Экспресс-диагностика особо опасных инфекций
Экспресс-диагностика
особо опасных инфекций
Выполнил: Новак
А.Л., 301 гр., л/ф, Владивосток, 1998.
Актуальность
проблемы
Особо опасные
инфекции (ООИ) - это инфекции, которые могут возникать среди населения в виде
отдельных заболеваний, эпидемий и даже пандемий, чаще сопровождая ЧС (стихийные
бедствия, войны, массовый голод и т.п.), характеризующиеся природной
очаговостью, быстрым распространением и тяжелым течением. Единого во всем мире
мнения о том, какие инфекции следует причислять к ООИ пока нет, отечественные
эпидемиологи придерживаются такого перечня:
Чума
Туляремия
Миелоидоз
Геморрагические
лихорадки
Желтая
лихорадка
Холера
Генерализованная
форма сибирской язвы
Наиболее
вероятное появление ООИ возможно во время ЧС. Резкое ухудшение
санитарно-гигиенических условий обостряет эпидемическую ситуацию по инфекциям,
которые раннее имели эндемических характер, а завезение инфекции извне
прибывающими лицами приводит к тому, что потенциальные источники инфекции
оказываются неизолированными и в течение длительного времени имеют
многочисленные контакты с окружающими их лицами. В связи с этим до установления
окончательного диагноза заболевания соблюдается строгий противоэпидемический
режим.
При первых
признаках или подозрении на ООИ осуществляется:
Выявление
контактных лиц и их обсервация;
Дача
антибиотиков широкого спектра действия (доксицилин, тетрациклин и др.), т.е.
экстренная профилактика;
Проведение
дезинфекционных мероприятий;
Отбор материала
от больных и доставка его в лабораторию для микробиологического исследования;
Организация
частичной (полной) санобработки конкретных лиц.
В данной работе
разбирается этап диагностики ООИ на примере чумы, холеры и туляремии. Если
диагноз установлен с достаточной достоверностью, можно определить характер
противоэпидемических мероприятий, установить возможный источник инфекции и
механизмы его передачи. Именно по этому необходимо и оправдано применение
экспресс-методов диагностики ООИ.
Общие
принципы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета
Современная
иммунология исключительно многолика, а сферы применения иммунологических знаний
и методов беспредельно разнообразны. Они используются практически во всех
разделах биологии, ветеринарии и медицины - от фундаментальных
молекулярно-биологических исследовании до медико-генетического консультирования
и множества других сугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами,
животноводами и медиками. И, тем не менее, особенно важным в социальном
отношении и методически наиболее передовым продолжает быть тот старейший и
неуклонно развивающейся раздел иммунологии, успехами которого обеспечивается
развитие теории и осуществление практики противоэпидемической работы-диагностики,
профилактики и лечения инфекционных заболеваний. А методы иммунологической
экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффективного решения названных
проблем и осуществления всех соответствующих противоэпидемических мероприятий.
Следующие ниже материалы и посвящены именно этому разделу прикладной
иммунологии, его состоянию и перспективам развития.
Важнейшей
предпосылкой эффективности любых противоэпидемических мероприятий является
своевременное прогнозирование и обнаружение моментов активизации тех экологических
и социально-экологических взаимодействий, которые составляют существо
эпидемических процессов. Исключительное разнообразие, свойственное последним и
требующее дифференциации противоэпидемических мероприятий, обусловлено не
только самобытностью каждой из существующего множества инфекционных болезней.
Очень большое значение имеет в этом отношении фундаментальное явление
гетерогенности популяций, входящих в состав соответствующих экологических и
социально-экологических систем микроб-жертва. Вариабильность этих весьма
сложных биосоциальных факторов и условий в очень большой мере влияет на
специфику того или иного этапа существования каждого эпидемического процесса. И
своевременное распознавание этих особенностей, осуществляемое, как правило, с
использованием иммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию
противоэпидемических мероприятий.
Экспресс-индикация
- это своеобразная разведка большой армии лабораторной диагностики. Она
находится на переднем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых
методов индикации микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение
лабораторной практики и благодаря этому последняя все время совершенствуется.
Основные
объективные требования к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний
сводятся к следующему:
1. получение
результатов анализа в максимально короткие сроки (часы, идеально-минуты);
2. возможность
проведения и завершения анализа без выделения искомого микроорганизма в чистой
культуре, при использовании только нативного материала, в крайнем случае-с
привлечением элективных биосред для быстрого накопления возбудителей;
3. бесспорно
высокая специфичность и высокая чувствительность, как предпосылки надлежащей
достоверности анализа;
4. высокая
производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов.
