Определение степени влияния полиморфизмов на продолжительность функционального долголетия скота

Определение степени влияния полиморфизмов на продолжительность функционального долголетия скота

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

LEP - ген лептина;- рецептор гена лептина;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов;

П.н. - пар нуклеотидов;

МГМ - молекулярно-генетические маркеры;- однонуклеотидный полиморфизм;(short interspersed nuclear elements) - короткие нуклеотидные мобильные элементы, содержащие ретроэлементы;(long interspersed nuclear elements) - длинные нуклеотидные элементы, содержащие ретроэлементы

РЕФЕРАТ

Данная работа выполнена на 32 листах машинописного текста. Содержит две таблицы и два рисунка. Для выполнения данного исследования было использовано 30 литературных источника.

КРУПНЫЙ РОГАТЫЙ СКОТ, БЫКИ-ПРОИЗВОДИТЕЛИ, ГЕНОТИПИРОВАНИЕ, ПОЛИМОРФИЗМ, ГЕН ЛЕПТИНА, ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ, ПОЛИМОРФИЗМ ДЛИН РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ

Повышение продуктивности молочного скота и увеличение продолжительности жизни высокопродуктивных, высококлассных коров является одной из важных задач сельскохозяйственного производства.

Целью данного исследования является разработка системы подбора быков-производителей к стаду крупного рогатого скота с использованием генетического маркера LEP, таким образом, чтобы у потомства получить генотипы, коррелирующие с полезными качествами животных.

Результаты данного исследования показали,что такие полиморфизмы гена лептина как: LEP-R25C, LEP-A80V, LEP-Y7F, оказывают существенное влияние на функциональное долголетие и другие полезные признаки крупного рогатого скота.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

. Аналитический обзор

.1 Характеристика проблемы продуктивного долголетия скота

.2 Характеристика айрширской породы скота

.3 Метод подбора быков к стаду. Метод оценки быков производителей

.4 Молекулярно-генетические маркеры. Характеристика некоторых видов молекулярно-генетических маркеров

.5 Генетические маркеры долголетия крупного рогатого скота

.5.1 Характеристика гена лептина

.5.2 Структура белка лептина и его физиологические функции у крупного рогатого скота

. Методы исследования молекулярно-генетических маркеров

.1 Полимеразная цепная реакция

.2 Полиморфизм длин рестрикционных объектов

Заключение

Список использованных источников

ВВЕДЕНИЕ

Скотоводство в России является ведущей отраслью животноводства. По численности поголовья крупного рогатого скота Россия занимала одно из первых мест в мире. В связи с этим, углубленное изучение биологии сельскохозяйственных животных становится решающим фактором развития отрасли в перспективе. Следует отметить, что Россия обладает огромным генофондом животноводства. На базе этого многообразия с использованием мировых генетических ресурсов стало возможным создание отечественных пород с высоким потенциалом продуктивности и приспособленностью к конкретным природно-климатическим условиям.

Но на сегодняшний день так же остро стоит проблема увеличения продуктивного и племенного использования животных.Увеличение срока их жизни приобретает все большее значение, так как срок хозяйственного использования животных с наивысшим генетическим потенциалом сократился до 3-х лактаций. В следствие чего, такое относительно раннее выбытие коров увеличивает себестоимость продукции из-за повышения доли затрат, направленных на выращивание молодняка.

Достижения современной молекулярной генетики позволяют исследовать гены, связанные с полезными признаками крупного рогатого скота. В последние несколько лет огромное значение для оценки генома животных приобретают молекулярно-генетические методы, входящие в систему биотехнологии. Определение аллельных вариантов генов позволяет изучать наследственность на уровне ДНК.

Это, прежде всего, обеспечило абсолютную точность происхождения животных, что важно для селекции, определять наличие ценнейших вариантов генов, связанных с селекционируемыми признаками, и, наконец, определить наличие вредных мутаций, находящихся в гетерозиготном состоянии, наличие которых невозможно определить по фенотипу. А это стало особенно важно в условиях крупномасштабной селекции, когда от одного быка-производителя получают многие тысячи потомков.

В качестве потенциальных маркеров молочной и мясной продуктивности крупного рогатого скота могут рассматриваться аллели гена лептина (LEP). Полагают, что лептин может быть ключевой сигнальной молекулой, связывающей питание с репродуктивной функцией. Также известно влияние гена лептина на продуктивное долголетие крупного рогатого скота.

Таким образом, изучение генетических маркеров, определяющих факторы продуктивности и долголетия скота, позволит, во-первых, понять степень их влияние на функциональное долголетие, а, во-вторых, путем усиления или ослабления этих факторов, улучшить показатели признака.

