На основе полученных данных сделать выводы об этиологии, патогенезе и всей сущности данной болезни.
1. Обзор литературы
.1 Бактериофаги и их использование в диагностике инфекционных болезней животных и человека
бактериофаг инфекция листериоза животное
Первые сообщения о растворении микроорганизмов появились в конце XIX начале XX столетия. В 1898 году русский учёный Н.Ф. Гамалея обнаружил, что при обработке дистиллированной водой бацилл сибирской язвы выделяется специфическое вещество, которое обусловливает просветление взвеси сибиреязвенных палочек, растворяет свежевыращенную культуру. Это специфическое вещество исследователь назвал бактериолизином и высказал мнение, что оно образуется бактериями при их распаде. Однако недостаток материала не позволял ему сделать окончательный вывод об этом феномене.
Оставалась без внимания и работа F. Twort /1915/, который при посеве оспенного детрита на агар обнаружил среди колоний белого стафилококка стекловидные колонии. Фильтрат из последних, разведённый 1:6, давал стекловидные колонии в свежевыращенной стафилококковой культуре. Автор предполагал, что действующим началом является новая форма, более низкоорганизованная по сравнению с бактериями, она могла быть живой протоплазмой или энзимом, способными возникать и размножаться эндогенно.
В последующие годы канадский микробиолог Д'Эрелль /1917, 1918, 1926, 1935/ опубликовал обширные материалы, привлекшие всеобщее внимание к феномену растворения микробов. Учёный обнаружил в фильтрате из испражнений выздоравливающего больного, страдающего тяжёлой формой дизентерия Шига, вещество, которое при пересеве растворяло свежевыделенную культуру палочки Шига, при этом активность вещества при пересевах увеличивалась. На основании проведенных исследований Д'Эрелль создал новую, весьма привлекательную теорию о том, что наблюдаемое им растворение дизентерийных бактерий, вызывается не веществом, а живым существом, ультрамикроскопическим паразитом бактерий, невидимым в обычном микроскопе даже при самом сильном увеличении. Образуемые им стерильные пятна на газоне агаровой культуры, по представлению исследователя, есть не что иное, как колонии размножившихся живых существ, которых он назвал бактериофагами, что в переводе с греческого означает "пожиратели бактерий". Это название используется до настоящего времени, хотя оно и не отвечает в полной мере современным представлениям о природе фага и его взаимодействии с бактериями, отражая лишь одну из сторон этого процесса - лизис микробной клетки. Наряду с указанным термином можно встретить наименования: фаг, вирус бактерий или просто вирус.
Проблема бактериофагии, развивающаяся вначале как узкая область медицинской микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение. Всесторонние исследования бактериофагов, выполненные в последние 25-30 лет, позволили широко использовать фаги для решения многих вопросов в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии и других направлениях биологических исследований.
Фаги являются одним из наиболее подходящих объектов для глубокого изучения ряда вирусологических проблем и, в частности, взаимоотношения вируса с клеткой-хозяином. При их использовании возможно моделировать как явно выраженную продуктивную инфекцию, так и потенциальное вирусоносительство в форме лизогении. Успешно разрабатывается проблема лизогении, имеющая общебиологическое значение для понимания молекулярных механизмов вирусного канцерогенеза и латентных вирусных инфекций.
Бактериофаги оказались наилучшей моделью и для решения других важнейших проблем современной биологии, в частности, расшифровки природы наследственного вещества у живых организмов, тонкой структуры генов и сущности генетического кода, молекулярной основы спонтанных и индуцированных мутационных изменений.
С помощью фагов проводятся широкие радиобиологические исследования, а также первичный отбор химиотерапевтических средств и некоторых антибиотиков против вирусных болезней и злокачественных опухолей.
С выходом человека на космические орбиты фаги стали использовать для важнейших биологических исследований космического пространства.
После открытия явлений бактериофагии Д'Эрелль развил учение о том, что бактериофаги патогенных бактерий, являясь их паразитами, играют большую роль в патогенезе инфекций, обеспечивая выздоровление больного организма, а затем создания специфического иммунитета. Это положение и привлекло к явлению бактериофагии внимание многочисленных исследователей, которые предполагали найти в фагах важное средство борьбы с наиболее опасными инфекционными болезнями человека и животных. В настоящее время известны фаги многих видов патогенных и сапрофитных бактерий: кишечной палочки, синегнойной палочки, стафилококка, стрептококка, брюшного тифа, дифтерии, чумы, псевдотуберкулёза, дизентерии, бруцеллёза, холеры и др.
В литературе имеются сообщения, свидетельствующие о положительном лечебно-профилактическом действии препаратов бактериофагов при использовании их во время эпидемии холеры, при дизентерии и других желудочно-кишечных болезнях. Фаги применяют в хирургической и акушерско-гинекологической практике.
Отдельные попытки использования различных бактериофагов при инфекционных болезнях животных были предприняты в 20-30-х годах. Д'Эрелль /1928, 1935/ пытался использовать фаги при пуллорозе-тифе у кур.