Эти требования
в равной мере приложимы и к методам экспрессной диагностики состояний
иммунитета. Предпочтительность использования того или иного из существующих
методов экспресс-диагностики зависит от многих конкретных условий. Однако
наиболее желательным является параллельное использование 2-3 методов. Такой
подход значительно увеличивает надежность получаемого результата.
На ближайшие
годы наиболее перспективными следующие направления развития экспресс-индикации
микроорганизмов.
Энзимоиндикационное
направление, связанное с экспресс-индикацией биохимических свойств и
определением ферментативного спектра микробов. По-прежнему сохранят свою
значимость исследования по разработке политропных (полисубстратных) питательных
сред. В нашей стране были разработаны оригинальные политропные среды и их
комбинации, которые с успехом применяются в лабораторной практике. При создании
сложных поликомпонентных питательных систем необходимо исходить из различных
биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Для лучшего
проявления жизнедеятельности и биохимической активности патогенных и других
микробов в средах необходимо создавать оптимальные условия для их роста и
размножения и одновременно вводить ферментируемые субстраты (углеводы,
многоатомные спирты, аминокислоты и др.) с наиболее чувствительными
индикаторами, которые быстро бы регистрировали их ферментацию. В результате
применения оптимальных полисубстратных сред производится выделение и накопление
чистой культуры микробов с одновременным определением их биохимических
признаков. Перспективным следует рассматривать развитие энзимоиндикационных
методов, в которых субстрат с индикатором отделен от питательной среды и
фиксирован на специальном носителе. В нашей стране разработаны
углеводно-бумажные диски с защитной пленкой (бумажные реагенты для определения
дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бумажно-индикаторные системы),
углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки . Все эти препараты
являются весьма перспективными, они позволяют в течение кратчайшего срока (3-5
ч), используя общепринятые питательные среды и лабораторную посуду, определять
ферментативную активность различных видов микроорганизмов. Автономный препарат
- карандаш-фермент, не имеющий аналогов ни у нас, ни за рубежом, позволяет без
применения питательных сред непосредственно на предметном стекле определять
биохимические свойства микробов. Полисубстратная тест-система и
энзимоиндикаторная лента используются для одновременной идентификации 20
биохимических признаков у микробов. Это новые виды простых
"долгоживущих" препаратов, предназначенных для быстрого и
экономичного определения биохимических свойств микробов. Электрофизический
метод определения ферментативной активности микробов включает посев микробной
культуры на жидкие питательные среды, содержащие пептонную воду, различные
углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты с последующим ферментативным
расщеплением исследуемых веществ и образованием различных ионизированных
продуктов распад по природе, форме и величине виды мелкодисперсных носителей
(сорбентов) антигенов и антител, способствующих повышению чувствительности
комплексных иммунологических методов. Реакции пассивной гемагглютинации и их
модификации связаны с использованием эритроцитарных диагностических препаратов.
Эритроцитарную диагностику с успехом применяются для ускоренного обнаружения и
идентификации как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов
(например, возбудителей туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.) в различных
патологических материалах, получаемых от больных, и в объектах внешней среды.
Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются весьма чувствительными, и в
этом отношении часто превосходят другие серологические реакции. Они введены в
официальные инструкции по экспресс-индикации бактериальных агентов в элементах
внешней среды и в материалах, полученных от пораженных людей и животных.
Одновременно продолжаются поиски новых носителей антигенов и антител, которые
были бы безантигенными, стабильными, не разрушающимися при длительном хранении,
а применяемые реакции - простыми по технике постановки (например, стекольные
тесты) и исследования с их помощью - экономичными. Совершенствуются реакции с
применением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и
антител.
Положительными
свойствами такого рода препаратов являются:
отсутствие
собственной антигенности;
стабильность
при длительном хранении;
демонстративность
и простота техники постановки реакции, обычно на предметном стекле;
высокая скорость
прохождения реакции;
экономичность.
Кроме того,
полезным и оправданным считаем поиск новых носителей антигенов и антител. В
этом отношении перспективными являются ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и
ее производные и ряд других веществ, которые могут способствовать повышению
чувствительности серологических реакций.