Целью данного исследования является анализ данных российских и зарубежных исследований в области функционального долголетия крупного рогатого скота и разработка метода подбора быков к коровам так, чтобы получить потомство, имеющее не только высокую продуктивность, но и как можно больший срок хозяйственного использования.

Задачами исследования являются:

) выявление влияния полиморфизма гена лептина на функциональное долголетие скота;

) поиск единичных нуклеотидных полиморфизмов данного генетического маркера;

) определение мест их локализации в гене лептина;

) определение степени влияния полиморфизмов на продолжительность функционального долголетия скота.

полиморфизм скот генетический лептин

. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

.1 Характеристика проблемы продуктивного долголетия скота. Период продуктивного использования

Продуктивное долголетие выражается количеством дней между рождением и смертью крупного рогатого скота и является чертой, имеющей большое значение и для человека, и для популяций животных. Время использования коровы складывается из двух производственных циклов: выращивания - от рождения до первого отела и продуктивного использования - от первого отела до выбытия (цикл воспроизводства).

От продуктивного долголетия коров зависят размер пожизненной продуктивности, количественный и качественный рост стада, таким образом, этот показатель оказывает значительное влияние как на экономику отрасли, так и на эффективность селекционной работы со стадом и породой животных в целом. В условиях интенсификации молочного скотоводства, с ростом продуктивности коров наблюдается заметное снижение продолжительности хозяйственного использования животных. В настоящий момент показатель продолжительности использования коров находится в пределах трех лактаций. В то же время биологические возможности продуктивного использования коров составляет от десяти до двенадцати лактаций.

При длительном использовании скота процесс воспроизводства стада происходит с меньшими производственными затратами. Экономическая эффективность использования сельскохозяйственных животных складывается из разницы расходов на выращивание, кормление, уход за ними и доходов от реализации племенного молодняка, молока и мяса. Исследования, показали, что, только начиная с пятой лактации коровы оправдывают материальные затраты на их выращивание до вступления в производящее стадо. При длительном использовании животных от них получают больше приплода, молока за всю жизнь и в среднем за один год. К тому же коровы с длительным продуктивным использованием, как правило, отличаются хорошей на протяжении всей жизни продуктивностью, крепостью конституции и здоровья, устойчивостью к заболеванию конечностей и нарушениям обмена веществ.

Также установлено, что на каждую единицу корма, потребляемого с момента рождения, корова с возрастом даёт больше молока [Дмитриев, 1969].А также чем продолжительнее срок использования животных, тем большее число дойных дней приходится в среднем на каждый год жизни коровы [Маркушин, 1983]. Следовательно, чем дольше корова будет находиться в стаде, тем более рентабельнее будет произведенное ею молоко.

На варьирование уровня признаков продуктивного долголетия у коров наибольшее влияние оказывает индивидуальная наследственность их отцов. Дисперсионный анализ, проведенный по тринадцати быкам, показал, что сила влияния наследственности быков-производителей на продолжительность жизни дочерей составляет 44,0 %, на их пожизненный надой - 39,0 %. Отсюда следует вывод о том, что производители в большей степени влияют на долголетие коров, чем их линейная принадлежность.

Проведены исследования по выявлению численности, возраста и уровня продуктивности коров, выбывших по четырем основным причинам, которые связанны с основной их продуктивной деятельностью - производством молока и получением приплода, то есть нарушение воспроизводительной функции, заболевание вымени и конечностей, нарушение обменных процессов. Выявлено, что в более раннем возрасте (две, три лактации) выбывают из стада коровы из-за нарушения воспроизводительной функции и заболевания вымени, в связи с чем прибыльность этих животных составляет от 10,5% до 9,1%, а выбывших попричине заболевания конечностей и нарушения обмена веществ -от 12,3 %до 14,6 %.

1.2 Характеристика айрширской породы крупного рогатого скота

Айрширская порода крупного рогатого скота была выведена в Шотландии, в графстве Айр, который известен влажным и довольно суровым климатом. Айрширская порода была создана путем скрещивания местного скота вначале с тисватерским и шортгорнским, а затем с альдернейским, джерсейским, гернзейским и голландским [Дмитриев, 1969].

Как считает большинство исследователей, наибольшее влияние на формирование айрширской породы оказал голландский скот. Как самостоятельная Айрширская порода была оформлена в 1862-м году. Благодаря высоким хозяйственным качествам айрширский скот стал широко распространён не только на своей родине, но и далеко за ее пределами.

Айрширский скот имеет красно-пёструю масть, у которой варьирует соотношение количества белых и красных пятен. Отличительными признаками животных данной породы являются: сухая и крепкая конституция, правильное пропорциональное телосложение при средней живой массе, высокая жирномолочность (стандарт породы 4,2), симметрично вместительное вымя, пригодность к двукратному доению.

