И начать приливать в колбу:
макросоли 50 мл взять мерным цилиндром.
CaCl 10 мл, стеклянной пипеткой Мора.
микросоли 1 мл или 1000 мкл, взять микропипеткой.
хелат железа 5 мл, взять стеклянной пипеткой Мора.
Витамины:
Тиамин или B1 - 50 мкл, взять микропипеткой.
Пиридоксин или B6 - 50мкл, взять микропипеткой.
PP или никотиновая кислота 100 мкл, взять микропипеткой.
C или аскорбиновая кислота 100 мкл, взять микропипеткой.
Пантотеновая кислота пол таблетки в размолотом состоянии.
Глицин 2 мг или 2-3 кристалла.
Гормоны 2,4 Д 3 или 6 мг или 6 БАП.
Глюкоза 20 г/л.
Отрегулировать pH до 5,8 добавив 12 капель 0.1 NaOH.
. Включить нагрев мешалки и добавить в колбу горячей воды до объема 600 мл.
. Полностью расплавленный агар-агар вылить в колбу, маленькими порциями горячей воды стеклянной палочкой смыть остатки агар-агара до 1 литра.
. Готовую питательную среду разлить в колбы, около 25мл, закрыть их фольгой.
. Поместить колбы в автоклав и проавтоклавировать.
. Чашки Петри, колбы с питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) поместить в автоклав.
. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течение 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1-0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.
. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1-1,2 атм.
. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.
. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи (Смолин А.М.,2011).
.3 Подготовка растительного материала, стерилизация эксплантов, термотерапия и химиотерапия
С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.
Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов - кору, с почек - кроющие чешуи.
Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали максимальную стерильность.
Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.
Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.
Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.
Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена - 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.
Сулема - токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корней и клубнеплодов - до 10-20 минут.
Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.
Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.
Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, канамицин и другие.
В качестве стерилизующего агента применяют также перекись водорода, которая менее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, так как она быстро разлагается.
Колбы с эксплантами после помещаются в абсолютную темноту при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те колбы, в которых началось заражение, следует сразу удалять (Шевелуха В.С., 1998).
Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термотерапии или химиотерапии исходных растений. Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37 оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 - 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.
Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 - 60%, повышают адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.
Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 - 50 мг/л, не больше. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 - 100%.
Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 β- Д- рибофуранозил -1,2,4 - триазол - 3 карбоксимид ( коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений (1- 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.
В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2-5- олигоаденилатов - соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5- олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокинино подобную и др (Калашникова Е.А. 2001).
.4 Условия культивирования регенерантов
При выращивании культур клеток необходимо соблюдать внешние условия культивирования регенерантов при выращивании растений из черенков. Их сажают в пробирки с питательной средой, помещают в световую комнату и выращивают в благоприятных условиях, при температуре 25-28 ºC, при 16 часовом фотопериоде, влажности воздуха 60-70% освещенности 2-5 тыс. лк (Кузьмина H.A. 2000).
. Клональное микроразмножение и оздоровление роз
.1 Технология оздоровления от вирусных инфекций
Метод основан на способности растения к регенерации отсутствующих органов. Из отдельных частей почки возникает целое растение со всеми характерными свойствами данного вида и материнского растения. Таким образом, характерные черты любого сорта розы клонированием можно сохранять длительное время.
У растений, размножаемых вегетативно, в сравнении с семенным потомством, есть свои преимущества:
по индивидуальному развитию они на порядок выше, поэтому быстрее зацветают;
однородны как генетически и анатомически, так и функционально-физиологически;
можно закрепить спонтанные мутации;
способны на самовозобновление после потери надземных вегетативных органов, более выносливы, продуктивны и долговечны;
применяя современные методы вегетативного размножения (культуру тканей), можно спасти растения от самых опасных заболеваний, например от вирусных.
Процесс микроклонального размножения растений in vitro требует прохождения следующих этапов:
) инициация культуры, или введение меристемной ткани растения на подходящую питательную среду;
) пролиферация, или наращивание микростеблей;
) укоренение микростеблей;
) акклиматизация и высадка в полевые условия in vivo Причина преимущества применения безвирусного посадочного материала, полученного in vitro, кроется в том, что растения, проходя путь от меристемастических клеток до взрослых растений, проходят процесс «реювенилизации» (омолаживания), в результате чего лишаются действия накопившейся в растениях усталости, вызванной стрессовыми факторами.
Для того чтобы получить высококачественный посадочный материал, свободный от вирусных, грибных и бактериальных заболеваний, применяется клональное размножение растений цветочных, плодовых и ягодных культур in vitro. У трудно размножаемых в обычных условиях видов растений при использовании данного способа размножения имеется реальная возможность производить в больших количествах вегетативное потомство (Бутенко Р.Г., 1964).
.2Экспланты, режим стерилизации
Для введения в культуру ткани растений у представителей рода Rosa L. в качестве исходного экспланта берут из верхушки энергично растущего побега, около 20-40 мм длинной апикальные и латеральные почки, не одревесневших или одревесневшие побеги. Для стерилизации вводимых эксплантов применяют различные способы их обработки (Кузьмина, Потапова, 2002).
На начальном этапе почки одревесневших побегов растений розы Rosa L промывали проточной водой с добавлением моющих средств в течение 15-20 минут, затем почки очищали от кроющих чешуй и листьев. Основную стерилизацию проводили двумя способами: 10 % раствором доместоса и 5 % раствором лизоформина, промывка дистиллированной водой (3 раза). После чего стерильный материал помещали на искусственную питательную среду МС без гормонального состава. Результаты стерилизации эксплантов различными способами показали их различную эффективность. Так, в первом варианте опыта выход стерильных эксплантов не превышал 20%. Во втором варианте выход стерильных эксплантов у данного сорта составил 80 % (Акшикова Н.А., 2013).