Иммунохимическое
направление, связанное с использованием разнообразных комплексных соединений
специфических антител или антигенов с химическими веществами. Присоединенные
химические вещества придают им новые феноменологические способности и свойства,
тем самым, расширяя возможности экспресс-индикации микробных агентов в
частности и лабораторного анализа вообще. Большую популярность и практическую
значимость приобрели методы быстрого иммунофлуоресцентного анализа (прямой,
непрямой, антикомплементарный), которые ныне официально используются как методы
экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов. Дальнейшее
развитие весьма перспективного иммунохимического направления во многом зависит
от химиков, которые должны разработать достаточно яркие новые красители,
вступающие в соединения со специфическими антителами и антигенами. В результате
могут быть получены препараты с новыми феноменологическими свойствами,
позволяющими проводить экспресс-индикацию микробных культур и отдельных клеток
с помощью широко распространенных микроскопических устройств (типа МБИ
различных марок).
Иммуноферментное
направление, интенсивно развивающееся в последние годы. Разработаны прямой,
непрямой, антикомплементарный и другие методы быстрого обнаружения микробов
путем использования иммуноэнзимологического принципа; предложены новые виды
ферментов, а также разнообразные виды хромогенных субстратов. Данное
направление является весьма перспективным, развитие его может привести в
ближайшие годы к появлению новых методов экспресс-индикации микроорганизмов.
Иммуноэлектрофоретическое
направление успешно развивается с конца 50-х годов. Разработаны многочисленные
методы иммуноэлектрофореза. Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще
прибегают к встречному иммуноэлектрофорезу. Применение новых химических
красителей, ферментной или радиоактивной метки позволит резко повысить
чувствительность метода иммуноэлектропреципитации.
Иммунорадиологическое
направление связано с использованием разнообразных конъюгатов специфических
антител или антигенов, соединенных с радиоактивными веществами, которые придают
им новые феноменологические свойства и способности, р установить природу
возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами, в виду его изменчивости
или загрязненности материала, он остается нераспознанным.
Биологическое
направление, связанное с изучением токсических и агрессивных свойств патогенных
микроорганизмов. Биологические методы осуществляются на одноклеточных
организмах, на культурах клеток, куриных эмбрионах, а также на здоровых, а еще
лучше специально подготовленных лабораторных животных. Эти методы более
трудоемкие и менее точные по сравнению с другими.
Физико-химическое
направление. Это направление связано с использованием сравнительно быстрых, но
в то же время и достаточно сложных по аппаратурному оформлению методов. Сюда
входят методы изучения бактериальных популяций и их экстрактов с помощью
хроматографии (газожидкостная и др.), спектроскопии (инфракрасной,
ультрафиолетовой и др.), резистографии в отношении различных антибиотических,
химических и лекарственных веществ, а также методы температурной и кислотной
агрегации, коагуляции микробных суспензий и их токсинов.
Рецепторное и
генетическое направления быстрой индикации патогенных и санитарно-показательных
микроорганизмов. Методы, основанные на этих принципах, только начинают
развиваться. Так, с помощью целлюлозно-глобулинового или
эритроцитарно-глобулинового диагностикумов быстро обнаруживают патогенный
стафилококк, содержащий белок А, а путем гомологии неизвестных нуклеиновых
кислот с известными нуклеиновыми кислотами устанавливают вид патогена.
Комплексное
направление ускоренной идентификации патогенных и санитарно-показательных
микроорганизмов, использующее методы экспресс-индикации, основанные на
интеграции различных принципов, связано с разработкой и созданием индикаторных
тест-систем, позволяющих в течение короткого срока и с минимальными затратами
на анализ определить комплекс основных признаков патогена или
санитарно-показательного представителя, достаточных для его идентификации до
рода, вида и даже типа.
Направления,
связанные с разработкой новых принципов микробиологического анализа. Вполне
вероятно, и мы вправе ожидать в ближайшие 5-10 лет появления новых идей,
подходов и принципов в микробиологической науке и смежных с ней областях.
Открытие новых видов рецепторной, иммунологической и генетической специфичности
у микробов позволит создать новые и возможно более совершенные методы быстрой
идентификации микроорганизмов.