Живая масса коров 450-500 кг, в лучших хозяйствах - 550-570 кг,

а быков - 800 кг; масса некоторых коров может достигать 700 кг,

а быков - 1000 кг. Первый раз осеменение телок происходит в возрасте 15-17 месяцев, когда их живая масса достигает 350-360 кг. Телята при рождении весят 25-30 кг, в возрасте 12 месяцев - 240-280 кг.

На сегодняшний день айрширскую корову относят к скороспелым породам, поскольку первый отел может проходить в возрасте 24-26 месяцев. Молочная продуктивность коров высокая. По последним данным за весь период лактации одна особь в среднем дает около 5-6 тысяч килограмм жирного высококачественного молока. А в некоторых хозяйствах, при хорошем кормлении и содержании, за лактацию коровы дают 6000-7000 кг молока жирностью 4,2-4,3%, содержание белка в молоке составляет 3,4-3,5%. На Кубани же средняя продуктивность айрширских коров (по данным бонитировки за 2011 год) составляет 5590 кг, содержание жира - 3,97%. Что касается мясной продуктивности, то она у айрширов удовлетворительная, убойный выход у бычков в полуторагодовалом возрасте - 50-55%.В таблице 1 представлена динамика продуктивности айрширского скота.

Таблица 1 - Продуктивность коров айрширской породы в РФ

Все вышеперечисленные качества айрширской породы молочного скота ставят их в ряд лучших специализированных молочных пород мира.

1.3 Метод подбора быков к стаду. Метод оценки быков производителей

Важнейшей задачей племенного животноводства является генетическое совершенствование разводимый пород, что включает в себя выявление лучших генотипов и их максимальное использование в производстве.

Формирование генетического потенциала продуктивности молочного скота находится под влиянием таких факторов как используемые в репродукции стада быки-производители, интенсивность выбраковки худших по селекционным признакам, закупка более ценных коров и тёлок, приобретение эмбрионов для воспроизводства стада;

Использование последних двух факторов ведёт к быстрому и значительному росту генетического потенциала популяции. Однако при этом требуются значительные материальные средства.

Что касается первых двух факторов то, быки-производители и интенсивность отбора маточного поголовья по селекционным признакам являются постепенными в улучшении качеств разводимого скота, но в итоге их результативность оказывается более значительной.

Таким образом, основная роль в совершенствовании племенных и продуктивных качеств молочного скота принадлежит быкам-производителям, сперма которых используется в воспроизведении стада. Поэтому, чем тщательнее проведён отбор быков, точнее установлена их племенная ценность и качественнее осуществлён подбор быков отцов к маточному поголовью, тем эффективнее будет развиваться скотоводство.

Что касается отечественного молочного скотоводства, то здесь основной задачей является повышение его конкурентоспособности. Как товарной части отрасли, так и её племенной части. В целом племенное поголовье России уступает в продуктивности коровам селекционеров в Германии по удою - 2622 кг, жирномолочности - 0,20% и белковомолочности-0,26%. Следовательно, главной целью селекционно-племенной работы животноводства в России является становление отечественного скота конкурентоспособным. А для достижения намеченного необходимо определить направление селекционно-племенной работы с крупным рогатым скотом, также основные признаки и параметры, по которым животные будут выбираться в различные селекционные группы.

Поэтому для молочного скота в качестве основных признаков отбора животных определены: удой, содержание белка, содержание жира, экстерьер.

В России разработана и осуществляется целая система мероприятий по племенной работе. Отбор быков-производителей начинается с анализа происхождения, в котором изучается генетическая оценка отцов и отцов отцов. При чём производителями могут быть исключительно лидеры пород, признанные улучшателями не только продуктивности, но и типа телосложения дочерей, вымени и конечностей. Не менее важны показатели генетической ценности отцов, которые должны быть более высокими, чем отцов отцов. Матери же производителей должны отличаться превосходным типом телосложения. Они также оцениваются в движении, и после прохождения данного теста осуществляется их отбор в качестве матерей быков-производителей. Характеристика этих животных должна составлять:

) молочная продуктивность не менее 10 тыс. кг;

) содержание жира 4,00% и более;

) содержание белка 3,20% и выше.

Отобранные таким образом быки отцы не уступают производителям племпредприятий зарубежных стран с развитым молочным скотоводством.

Учитывая, что главной задачей животноводства нашей страны является повышение экономической эффективности отрасли, нельзя не обратить внимание на такой показатель сельскохозяйственных животных как продуктивное долголетие. Увеличение срока использования скота можно добиться путём улучшения кормления и условий содержания скота, повышением его стрессоустойчивости и устойчивости к инфекционным заболеваниям. А интенсивный отбор разводимого молочного скота на увеличение удоя и улучшение качественных характеристик молока ведёт к уменьшению периода продуктивного использования в связи с уменьшением срока жизни крупного рогатого скота, что может вызывать увеличения финансовых затрат на содержание нерентабельного скота.

