПІ"
факультет біотехнології і біотехніки
ДОМАШНЯ КОНТРОЛЬНА РОБОТА
З КУРСУ "ЗАГАЛЬНА БІОТЕХНОЛОГІЯ-1"
Тема: "Характеристика біосинтетичної активності мікробних продуцентів органічних кислот та вплив на неї основних факторів (на прикладі обраної культури)"
Виконала:
студентка групи БТ-91
Шемендюк Олена Віталіївна
Перевірила:
доц. Тодосійчук Т.С.
Київ-2011
Лимонна кислота (СН2 - СООН - СОНСООН - СН2СООН) - трьохосновна оксикислота. Лимонна кислота була ідентифікована в якості продукту метаболізму цвільових грибів в 1893 році Вемером. У даний час ця кислота за обємами виробництва (більше 350 тисяч тонн на рік) займає перше місце серед всіх органічних кислот.
У мікроорганізмів синтез лимонної кислоти реалізується в циклі дикарбонових кислот і здійснюється в результаті конденсації кислоти із чотирма атомами вуглецю і двома карбоксильними групами, і кислоти з однією карбоксильною групою. Утворена в результаті гліколізу піровиноградна кислота звязується з вуглекислотою; синтезована при цьому щавелево-оцтова кислота реагує з оцтовою кислотою з утворенням лимонної кислоти, тобто утворення лимонної кислоти включає реакції гліколізу і ряд реакцій циклу Кребса. При кожному оберті циклу молекула щавелево-оцтової кислоти взаємодіє з оцтовою, утворюючи лимонну кислоту [1].
У промисловому виробництві лимонної кислоти в якості продуцента переважно використовують Aspergillus niger. Процес ферментації досить складний, тому що лимонна кислота - продукт первинного метаболізму грибів, і навіть незначне виділення даного продукту в навколишнє середовище свідчить про виражений дисбаланс клітинного метаболізму.
Ріст продуцента і синтез кислоти зазвичай регулюють складом середовища (цукру, P, Mn, Fe, Zn). Надсинтез лимонної кислоти реалізується при великих концентраціях цукрів у середовищі (14-24 %), що є наслідком реакції продуцента на дефіцит фосфору, а також інших металів, хоча їх роль до кінця не вияснена. Це, мабуть, і порушення анаболізму, і вплив на властивості поверхні і морфологію гіфів [2].
Оптимум рН на стадії кислотоутворення становить 1,7-2,0. У більш лужному середовищі процес зсувається в бік накопичення щавлевої і глюконової кислот. В якості основи середовища зазвичай використовують глюкозний сироп, гідролізати крохмалю або мелясу. Останню попередньо розбавляють до потрібного рівня цукрів і обробляють з метою зниження вмісту металів. Джерелом азоту служать солі амонію (0,2 %), концентрація фосфатів (0,01-0,02 %). Як піногасники використовують природні масла з високим вмістом жирних кислот.
У виробництві лимонної кислоти застосовують кілька варіантів процесу. Поверхневий спосіб реалізується на твердому сипучому середовищі і в рідкій фазі. При рідкофазній поверхневій ферментації поживне середовище розливають в кювети шаром від 8 до 18 см. Кювети розміщують на стелажах у попередньо простерилізованій парами формаліну бродильній камері. Через спеціальні повітроводи з потоком стерильного повітря поверхню середовища засівають вихідною музейною культурою. Як посівний матеріал використовують попередньо отримані і висушені спори (конідії) з розрахунку 50-75 мг конідій на 1 м2 площі кювет [3].
Відомо кілька варіантів процесу: незмінний, незмінний із доливами і метод плівок. При незмінному режимі процес здійснюється на одному середовищі від моменту засіву спор до завершення стадії кислотоутворення. При використанні методу плівок, через 7 діб після завершення кислотоутворення, зброджений розчин меляси зливають з кювет, міцелій промивають стерильною водою і в кювети заливають нове середовище. Незмінний спосіб з доливами характеризується добавками меляси під плівку гриба на стадії кислотоутворення (30-35 % від початкового об'єму), так званий режим з підживленням субстратом. Це дозволяє підвищити вихід лимонної кислоти на 15-20 % з одиниці поверхні при скороченні витрат цукрів на 10-15 % в порівнянні з іншими методами.
В ході стадії ферментації на першому етапі (перші 24-36 год) відбувається інтенсивний ріст міцелію. Температура середовища в цей період стабілізується на рівні 32-34оС, інтенсивність аерації становить 3-4 м3 повітря за год/м міцелію. У період активного кислотоутворення подачу повітря збільшують в 5-6 разів. В результаті більш інтенсивного термогенезу температуру знижують до 30-32°С. У міру зниження процесу кислотоутворення режим аерації стає менш інтенсивним. Контроль процесу ведуть за показниками титруємої кислотності середовища. Процес вважають завершеним при залишковій концентрації цукрів близько 1-2 % і рівні титруємої кислотності 12-20 %. Вміст лимонної кислоти від рівня всіх кислот досягає 94-98 %. Зброджений розчин зливають у приймач і направляють на обробку; промитий міцелій використовують у кормовиробництві [4].