Основные пути
развития экспресс-индикации микроорганизмов на ближайшие годы:
создание и
конструирование новых препаратов, способствующих ускорению и удешевлению
исследований, повышению эффективности лабораторной диагностики инфекций и
индикации патогенных и других микроорганизмов. На этом пути предстоит сделать
очень многое, поскольку общепринятые диагностические препараты в значительной
степени исчерпали свои потенциальные возможности;
разработка
новых более чувствительных, простых методов лабораторного анализа.
разработка
комплексных методов и видов исследований. Будет продолжаться дальнейшая
интеграция методов и видов исследований, имеющих разные принципы действия,
лежащие в их основе;
создание новых
схем исследований. Поскольку лабораторная диагностика инфекционных болезней, а
также экспресс-индикация, хотя и в меньшей степени, связаны с изучением
комплекса различных свойств и особенностей микроорганизмов с использованием
обычно разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах, то
создание новых схем исследований с применением новых методов является
объективной реальностью и важной задачей, вытекающей из существа самого
процесса развития микробиологического анализа;
разработка и
создание новых методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных и
лабораторных исследований.
разработка
новой микроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для
исследований;
автоматизация и
компьютеризация исследований.
В современных
условиях эти вопросы должны решаться комплексно. Таким образом, рассмотре от 10
лиц. Флаконы помещают в термостат при 370С. Через 3 - 4 часа холерные вибрионы
начинают агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов) падают в
виде хлопьев на дно флакона. Исследуя под микроскопом окрашенные мазки и
"висячую каплю", обнаруживают склеившихся и частично свободных
вибрионов. Через 6 часов дается ответ и в случае обнаружения холерных вибрионов
немедленно производится посев индивидуально от каждого из 10 лиц. Такой метод
дает возможность исследовать до 16 000 человек за 3 - 4 дня. Метод
иммунодиагностической микропленки. Изучение антигенных свойств холерных
вибрионов проводят путем постановки пробирочной или пластинчатой реакции
агглютинации с использованием сухих лиофилизированных диагностических
агглютинирующих холерных 0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку
разводят в физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при
постановке агглютинации на стекле с исследуемой культурой вибрионов. При
подготовке сыворотки используется дополнительная посуда, что усложняет работу
бактериолога, а в оставшейся разведенной сыворотке быстро прорастает
бактериальная микрофлора и инактивирует ее. Для изучения антигенной структуры
холерных вибрионов были разработан иммунодиагностический препарат в виде
микропленок разового применения, который обладал достаточной специфичностью,
демонстративностью и экономичностью. Иммунодиагностические холерные микропленки
(ИХМП) в виде полимерной пленки с нанесенными высушенными каплями,
фиксированными на бумаге, содержат минимальное количество сыворотки,
пленкообразующий компонент и консервант. Пленкообразующий компонент связывает,
склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности носителя,
исключает крошение микропленок; консервант предохраняет препарат от разрушения
при длительном хранении. Концентрация диагностической сыворотки в ИХМП является
достаточной, поскольку после эмульгирования в капле физраствора, антитела
содержатся в титре 1:100, что полностью обеспечивает ход реакции. Тем самым
обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается, расход
диагностической сыворотки и исключается возможность ее неиспользования. При
этом создаются условия для быстрого растворения ИХМП, контакта ее с холерными
вибрионами и проведения реакции непосредственно на полимерной пленке. Готовые
ИХМП хранят в темном сухом месте при 4- 7°С в картонных коробках (срок годности
3 года - срок наблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для определения
холерных вибрионов. Для исключения случайного заражения окружающих предметов
ИХМП помещают в чистую чашку Петри. На поверхность ИХМП наносят каплю
физиологического раствора, в которой растворяют ее. Разведенную сыворотку
смешивают с изучаемой культурой вибрионов, снятой бактериологической петлей с
питательной среды. При другом варианте постановки реакции ИХМП снимают
скальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло, растворяют в
капле физиологического раствора и смешивают с изучаемой культурой вибрионов.
При положительной реакции через 1-3 мин появляются зерна агглютината,
окрашенные в зеленый цвет, а капля просветляется. При отрицательной реакции
капля остается гомогенно-мутной. Использованную часть полимерной пленки
отрезают, а оставшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в той же чашке Петри для
дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованиях вибрионов и других
микроорганизмов позволяет получить статистически достоверные результаты,
сэкономить дорогостоящие диагностические сыворотки, повысить качество и
эффективность исследований. Реакция агглютинации микрометодом.