У крупного рогатого скота за иммунный ответ на воздействие патогенов и стресс, за воспроизведение, регуляцию энергетического гомеостаза организма в целом несёт ответственность продукт гена лептина, локализованный в четвёртой хромосоме. Он интересен для селекции тем, что во многом определяет молочную продуктивность скота, содержание компонентов в молоке (белка и жира), и что не менее важно он связан с продуктивным долголетием сельскохозяйственных животных.

Поэтому было бы целесообразно для осуществления отбора быков-производителей к стаду коров использовать информацию о полиморфизмах гена лептина в качестве дополнения к традиционно учитываемым данным. Таким образом было бы эффективно закрепить быков-производителей, имеющих в генотипе локус, ответственный за какой-либо полезный признак, за коровами и телками не имеющих в своём генотипе такого локуса.

Но сведения о генотипе по гену лептина актуальны на заключительном этапе подбора быков-производителей. И учитывая информацию о полиморфизме этого гена быки при оценке по качеству потомства имеют возможность аттестоваться по племенной категории (А, Б). Исходя из этого подход к вопросу подбора производителей к маточному поголовью только способствует повышению продуктивности и срока хозяйственного использования животных в стаде.

А что касается мировых тенденций в селекции быков-производителей, там основными селекционными группами животных являются группы быков-производителей. Они представляют собой минимально необходимое число животных с наивысшим индексом племенной ценности. Практически во всех странах мира для формирования групп отцов быков и отцов коров принята трёхступенчатая система оценки, в которую входит отбор по собственной продуктивности (рост и развитие); отбор по воспроизводительным качествам; отбор по результатам оценки по качеству потомства.

В основу современных методов оценки в мировой практике положен метод наилучшего линейного несмещённого прогноза (BLUP), который разработал Хендерсон [Henderson, 1984]. В странах с развитым животноводством на основе BLUP-оценок по отдельным селекционным признакам строится селекционный индекс, который состоит из отдельных характеристик племенной ценности и выступает как единый показатель.

Такие индексы племенной ценности могут содержать как показатели продуктивности и параметры оценки типа телосложения животных, так и показатели резистентности к заболеваниям (в первую очередь, к маститу) оценку продолжительности использования животных и ряд других. Однако, коэффициенты составляющих их признаков продуктивности существенно разняться. Таким образом, в Канаде, США, Дании, Германии, Франции, Венгрии, Швеции, Швейцарии и др. в селекционный индекс не входит показатель по удою, принятому в России. В ряде других стран (Австралия, Бельгия, Дания, Ирландия, Нидерланды) племенная ценность животных по количеству надоенного молока в селекционном индексе принимается как отрицательный фактор. Различные показатели селекционного индекса имеют своё значение в разных странах, что обусловлено спецификой экономической ситуации в том или ином государстве. Большинство из селекционеров развитых стран, имея стада с высоким потенциалом по удою, искусственно сдерживают возможности животных к проявлению высокой обильномолочности. При совершенствовании стад основное внимание фермеров переориентировано на улучшение качественных показателей молока (а не количественных), а также снижению издержек при его производстве за счет увеличения продуктивного долголетия скота, повышения воспроизводительных качеств животных, совершенствования экстерьерных показателей (вымя, конечности, общий молочный тип).

Из этого следует что лучшие животные в одной стране далеко не всегда будут лидерами в другой стране. В целях решения этой проблемы была создана международная сервисная организация «Interbull». В которую внедрены системы конвертирования индексов племенной ценности животных в одной стране для условий другой страны. К сожалению, России не удалось стать полноценным членом «Interbull», так как в нашей стране недостаточно развита инфраструктура ведения племенного дела, что обусловливает невозможность оценки селекционно-генетичесих параметров целых популяций крупного рогатого скота России. В связи с этим приобретение импортной генетики на основе значений селекционных индексов, присвоенных за рубежом, для условий России является совершенно не приемлемо, что требует переустройства структуры управления племенными ресурсами животных в корне.

.4 Молекулярно-генетические маркеры

Молекулярные маркеры (МГМ) - это генетические маркеры, анализируемые на уровне ДНК. К молекулярным маркерам наравне с классическими генетическими применяют термины «локус», «аллель», «доминантный», «кодоминантный».

Имеется ряд современных технологий выявления полиморфизма на уровне ДНК. Наиболее эффективной является технология с использованием «микрочипа» на основе полиморфизма по единичному нуклеотиду-SNP.

Генетический полиморфизм - это изменения в нуклеотидной последовательности ДНК маркера, которые возникают вследствие различных мутаций (точечные мутации, инсерции, делеции и или какие-либо другие перестройки хромосом). Формы проявления генетического полиморфизма получили название аллелей. Чем больше число аллелей, тем больше проявляется полиморфный характер данного локуса. Использования локуса в качестве возможного генетического маркера даёт наличие двух и более аллелей.