2.3Способы размножения in vitro
После стерилизации почки высаживают на твердую питательную среду МС, в пробирки и помещают в световую комнату.
На этом этапе некоторые исследователи для лучшего роста микропобегов розы в культуре in vitro рекомендуют различные концентрации 6-БАП в пределах 0,5 - 1,0 мг/л (Кузьмина, Потапова, 2002).
Рост каллусной ткани первичных эксплантов проходил на среде, содержащей помимо основных добавок (сахароза, агар, мезоинозит, тиамин -HCL, пиридоксин-HCL, глицин), а также цитокинин - БАП (0,5 мг/л) и ауксин - НУК (0,15 мг/л). Через 2 недели инкубации образовался морфогенный каллус: у первичных каллусов наблюдали появление почек, одиночных или многочисленных боковых побегов. Их вырезали и переносили на среды содержащие наряду с основными добавками, БАП - 1,0 мг/л, НУК - 0,1 мг/л или БАП - 2,0 мг/л, 2,4 Д - 0,2 мг/л. На обеих средах спустя 2,5 недели отмечалось разрастание старых побегов и новых. У некоторых образцов образовались корни. Через 3,5 недели в части пробирок (около 5%) появились полноценные растения с листьями и корнями.
Микроразмножение почек проводили на среде, включающей на ряду с основными добавками также 0,1 мг/л ИМК и 1,5 мг/л БАП.
Не образовавшие корней побеги переносили на среду, содержащую 0,75 мг/л БАП и 0,05 мг/л ИМК. Через 4 недели наблюдались развитие корней практически во всех условиях.
Используемые в наших исследованиях среды отличались различным содержанием (БАП - 1,0 мг/л, НУК-0,1 мг/л или БАП - 2,0 мг/л, 2,4 Д -0,2 мг/л). В процессе наблюдений было выявлено, что питательная среда с гормональным составом в БАП - 1,0 мг/л, НУК-0,1 мг/л дает больший процент образования микроклонов за месяц, в отличии от содержания БАП - 2,0 мг/л, 2,4 Д -0,2 мг/л в питательной среде (Павловская Н.Е., 1998).
.4 Адаптация микрорастений к внешним условиям in vivo, приемы повышения урожайности
Когда у микроклона образовывались корни, его извлекали из стерильных условий и сажали в горшки, заполненные субстратом. Но перед высадкой в почву, регенеранты проходили акклиматизацию во влажной камере на вермикулите в течение двух недель, а затем горшочки помещали в микро теплички, чтобы дать микрорастениям возможность постепенно привыкнуть к естественным условиям. Как только они адаптировались (через 4-6 недель), поддерживали обычные условия выращивания для данного вида роз. В качестве субстрата использовали торфа-песочную смесь 1:3 и велторф. Наибольший процент приживаемости растений-регенерантов наблюдали во втором типе субстрата 90%. После адаптации к комнатным условиям, пересаживали в открытый грунт, где они прекрасно себя чувствуют, растут и цветут (Акшикова Н.А., 2013).
В данной курсовой работе можно сделать несколько выводов.
В первой главе этой работы мы познакомились с технологиями и техникой микроклонального размножения в биотехнологии, а также познакомились с приборами и оборудованием необходимым для создания лаборатории по микроклональному размножению. Ознакомились с приготовлением питательных сред с их агрегатными состояниями и составляющими компонентами. Также ознакомились с режимами стерилизации эксплантов процессами химиотерапии, термотерапии, а также препаратами для стерилизации и сроками. Ознакомились с условиями внешними условиями культивирования регенерата.
Во второй главе мы разобрали технологию оздоровления и микроклонального размножения роз. Для начала изучили технологию оздоровления от вирусных инфекций, далее изучили экспланты для размножения и оздоровления и режим стерилизации. Потом познакомились со способами размножения in vitro. И проведением адаптации к внешним условиям среды.
На основе этих двух выводов можно сделать один общий вывод о том что полученные знания в этой научной работе можно применять на практике. Розы возможно ввести в культуру in vitro и получать оздоровлённые их сорта, для получения оздоровленного посадочного материала для цветоводства.
Библиографический список
.Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие.- М.: ФБК-ПРЕСС, 1991. - 160с.
2.Бирюков В.С. Основы промышленной биотехнологии. М.: КолосС, 2004. - 296с.
.Егорова Т.А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. - М:. Издательский центр «Академия», 2003. - 208с.
.Калашникова Е.А. Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии. Учебное пособие / Е.А. Калашникова, А.Р. Родин. - Москва, 2001. - 71с.
.Клеточная инженерия Методическое пособие к лабораторно-практическим занятиям по биотехнологии. Сост. А.М. Смолин, 2011.- 52с.
6.Кузьмина H.A. Культивирование меристем различных сортов роз in vitro. Естественные науки и экология: Ежегодник / Н.А. Кузьмина. O.A. Потапова. - Омск, 2000. вып. 5. - С. 38-39.
.Особенности технологи выращивания розы (Rose) в культуре ткани / Под ред. Н.А. Акшиковой - М.: Колос, 2013. - 3с.
8.Павловская Н.Е., Введение в сельскохозяйственную биотехнологию: Учебное пособие / Н.Е., Павловская Л.В., Голышкин, Л.В. Голышкина, - Орел: Изд-во ОГСХА, 1998. - 204с.
9.Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./, В.С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, С. В. Дегтярев - М.: Высшая школа, 1998. - 416с.