Квеситадзе И.Ф. /1957/ применил бактериофаг для лечения 6000 больных сальмонеллёзом телят. Эффективность фаготерапии сальмонеллёзных телят в отдельных хозяйствах достигала 90-100%.
Шерстобаев К.Н. /1949/ применил бактериофаг для лечения и профилактики колибактериоза поросят. При лечении 4964 поросят было отмечено выздоровление у 95,6% животных.
Бирюков И.Л. и Р.К. Петренко /1958/ сообщили, что дача цыплятам пуллорум-фага предохраняла их от пуллороза на 90% в лабораторных и до 80% в производственных условиях.
Однако, наряду с работами, указывающими на лечебный эффект бактериофагов при отдельных инфекционных болезнях, встречаются сообщения, полностью отрицающие положительную, лечебную роль бактериофагов. Некоторые исследования порой свидетельствуют об ухудшении состояния организма после использования бактериофага, что вероятно, связанно с размножением устойчивых клеток, отличающихся большей болезнетворностью по сравнению с исходным типом /Адарченко А.А. 1977, Васильев М.П. и др. 1975, Витвицкий В.М., Федорина А.П. 1972, Коршун И.В. 1969 /.
Аврех В.В. /1954/ предлагал использовать фаги специфические по отношению к различных видам сальмонелл, считая данный метод более надёжным, чем реакция с монорецепторными сыворотками. Для быстрой диагностики бактерий кишечной группы В.А. Килессо /1960/ применяла сальмонеллёзный О-фаг с широким спектром действия, лизирующий 40 различных серотипов сальмонелл, а также некоторые штаммы шигелл. Л.И. Адельсоном с соавт. / 1957 / были получены фаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам серотипов 026: 055: 0111, и с успехом применявшиеся ими для идентификации этих бактерий.
Попхадзе М.З. (1968) в своей работе указывал, что применение активного поливалентного бруцеллёзного бактериофага, обладающего строгой видовой специфичностью, позволяет идентифицировать 93-99% культур бактерий, включая атипичные формы, чем и определяется его высокая диагностическая ценность.
В одним из первых в ветеринарной практике, фагоидентификация была предложена Цветковым (1941), при паратифозном аборте у кобыл. П.В. Лихачев в 1948 году провёл испытание фага при диагностике паратифа свиней. Дальнейшие работы в этой области исследований подтвердили значимость выбранного направления.
Н.И. Николаенко, И.К. Тутов /1970/ отмечает перспективность использования бактериофага лизирующего Salmonella abortus ovis позволяющего сократить сроки диагностики до 4-6 часов.
По данным И.И. Ревенко /1978/ коли-гертнер-фаг обладает довольно широким диапазоном литической активности. При испытании 206 культур S. enteritidis, выделенных от телят и коров в разное время и в различных местностях, этот фаг лизировал 164 культуры /79,6%/. Кроме того, он лизировал значительное количество культур S. suipestifer и S. cholerae suis, выделенных от поросят. В отношении культур E.coil, выделенных от телят, коров и свиней различного возраста, коли-гертнер-фаг оказался малоактивным: из 270 культур он лизировал только 15,7% штаммов.
В широкой практике ветеринарных лабораторий рекомендуются сибиреязвенные бактериофаги К - ВИЭВ и g - МВА для идентификации сибиреязвенных бактерий (Мещеряков А.Я. 1962., Павлова И.П. 1971.).
Находят применение и листериозные фаги, позволяющие идентифицировать свыше 85% культур листерий /Н.А. Капырина, И.А. Бакулов, 1972 /.
По мнению указанных выше авторов, проба с бактериофагом, в силу его специфичности и избирательности действия, является наиболее надёжным методом идентификации инфекционных болезней животных и человека.
В эпидемиологической и эпизоотологической практике всё большее распространение получает метод фаготипирования бактерий. Практическая ценность этого метода определяется относительной стабильностью фаготипов бактерий. Как указывает В.Б. Аврех /1959/, фаготип бактерий отражает то тонкое антигенное строение бактерий, которое не улавливается серологическими реакциями и может быть определено только при помощи бактериофагов. Установление этих тонких различий и даёт возможность определять эпидемиологические или эпизоотологические связи, так как при наличии таких связей выделяются штаммы бактерий, характеризующиеся одинаковой фагомозаикой.
Метод фаготипирования бактерий может быть использован не только для повышения качества эпидемиологического и эпизоотологического исследования, но и с целью улучшения лабораторной диагностики, как метод ускоренной идентификации микроорганизмов.
Фаготипирование микроорганизмов можно проводить двумя методами. Первый метод фаготипирования, наиболее часто применяемый в практике, основан на определении чувствительности исследуемой культуры к стандартным препаратам специфических бактериофагов, взятых в определённом разведении. Второй метод фаготипирования бактерий заключается в разделении их на группы по характеру выделяемых из культур умеренных фагов. В медицинской практике этот метод используется очень редко, а в ветеринарной - вообще не применяется.