Повышение доступности использования молекулярных маркеров сельскохозяйственных животных позволяет провести подробный анализ и оценку генетического разнообразия скота. Что позволяет выявить гены, влияющие на экономически важные признаки сельскохозяйственных животных. Большинство молекулярных маркеров, используемых в настоящее время, являются микросателлитными маркерами (простые тандемные повторы, STR).

Кроме того, в рамках исследования разнообразия и филогении животных используются специфические маркеры митохондриальной ДНК и Y хромосомы для идентификации материнских и отцовских линий. До недавнего времени микросателлиты использовались для отображения локусов количественных признаков и функциональных признаков у сельскохозяйственных животных [Hiendleder, 2003]. Они являются необходимым условием для идентификации позиционных и функциональных генов-кандидатов, ответственных за количественные признаки.

Наиболее часто используемые МГМ подразделяют на следующие типы:

) маркеры участков структурных генов, кодирующих аминокислотные последовательности белков;

) маркеры, не кодирующих участков структурных генов;

) маркеры различный последовательностей ДНК, отношение которых к структурным генам неизвестно- распределение коротких повторов по геному (Случайно амплифицируемая полиморфная ДНК, инвертированные повторы, полиморфизм в сайтах рестрикции);

) микросателитные локусы (тандемные повторы с длиной элементарной единицы в 2-6 нуклеотидов).

В популяционно-генетическом анализе используются только полиморфные генетические маркеры. При выборе МГМ для исследований должен учитываться как уровень сложности процесса генотипирования, так и их информативность, включая геномную локализацию, эволюционную нейтральность изучаемых мутаций и количество аллельных вариантов.

С точки зрения информативности можно разделить все типы полиморфных маркеров на биаллельные (большинство SNP, indel) и мультиаллельные (микросателлитные повторы).

Характеристика некоторых видов молекулярно-генетических маркеров.

По данным исследований функциональной геномики однонуклеотидные замены в интронах гена очень часто влияют на экспрессию, тем самым, изменяя такие характеристики белка, как третичную структуру, стабильность связывания с субстратом и промежуточными метаболитами, посттрансляционную модификацию. В следствии чего функциональные характеристики белков имеют способность меняться от практически нейтрального эффекта генетического полиморфизма до полного нарушения функции соответствующего белкового продукта.

Рисунок 1 - Различие двух молекул ДНК в гомологичных участках

Большинство SNP локализованые в некодирующих участках гена являются, как правило, неопасными для организма и стабильными заменами. Однонуклеотидные замены, располагающиеся в экзонных частях генома и не приводящие к заменам аминокислот в кодируемых белках, называются синонимичными. Несинонимичные SNP изменяют аминокислотную последовательность белка. SNP могут влиять на промоторную активность, изменять конформацию ДНК или пре-мРНК, влияя тем самым на уровень транскрипции генов и эффективность сплайсинга.

В настоящее время полиморфные локусы широко используются в медицинской генетике в качестве маркеров генетических заболеваний. Полиморфные маркеры применяются для установления отцовства и других видов родства, а также для идентификации личности в криминалистике.

Повторяющиеся последовательности.

Существенно больший объем генома приходится на нейтральные повторяющиеся последовательности, таковыми являются - тандемные и диспергированные.

Тандемные повторы.

К тандемным принадлежит сателлитная ДНК, которая составляет от 10 до 20% генома млекопитающих. Располагается такая ДНК в функционально неактивной области [Беридзе, 1982] и сохраняют упорядоченную структуру.

К тандемным повторам прежде всего относятся микросателлиты - STR (ShortTandemRepeats) и VNTR (VariationsintheNumberofTandemRepeats). ДНК-микросателлиты- повторяющиеся фрагменты геномной ДНК, не несущие кодирующих функций, на долю которых приходится до 30% всего генома сельскохозяйственных животных. Высокополиморфный характер и менделевский тип наследования делают их исключительно информативными для оценки генетического разнообразия популяций.

Микросателлиты - тандемные повторы из нескольких нуклеотидов (обычно от двух до шести). Повторы, включающие в себя десять и больше нуклеотидов, как правило, относят к минисателлитам. Микросателлиты обнаруживаются как в нетранскрибируемых, так и транскрибируемых участках ДНК.

Микросателлиты могут различаться по строению. Они могут состоять из однотипных последовательностей (N1N2…N3), либо из нескольких мотивов последовательностей (CA)n(GT)n. Составные микросателлиты между повторами содержат вставочные последовательности «спейсеры», (GA)n(N)n(CT)n.

Диспергированные повторы.