В последнее
время в бактериологической практике нашел довольно широкое применение
микрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием
специальных планшеток и микротитровальных игл . Реакции агглютинации
микрометодом ставят с холерными агглютинирующими референс-сыворотками в
полистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном,
предназначенных для иммунологическ агглютинировались в планшетках и пробирках
соответственно в 95 и 96% случаев. У холерных вибрионов классического и эльтор
биоваров серовара Огава соотношения в обеих методиках были практически те же.
Интересен факт, что при постановке реакции агглютинации с RO-сывороткой
наибольшее число штаммов, агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было
выявлено в микрометоде; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма.
Все штаммы вибрионов 040-056 сероваров в микрометоде не агглютинировались
холерными агглютинирующими сыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040
серовара) агглютинировался всеми холерными сыворотками. Большинство изученных
штаммов представителей семейства Enterobacteraceae также не агглютинировалось
холерными агглютинирующими сыворотками, за исключением Sh. flexneri 2503, у
которого в пробирках была выявлена агглютинация со всеми сыворотками, и штамма
S. typhimurium 21, у которого отмечена неспецифическая реакция агглютинации со
всеми сыворотками как в пробирках, так и в планшетках. При пользовании этим
методом расход агглютинирующих сывороток уменьшается в 10 раз, значительно
сокращается время, необходимое для постановки реакции, и ускоряется срок выдачи
ответа. Кроме того, описанный метод менее трудоемок.
Таким образом,
стандартность, достоверность полученных результатов, высокая экономичность
метода позволяют рекомендовать его при идентификации холерных вибрионов,
изучении штаммов и популяции штаммов холерных вибрионов по признаку
агглютинабельности. А также: Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и
типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности
пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и
Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты
"раздавленная капля", которые исследуют с помощью темнопольной и
фазовоконтрастной микроскопии. В положительном случае через 3-5 минут движение
вибрионов прекращается. РИФ. Препараты из исследуемого материала обрабатывают
флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном
микроскопе.
Положительным
результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким
желто-зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки.
Положительный результат можно получить через 1-2 часа после начала исследования
при концентрации вибрионов не менее 106 клеток в 1 мл., поэтому рекомендуется
предварительно подращивание материала на питательных средах.
Экспресс-диагностика туляремии Возбудитель туляремии (Туляре - район
Калифорнии) - Franciella tularensis относится к роду с невыясненным положением
в систематике микробов. Этиологическая природа туляремии была установлена в
1912 году Г.Мак-коем и Ш.Чепиным, а далее подробно изучена Э.Франсисом.
Туляремия -
тяжелая кровяная зоонозная инфекция с природной очаговостью. Основные источники
инфекции - водяные крысы, ондатры, зайцы, крысы, мыши. Больной человек
неконтагиозен и для возбудителя является биологическим тупиком. Передается
трансмиссивным путем через клещей, а нередко и контактным, алиментарным или
аспирационным путем. Возбудитель содержит нуклеопротеидный О- и оболочечный
белково-липидный Vi-антиген. У перенесших болезнь вырабатывается очень
напряженный и длительный иммунитет. Материал для исследования: кровь, гной,
пунктат бубона, слизь из зева. Реакция агглютинации-рассеивания. Предложена
простая, быстрая, высокочувствительная и специфичная реакция
агглютинации-рассеивания, для постановки которой используется антительный
диагностикум. Это суспензия темно-коричневого цвета, представляющая собой
комплексное соединение шаровидных крупнодисперсных НК-частиц (Никитин и Котич)
и противотуляремийных иммуноглобулинов. Препарат хранят в холодильнике при +4°С
в течение 2-3 лет. По истечении 3 лет препарат можно ресенсибилизировать, так
как НК-частицы высокостабильны. Для постановки реакции агглютинации-рассеивания
на тщательно обезжиренное предметное стекло наносят слева относятся также Y.
pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, вызывающие септические
гастроэнтероколиты или иерсиниозы.