Умови ферментації Aspergillus niger в середовищі з вуглеводами: для виробництва лимонної кислоти потрібна висока концентрація цукру (140-240 г/л). При більш низьких концентраціях накопичується більше щавлевої і менше лимонної кислоти. Asp. niger не використовує сахарозу, але частина її розкладається під час стерилізації. Крім того, гриби містять позаклітинну, зв'язану з міцелієм інвертазу, активну в кислих умовах ферментації, яка каталізує швидкий гідроліз сахарози [5].
Найчастіше в якості джерела вуглецю і енергії використовують цукрову або очеретяну мелясу або сахарозу, картопляний крохмаль, гідролізати крохмалю, глюкозний сироп. Якщо використовують крохмаль, то його гідролізують власні амілази гриба або ті, які додаються ззовні [2].
Новий штам Aspergillus niger ВКПMF - 696 - продуцент лимонної кислоти, отриманий в процесі селекції із штаму, що зберігається в музеї ВНІІ ПАКК. Штам ВКПMF - 696 утворює округлі, конідії кремового забарвлення, середнього діаметру 3,8 мкм, стеригми двошарові довжиною 12,5 мкм і 6,8 мкм. Активно ферментує сахарозо-мінеральні поживні середовища та середовища, отримані в результаті гідролізу крохмалю. Володіє стійкою активністю кислотоутворення і стабільно високим (82,2-90 %) виходом лимонної кислоти від цукру протягом 12 місяців зберігання штаму [6].
У мелясі міститься близько 48-50 % сахарози, але також велика кількість зольних елементів. Мелясу розбавляють слабкою сірчаною кислотою до концентрації 15-20 % цукру, рН встановлюють 5,5-6,5. Перед стерилізацією меляси її обробляють гексаціанофератом Са або катіонними обмінниками для видалення металів [7].
Селекціонований штам Aspergillus niger ВКПМF - 719 володіє високою активністю утворення лимонної кислоти при глибинному культивуванні на середовищах зі згущеного соку сорго, утворюючи 18,0 - 18,7 г/дм3 на добу лимонної кислоти. При цьому конверсія цукрів поживного середовища в лимонну кислоту складає 79,2-80,1 % [8].
Як джерело азоту використовують солі амонію (2-2,5 г/л), переважно (NH4) 2SО4; його утилізація супроводжується зниженням рН середовища нижче 2,0, що необхідно для синтезу лимонної кислоти.
Фосфор - важлива поживна речовина, що має значення в регуляції синтезу лимонної кислоти. Якщо підтримується ліміт металевих іонів, то ефект Р мало виражений, в протилежному випадку ліміт по фосфору дає хороший ефект. При високій концентрації фосфору акумулюється багато цукрових кислот замість лимонної.
Якщо вміст мікроелементів збалансований, то інші фактори (концентрація цукру, Р та ін) проявляють незначні ефекти. Asp. niger вимагає для росту всі мікроелементи, але ліміт за деякими, особливо для глибинної ферментації, має критичне значення. Певний вплив мають іони Zn, Fe і Мn. Останній в концентрації 3 мг/л сильно знижує вихід лимонної кислоти. Іони Сu служать противагою не Fe-іонам, як раніше вважали, а Mn-іонам. Сu служить інгібітором поглинання, який вважається критичним металом і діє на рівні синтезу білка. Для максимального синтезу цитрату достатньо 0,05 - 0,2 ppm Fe. Zn2+ виконує регулювання процесу ферментації (1 ppm = 10-12 М). При концентрації 1-2 мкмоль він сприяє проходженню ростової фази, але при концентрації менше 1 мкмоль обмежує ріст. Додавання Zn2+ в надлишку до культури, яка продукує цитрат, обертає ферментацію в першу фазу. Вважають, що дефіцит Zn2+ служить сигналом для культури про перехід з ростової фази в продуктивну. Припускають також, що Zn2+ має непряме значення для функціонування циклічного AMP (сАМР). Якщо додавання сАМР під час виробничої фази посилює утворення цитрату, то внесення Zn2+ затримує синтез кислоти. Велика частина лимонної кислоти утворюється клітинами, що не ростуть [1].
У період ідіофази значення рН потрібно підтримувати нижче 2,0, щоб пригнітити утворення щавлевої і глюконової кислот. Остання утворюється під дією глюкозооксидази, активність якої збільшується при підвищенні рН > 4,0, але при рН < 2,0 фермент інактивується. Під час трофофази початковий рН ~ 5,0 [3].
Новий штам гриба Aspergillus niger ВКПМF - 718 - продуцент лимонної кислоти з високою активністю кислотоутворення. Використання нового штаму у виробництві лимонної кислоти дозволяє вести процес при більш низьких значеннях pH середовища, що істотно знижує ризик виникнення інфекції в середовищі, при цьому вихід лимонної кислоти зростає в середньому на 10 %. Крім того, штам адаптований до ферментації в безперервному режимі [9].