Диспергированные короткие и длинные повторы (ретропозоны), которые рассеянны по геному в виде отдельных копий, повторяющиеся с частотой 10-10⁴ копий на геном, известны, соответственно, как SINEs и LINEs.- это ретропозоны размером 3-7 т.п.н., которые транскрибируются РНК-полимеразой II. Они составляют не менее 10% генома. LINEs млекопитающих подвергаются амплификации, в ходе которой большое множество копий этих элементов распределяются по геному. Эта амплификация может быть обнаружена и датирована. Поскольку структура длинных ретропозонов изменяется со временем, LINEs больше всего подходят для изучения тех событий в эволюции млекопитающих, которые произошли не более 25-50 млн. лет назад.короткие ретропозоны длиной 80-400 п.н., число копий на геном варьирует от 10*3 до 10*5. SINEs транскрибируются РНК-полимеразой III, а образующиеся низкомолекулярные РНК, видимо, путём обратной транскрипции, дают в некоторых случаях новые копии SINEs.

Наличие в геноме семейства SINEs может служить надежным маркером эволюционного древа. Это объясняется тем, что, однажды возникнув в стволовой линии, семейство SINEs передается всем последующим ветвям этого древа [Крамеров, 1980; Крамеров, 1987; Shimamura, 1997; Serdobova,Kramerov, 1998; Kramerov, 1999; Nikaido, 1999; Shedlock, Okada, 2000].

.5 Генетические маркеры долголетия крупного рогатого скота

Лимитирующим фактором, определяющим эффективность молочного скотоводства, является функциональное долголетие коров, так как оно непосредственно влияет на пожизненный удоймолока и количество приплода. От этого показателя зависит возможность проведения выбраковки низкопродуктивного поголовья и реализация племенных животных.

Наибольших успехов в поиске главных генов, корелирующих с функциональным долголетием, добилась группа польских ученых, возглавляемая Д. Сцида [2011].

Результатами их исследований стали данные, свидетельствующие о том, что полиморфизм имеющий наибольший эффект на функциональное долголетие это LEP-R25C, для которого относительный риск выбраковки коров с генотипом СС в 3,14 раза выше, чем для гетерозиготных животных. Также риск выбраковки FF гомозигот имеющих полиморфизм LEP-Y7F в 3,64 раза выше, чем у животных с генотипом YY. А для VV гомозигот с полиморфизмом LEP-A80V в 1,83 раза выше риск выбраковки, чем АА гомозигот. Также показано влияние LEP-A80V полиморфизма на продолжительность хозяйственного использования и уровень рентабельности животных.

Группой российских учёных было установлено, что у генотипированных айрширов отсутствует полиморфизм аллелей SNP A80V. Однако аллель F (сайт Y7F)достаточно распространен, причем, частота встречаемости гомозиг по этому аллелю у взрослых животных очень низкая, что может свидетельствовать о сниженной жизнеспособности животных с генотипом FF (таблица 2). Кроме того, установлено, что генотип СС (сайт R25C Т→С) встречается сцеплено с генотипом YY (сайт Y7F), а генотип FF (сайт Y7F) встречается в сочетании с генотипом RR (сайт R25C). Следовательно, при подборе быков-производителей надо учитывать генотип по локусу лептина(SNP: R25C, Y7F) таким образом, чтобы не допускать возможного появления в потомстве сочетаний CCYF, ССFF и RCFF, так как, вероятнее всего, они элиминируются на определенных стадиях онтогенеза. Например, нельзя на потомках быка с генотипом СCYF использовать быка с генотипом RRFF, предпочтительнее в этом случае будет бык с генотипом RRYY.

В нижеследующей таблице показана частота встречаемости генотипа определенных однонуклеотидных полиморфизмов среди группы долгоживущих быков айршиской породы. Генотипы, которые встречаются чаще других в данной группе животных являются генетическими маркерами, коррелирующие с долголетием крупного рогатого скота.

Таблица 2 - Частота встречаемости генотипов лептина в группах животных айрширской породы

Выявленные закономерности должны использоваться при подборе быков-производителей к маточному поголовью, если задачей служит получение потомства с длинным сроком продуктивного долголетия.

.5.1 Характеристика гена лептина. Его структура и влияние полиморфизма у крупного рогатого скота

Ген лептина кодирует белок, длина которого составляет 167 аминокислот, и в основном, синтезируется в белой жировой ткани [Zhang, 1994]. Ген лептина, ранее известный как ген ожирения, был впервыеописан у мышей с помощьюпозиционного клонирования и показано, что он имеется у различных видов позвоночных, включая крупный рогатый скот [Zhang, 1994].

Также было доказано, что аминокислотная последовательность бычьего белка лептина на 91% и 97% гомологична последовательности аминокислот белка лептина свиньи и овцы, соответственно [Ji, 1998].