Чума - особо
опасная, очень тяжелая кровяная инфекция, склонная к широкому распространению и
дающая высокий процент смертности (от 20 до 100%). Это зоонозная трансмиссивная
природно-очаговая инфекция. Источники - крысы, суслики, песчанки, полевки,
сурки, мышевидные грызуны. Переносчики - кровососущие насекомые. В составе
бактерий чумы содержится более полутора десятков специфических и групповых
антигенов. Переболевшие приобретают пожизненный, устойчивый иммунитет
фагоцитарного характера. Материал для исследования: содержимое бубонов,
отделяемое язв, мокрота, кровь, испражнения. Метод бумажных индикаторных
систем. Классические методы (посев на среды Гисса) громоздки, требуют много
времени и большого количества питательных сред, имеющих ограниченный срок
годности. В настоящее время эти методы не удовлетворяют запросам противочумной
системы. В настоящее время наиболее перспективным методом определения
ферментативной активности штаммов возбудителя чумы с целью идентификации
выделяемых культур и изучения их свойств можно считать метод углеводно-бумажных
дисков, предложенный В.М.Никитиным и С.В.Плугару. В качестве среды лучше
использовать бульон Хоттингера, т.к. он дает наиболее быструю ферментацию - 3
часа. Целесообразно применять БИС в полевых условиях, так как наборы компактны
и могут длительное время храниться при комнатной температуре. Фаготипирование.
1. Внесение бактериофага в исследуемый материал в момент его посева на агар с
генцианвиолетом позволяет обнаружить под микроскопом негативные колонии фага
или "дорожку" в первые часы, когда рост бактерий еще почти не заметен
(через 2,5 - 3 часа). Метод прост, доступен и дает хорошие результаты при
высокой концентрации чумного микроба и при относительно большом содержании
посторонних микроорганизмов. 2. Определение нарастания титра чумного фага,
вносимого в исследуемый материал, где в случае наличия возбудителя фаг начинает
размножаться уже через 30-40 минут. В жидкий исследуемый материал (25-50-100
мл) и в контрольную жидкость добавляют столько фага, чтобы получить его
разведение 1:50 - 1:100; ставят пробы в термостатах при 370C на 45-60 минут.
После инкубации берут 0,5 мл жидкости из каждой пробы и разводят бульоном в 10
раз; из этого первого разведения фага готовят серию последовательных 10-кратных
разведений (до 10-10 - 10-11). По 0,5 мл жидкости из каждого разведения исследуемого
и контрольного рядов добавляют к 2,5 мл полужидкого агара (0,1%),
предварительно расплавленного и затем охлажденного до 48-500С. Тут же к агару
добавляют 0,1 - 0,2 мл взвеси 1 - 2 суточной индикаторной культуры (вакцинный
штамм чумного микроба), содержащий 15-20 млрд микробов в 1 мл. Содержимое
пробирок тщательно перемешивают и выливают на чашки Петри с 2% агаром
Хоттингера. После того, как полужидкий агар застынет, чашки перевертывают дном
кверху и ставят в термостат при 370С. Учет результатов производят через 3-4
часа. На фоне сплошного роста индикаторной культуры видны стерильные пятна
(негативные колонии фага), количество которых на чашках с исследуемым
материалом может превосходить в 100-1000 и более раз число негативных колоний
на контрольных чашках. Благодаря хорошей диффузии фаговых частиц и
бактериальных клеток через полужидкий агар двухслойный метод дает стерильные
пятна большего размера, чем при размазывании исследуемой массы шпателем по
поверхности агара. Подсчет колоний ведут в счетной камере. А также: РИФ, РПГА и
др.
Некоторые
другие методы
Хемилюминесцентный
иммуноанализ. Новым этапом на пути развития иммунологических методов
диагностики ООИ является хемилюминесцентный иммуноанализ - ХЛИА. Преимущество
этого метода определяется его высокой чувствительностью, относительной
простотой и производительностью, возможностью полной автоматизации В открытой
литературе имеются отдельные сообщения, посвященные применению ХЛИА в
медицинской микробиологии, как для обнаружения бактериальных антигенов, так и
Специфичность ХЛИА зависит от качества использованных иммуноглобулинов. На 42
близкородственных и гетероло-гичных штаммах положительные реакции получены с Y.
pseu-doTuberculosis 816111(37°) с чумными общими ИПК и В. sereus 1 и 3 с
сибиреязвенными ИПК в концентрациях 1 -106 м. т./мл. ХЛИА следует рекомендовать
для лабораторной диагностики ООИ особенно в тех случаях, когда в исследуемом
материале предполагается незначительное содержание возбудителя.