Аерація має критичне значення для глибинної ферментації. Пропускання чистого О2 збільшує утворення лимонної кислоти, але це дорого; газова фаза може рециркулювати, якщо при цьому поглинається СО2. Переривання аерації на короткий час може мати згубний вплив на синтез лимонної кислоти, але якщо при цьому підвищити рН з 3,0 до 4,0, то ферментація може розпочатися знову [3].
Гексаціаноферат (HCF) підтримують у розчині в невеликому надлишку. При цьому він не тільки зв'язує іони металів, а й дещо обмежує ріст гриба. Зазвичай вносять 10 - 200 мг HCF на один літр у залежності від якості та сорту сировини і проводять обробку гарячого розчину. Занурена культура Asp. niger менш стійка до HCF, ніж поверхнева.
Поряд з Сu2+ і HCF нижчі спирти - метанол, етанол, n-пропанол, ізопропанол і метилацетат в концентрації від 1 до 5% - відносять до важливих добавок середовищ, виготовленних з природньої сировини [2].
Новий штам гриба Aspergillus niger ВКПМ F - 722 - продуцент лимонної кислоти, який здатний синтезувати лимонну кислоту з 80 % виходом від етилового спирту, що міститься в середовищі, 110 % - вим від суміші етилового спирту і сахарози. Використання штаму дозволяє застосовувати в якості вуглецевовмісного субстрату цукровмісні середовища з підвищеним вмістом етилового спирту [10].
Природні масла, особливо ті, які містять багато ненасичених жирних кислот, сприяють збільшенню виходу цитрату. Жири часто використовують як антиспінювачі. Під час ферментації рекомендують підтримувати 0,05 - 0,3 % жирних кислот.
Перекис водню стимулює утворення лимонної кислоти, очевидно, за рахунок збільшення О2 в середовищі при своєму розкладанні. Крім зазначених сполук стимулюючу дію на вихід лимонної кислоти грибами надають 4-метил-беліферон, четвертинні амонійні основи, аміноксими, крохмаль, ЕДТА, ПАРи, вермикуліт [4].
Новий штам продуцент лимонної кислоти - Aspergillus niger BKPM F - 681. Штам отриманий шляхом селекції, має чорне забарвлення колоній, конідії діаметром 3,4 - 4,6 мкм. Відрізняється високою продуктивністю біомаси, утворює 11,8 - 18,7 г лимонної кислоти на 1 г повітряно-сухого міцелію [11].
Типовий склад основного середовища для синтезу цитрату Asp. niger наступний: загальна кількість редукуючих цукрів (меляса, сахароза) - 14-15 %; джерело N - 0,25 %; КН2РО4 - 0,10-0,15 %; MgSО4∙7H2О - 0,02-0,25 %; рН: мелясні середовища - 5,0-6,0, сахарозні середовища - 2,0-3,0 [5].
лимонна кислота синтез ферментація
Список використаної літератури
. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология / Л.И. Воробьева. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 294 с.
. Карклиньш Р.Я. Биосинтез органических кислот / Р.Я. Карклиньш, А.К. Пробок - Рига, 1972. - 278 с.
. Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. - 264с.
. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов по спец. "Микробиология" и "Биология" / З.А. Аркадьева, А.М. Безбородов, И.Н. Блохина и др. / Под ред.Н.С. Егорова. - М.: Высш. шк., 1989. - 688 с.
. Пат. 2078810 Россия, МПК C 12 N1/14, C 12 P7/48, C 12 N1/14, C 12 R1: 685. Штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты / Щербакова Е.Я., Никифорова Т.А., Галкин А.В., Жданова В.Н., Финько В. М.; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей. - № 94031050/13; заявл.02.08.94; опубл.10.05.97.
. Биосинтез лимонной кислоты дрожжевыми организмами / С.В. Камзолова, А.Р. Фатыхова, И.Г. Моргунов // Биотехнология. - 2008. - №5. - С.50-58.
. Пат. 2088658 Россия, МПК C 12 N1/14, C 12 P7/48, C 12 N1/14, C 12 R1: 685. Штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты / Красикова Н.В., Никифорова Т.А., Галкин А.В., Финько В.М., заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей. - № 95116715/13; заявл.27.09.95; опубл.27.08.97.
. Пат. 2091485 Россия, МПК C 12 N1/14, C 12 P7/48, C 12 N1/14, C 12 R1: 685. Штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты / Авчиева П.Б., Яшина В. Н.; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ. - № 95116989/13; заявл.21.09.95; опубл.27.09.97.
. Пат.2103346 Россия, МПК C 12 N1/14, C 12 P7/48. Штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты / Винаров А.Ю., Сидоренко Т.Е., Сметанина С.Е., Яшина В. Н.; заявитель и патентообладатель Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ. - № 96113685/13; заявл.27.06.1996; опубл.27.01.1998.
. Пат. 2089615 Россия, МПК C 12 P7/48, C 12 N1/14, C 12 N1/14, C 12 R1: 685. Штамм гриба Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты / Щербакова Е.Я., Никифорова Т.А., Галкин А.В., Жданова В. Н.; Мушникова Л. Н.; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей. - № 93048665/13; заявл. 21.10.93; опубл. 10.09.19.