Известно несколько ролей лептина у млекопитающих, большинство из которых связаны с контролем баланса энергии и общегопищевого поведения. Однако, учёные полагают, что белок также играет важную роль в таких биологических процессах как регулирование воспроизводства и иммунной реакции [Liefers, 2003b; Housekneckt, Baile, Matteri,1998]. Лептин секретируется в кровоток и влияет на синтез посредников в гипоталамусе, регулирующих пищевое поведение [Schwartz, Seeley, Campfield, Burn,1996].

В связи с множеством биологических ролей лептина, стало интересно его изучение у домашних животных, особенно жвачных животных и свиней.

Путем выявления важных особенностей гена лептина, ученые надеются получить лучшее понимание экономически важных процессов в животноводстве. Такие процессы включают в себя прямое и косвенноевлияние гормона, как на пищевое поведение, так и на мясную и молочную продуктивность.

Если говорить о структуре гена лептина то, у крупного рогатого скота, ген лептина расположен в 4 хромосоме (BTA 4) и состоит из трех экзонов, 1 из которых не транслируется. Только два экзона кодируют последовательность аминокислот белка лептина. В кодирующую область гена лептина (ее длина составляет 501 п.н.) входит второй и третий экзоны, которые разделены интроном с протяжённостью примерно 2 кб. Область промоутера составляет около 3 кб.

В гене лептина было определено несколько полиморфизмов. Эти полиморфизмы находятся в экзонах и интронах гена, а также в его промоторной области. В исследовании, проведенном на 22 животных 13 различных пород, 20 SNP были обнаружены в последовательности состоящей из 1788 пар нуклеотидов (п.н.) гена лептина, что даёт дает частоту 1 SNP на 89 п.н. [Konfortov, Licence,Miller, 1999]. У крупного рогатого скота, полиморфизм в гене лептина связывают с качествомпродуктивности молока и мяса, плодовитостью и потреблением корма, а также с уровнем экспрессии самого гена [Adamowicz, Flisikowski, Starzynski, 2006].

При изучении полиморфизма гена лептина было проведено исследование [Giblin, 2010], направленное на количественное определение связи между полиморфизмами 10 однонуклеотидных замен в генах, кодирующих лептин и рецептор лептина с чертами производительности 848 голштино-фризской породы быков.

Результаты оказались следующие: SNP R25C имеет влияние на массовые доли жира и белка в молоке, на сложность отела и продолжительность срока беременности. T аллель Y7F SNP в значительной степени связан с увеличением массы тела скота, и снижениеммассовой доли белка в молоке. Также установлена связь полиморфизма Y7F с увеличением массы тела, снижением надоя и уменьшением срока беременности. A80V связан со снижением выживаемости в стаде.

Выводы данного исследования: некоторые полиморфизмы лептина (Y7F и R25C) связанны с энергетически затратными процессами лактогенеза. Только SNP Y7F связан с накоплением энергии. Также была обнаружена взаимосвязь между полиморфизмами гена лептина исложностью отела, длительностью срока беременности и перинатальной смертностью телят.

.5.2 Структура белка лептина и его функции у крупного рогатого скота

Лептин является гормоном-продуктом гена ожирения, синтезируемого и выделяемого преимущественно клетками белой жировой ткани [Ji, 1998].

Предшественник белка лептина состоит из 167 аминокислот и содержит N-концевую сигнальную последовательность, состоящую из 21 аминокислоты, которая входит в состав лептина до момента выведения белка из клетки и перемещения полипептида в микросому.Зрелый же белок лептина имеет длину всего 146 аминокислот [Buchanan, 2002].

Роль лептина заключается в отправлении липостатического сигнала, регулирующего энергетический обмен всего тела, что делает его одним из лучших физиологических маркеров приема пищи, комплекции тела, расхода энергии, воспроизводства и некоторых функций иммунной системы [Nkrumah, 2005]. Концентрации лептина в сывороткекоррелирует с объёмом жировых депо и комплекцией тела крупного рогатого скота.

Было показано, что лептин играет ключевую роль в регуляции энергетического гомеостаза всего организма. Кроме того, он влияет на воспроизведение, а также иммунные и ответные реакции на стресс, секрецию гормонов в нескольких эндокринных желез, кроветворение, ангиогенез, и формирование кости [Houseknecht, 1998; Fruhbeck, 2001].

По большей части эффект белкового гормона-лептина опосредован централизованно, на уровне гипоталамуса. Он стимулирует или тормозит высвобождение нейромедиаторов, таких как нейропептид Y, что в конечном итоге приводит к снижению потребления корма и увеличению расхода энергии.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

.1 Полимеразная цепная реакция

Среди широко распространённых методов выявления полиморфизма последовательностей ДНК выделяются следующие: анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК (ПДРФ);анализ полиморфизма с помощью ПЦР.