Иммуноблотинг
Иммуноблоттинг
- разновидность гетерогенного иммунного анализа. Сущность его заключается в
переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя,
используемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью
иммунохимической реакции происходит их специфическое выявление. В зависимости
от исследуемого вещества различают ДНК,- РНК и белок - блоттинг. При постановке
иммуноблоттинга соблюдается следующая методическая последовательность:
электрофоретическое разделение анализируемого материала на индивидуальные белки
или полипептиды в геле; получение реплики путем блоттинга белков или
полипептидов с геля на твердофазный матрикс; блокирование фона, отмывка от
компонентов, используемых при блокировании фона; инкубирование со специфической
тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с Jg к антителам
специфической тест-сыворотки, конъюгированными с меткой; отмывка от избытка
меченого иммунореагента; выявление тестируемых антигенов авторадиографически
или ферментативно по реакции с соответствующим субстратом. Иммунохимическое
выявление антигенов можно проводить с помощью антител, конъюгированных с
меткой. В качестве метки в последнее время широко применяют либо радиоактивные
изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу, лактамазу и др.).
Время блоттинга путем диффузии составляет 36-48 ч. Но наиболее быстрый и
эффективный способ переноса белков с гелей - электроблот, время которого, в
основном, составляет 1-3 ч (2), для некоторых высокомолекулярных белков- более
12 ч. Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций блотов
(нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим образом), выбор
условий блокирования и иммуно-химического выявления антигенов полностью зависит
от антигена, его количества, метода иммуноанализа и целей исследования. Метод ИБ
по целому ряду обстоятельств получил наибольшее распространение как метод,
пригодный для использования в качестве теста подтверждения. Безусловное
достоинство метода - возможность тестирования антител к слабо или вовсе
нерастворимым антигенам и исключение стадии введения радиоактивной метки в
антигены. О чувствительности в случае ИБ судят по предельному количеству
нанесенного на гель антигена, которое при фракционировании белков удается
выявить иммунохимически после переноса с геля на твердую фазу (нитроцеллюлозу).
Общая чувствительность анализа зависит от целого ряда причин: условий
фракционирования и иммобилизации антигена на твердом носителе, уровня фона,
специфичности и аффинности антител. Важное значение имеет вид используемой
метки и способ ее выявления.
Таким образом,
метод иммуноблотинга позволяет идентифицировать зоны антигена на твердой фазе,
не связывая весь белок с антителами специфической сыворотки. Иммуноблотинг и
его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных
антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности
обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или
как тест подтверждения в сочетании с другими методами.
Обнаружение
возбудителей, антигенов и антител при помощи суспензионных препаратов.
Принцип:
фиксированные на частицах компоненты вступают в реакцию антиген-антитело,
которая сопровождается образованием крупных, видимых невооруженным глазом
агломератов. В суспензионных препаратах для обнаружения и количественного
определения антигенов и антител используется свойство многих неорганических и
органических веществ, таких как активированный уголь, дерматол, бентонит,
каолин, гидроокись алюминия, си техническими возможностями лаборатории,
контингентом зараженных людей, характером и масштабом распространения
предполагаемой инфекции. Диагностику необходимо провести в наиболее короткие
сроки, так как от этого зависит эффективность изоляции и лечения больных. При
работе с патологическим материалом важно учитывать и предупреждать возможность
заражения медицинского персонала, поэтому надо строго соблюдать инструкции по
сбору материала от больных. Классические методы экспресс-диагностики в
большинстве своем исчерпали себя, в связи с этим необходимо разрабатывать принципиально
новые, такие как ПЦР и др. и автоматизировать существующие.
Таким образом,
экспресс-диагностика ООИ и по сей день остается актуальной и одной из важнейших
задач микробиологии и эпидемиологии. Список использованной литературы
Ускоренные методы диагностики инфекционных болезней (сб. тр.) -Кишинев,
"ШТИИНЦА", 1987. Препараты для экспресс-диагностики (сб. тр.) -
Ленинград, 1981. Иммунохимия и лабораторная диагностика особо опасных инфекций
(сб. тр.) - Саратов, 1985. Щербак Ю.Ф. Особо опасные инфекции - М.,
"Медицина", 1975. Ранняя и дифференциальная диагностика основных
инфекционных заболеваний (уч.-мет. пособие) - Ленинград,1988. Медицина
катастроф (уч. пособие) - М., "ИНИ Лтд", 1996. Лебедева М.Н.
Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии - М.,
"Медицина", 1973. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С.
Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и
иммунологии - М., "Медицина", 1993. Повлович С.А. Медицинская микробиология
в графах - Минск, "Вышэйшая школа", 1986.