При проведении полимеразной цепной реакции используется специфические праймеры в следствии чего получают дискретные ДНК-продукты амлификации отдельных участков геномной ДНК. Широко используемая родственная технология RAPD-технология основана на анализе амплифицированных полиморфных фрагментов ДНК с помощью единичных праймеров с произвольной нуклеотидной последовательностью.

Метод ПЦР основан на многократном копировании определённого участка нуклеотидов ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (invitro) как показано на рисунке.

Амплифицирование происходит если участок удовлетворяет заданным условиям, и он присутствует в исследуемом образце.

В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. Но при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20 - 40 тысяч пар нуклеотидов.

Для проведения ПЦР требуются следующие компоненты:

) ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

) два праймера, комплементарные последовательностям ДНК на границах определённого специфического фрагмента.

) термостабильная ДНК-полимераза - фермент, сохраняющий активность при высокой температуре длительное время, который катализирует реакцию полимеризации ДНК

) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

) ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

) буферный раствор.Он обеспечивает такие необходимые условия реакции как рН, ионную силу раствора.

Праймерами служат короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18-30 оснований, комплементарные одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивающие начало и конец амплифицируемого участка. Также праймер служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Критерии при выборе праймеров:

) GC-состав примерно 40-60 %;

) близкие Tmпраймеров (отличия не более, чем на пять градусов °C);

) отсутствие неспецифических вторичных структур - шпилек и димеров.

Как правило, при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий, как показано на рисунке 2.

Денатурация.

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 9-96 °C в течение 0,5-2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись, вследствие разрушения водородных связей между двумя цепями.

Отжиг.

Когда цепи расходятся, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура денатурации. Неправильноподобранная температура отжига может привести либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов. Отжиг проводят в течение 30 сек. За это время полимераза успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

Элонгация

Полимераза синтезирует вторую цепь от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и двигаясь вдоль матрицы, синтезирует новую цепь в направлении к 3' концу. Наиболее часто используемые полимеразы: Taq и Pfu.

Рисунок 2 - Циклы ПЦР

Обычно время элонгации равняется одной минуте на каждую тысячу пар оснований. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

.2 Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

Метод ПДРФ широко используется в исследованиях генетики популяций, так как присутствующий в геноме исследуемого организма рестрикционный фрагмент ДНК определенной длины является генетическим маркером и одновременно фенотипическим признаком, тесно связанным с генотипом организма.

Рестрикционный фрагмент - строго определенная последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая и расщепляемая рестриктазами.

Полное расщепление анализируемой геномной ДНК отдельными рестриктазами приводит к образованию определенного набора фрагментов ДНК, число и размеры которых соответственны расположению сайтов рестрикции. А любая мутация, изменяющая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт.

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Как видно на рисунке 3, при такой мутации сайт рестрикции остается нерасщепленным, что приводит к слиянию соседних рестрикционных фрагментов ДНК, разделённых между собой мутантным сайтом, и образованию фрагмента ДНК большего размера. В результате длина рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих в себе мутантные сайты, становится полиморфной, что выявляется методом ПЦР ПДРФ.

Таким образом, при проведении анализа ДНК животных, в случае если сайт рестрикции присутствует в обеих хромосомах в полиморфной области, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, характеризующий более короткий фрагмент ДНК. У животных, гомозиготных по мутации, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, который соответствует фрагменту большей длины, тогда, как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам работы сделаны следующие выводы:

) аллели гена лептина могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров как молочной и мясной продуктивности, так и продуктивного долголетия крупного рогатого скота.

) LEP-R25C, LEP-A80V, LEP-Y7F являются однонуклеотидными полиморфизмами гена лептина, которые оказывают влияние на функциональное долголетие и другие полезные признаки крупного рогатого скота для хозяйства.

) однонуклеотидный полиморфизм, имеющий наибольший эффект на функциональное долголетие это LEP-R25C, а наибольший риск выбраковки имеют коровы с генотипом СС (для R25C), FF (LEP-Y7F), VV (LEP-A80V).

) у скота айрширской породы не был обнаружен полиморфизм аллелей SNP A80V. У коров генотип СС (R25C) встречается сцеплено с генотипом YY (Y7F), а генотип FF (Y7F) встречается в сочетании с генотипом RR (сайт R25C).

Из этого можно сделать вывод о том, что при подборе быков-производителей к стаду коров необходимо учитывать генотип по локусу лептина (SNP: R25C, Y7F) таким образом, чтобы у потомстваотсутствовала вероятность появления таких генотипов как CCYF, ССFF и RCFF, а также исключитьвозможность накопления в популяции животных с генотипами,имеющими наибольший риск выбраковки, а именно СС (LEP-R25C), FF (LEP-Y7F), VV (LEP-A80V).