Впервые фаготипирование с помощью, так называемых, Vi - фагов, предложили в 1938 году J. Craigie ,C. Yan для культур возбудителя брюшного тифа. В 1947 г. J. Craigie, А. Felix была отработана методика типирования брюшнотифозных бактерий, с помощью которой можно было определять 53 типов брюшнотифозных культур.
Практическая ценность типирования брюшнотифозных бактерий с помощью Vi-фагов была показана большим количеством исследователей. Типирование брюшнотифозных бактерий проводится в настоящее время по стандартной схеме, разработанной J. Craigia, A. Felix, /1947/. Большинство исследователей подчёркивает стабильность фаготипов брюшнотифозных бактерий.
Фаготипирование, как метод идентификации, разработан в отношении широкого спектра возбудителей: брюшнотифозных и паратифозных А и Б бактерий, палочек Бреслау (Craigie J. et all. 1938., Гордина Р.В. 1954, Гуторова Л.Д. 1958.). Разработаны схемы типирования дизентерийных бактерий Зонне /III/, известны попытки типирования плазмокоагулирующего стафилококка, энтерококка, дифтерийных бактерий). Ряд диагностических фагов: типовые паратифозные А и B, Vi-брюшнотифозные, типовые дизентерийные фаги к Sh.Sonne, колифаги, стафилококковые и другие, предлагают применять для внутривидовой дифференциации бактерий (Кац - Чернохвостова Л.Я. 1947, Крылова М.Д. 1961, 1963., Наурызгалиев С.Н. 1978.). Оригинальную схему для фаготапирования S.thyphimurium разработали Л.Г. Чиракадзе с соавт. /1974/. Литическую реакцию изучали у 2708 штаммов S.thyphimurium как эталонных и музейных, так и выделенных из разных источников при помощи 16 типовых фагов.
Ценность метода фаготипирования состоит в том, что фаготип - самый тонкий из маркеров, и определение фаготипа маркирует штамм сразу по нескольким меткам в строго определённом сочетании.
В ветеринарной практике одними из первых применили фаготипирование Давиденко Т.А. 1972, Никитюк Н.М. 1970, Архангельский И.И., Б.А. Степанов 1966, А.И. Ивашура 1967, Б.А. Байрак 1970, Л.И. Петрушина 1967. В своих исследованиях они указывают на эффективность фаготипирования сальмонелл, которые выделяются от различных видов животных, из мяса и других субстратов; фаготипирования стафилококков, выделяемых из молока при маститах у коров, для выяснения связей между этими заболеваниями и пищевыми токсикоинфекциями у людей. И.П. Ревенко (1970) установил, что метод фаготипирования позволяет отличать культуры эризипелотриксов, выделяемых из различных источников, и может быть использован в эпизоотологической практике для выяснения связей между отдельными случаями заболевания рожей различных животных и человека.
Определяя фаготипы бактерий, вызывающих заболевание, можно, не только распознать подлинный источник возбудителя инфекции, но и проследить сложный путь возбудителя от источника к восприимчивому организму. По образному выражению А.С. Кривиского /1962/ "нередко фаг, как настоящий следопыт, помогает эпидемиологу и врачу-инфекционисту распознать возбудителя, проследить за его распространением и обезвредить источник его происхождения, предотвращая тем самым распространение эпидемии, соответственно и эпизоотии".
Следует отметить, что методы фагодиагностики, включая идентификацию и фаготипирование, базировались на регистрации лизиса выделяемых культур, вызванного фагом с известным диапазоном действия. Таким образом, фаг в этих случаях представляет собой индикатор, устанавливающий видовую или типовую принадлежность микроба, выделенного из исследуемого материала при помощи обычных методов. Иными словами, при данном принципе использования фага частота получения положительных ответов не возрастает, и фаг в данном случае выполняет функцию вспомогательного теста, устанавливающего природу выделенного возбудителя. Вместе с тем фаг может быть использован для обнаружения возбудителя без выделения чистых культур.
На возможность использования фагов для обнаружения патогенных бактерий без выделения их в чистом виде независимо друг от друга указали ряд авторов. В 1936 году Ф.И. Сергиенко пытался применить этот метод путём посева материала в определённые разведения фага с последующим учётом нарастания его титра для обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий. Katznelson H., M. Sutton, /1951/ использовали фаг для выявления фитопатогенных бактерий в семенах бобов, I. Sechter, /1962/ - для обнаружения брюшнотифозных бактерий. Однако перечисленные выше работы носили чисто эмпирический характер. В них отсутствовало надлежащее теоретическое обоснование принципа. И лишь В.Д. Тимаков и Д.М. Гольдфарб /1955/, основываясь на специфичности действия бактериофага и сравнительной простоте количественного учёта его, теоретически обосновали и экспериментально разработали принципиально новый метод для обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий, названный ими реакцией нарастания титра фага /РНФ/, который в отличий от существующих методов фагодиагностики позволяет выявлять возбудителя непосредственно в исследуемом материале без выделения чистой культуры.
Адсорбция слагается из двух фаз, первая из которых является обратимой, а другая необратимой.
Первая фаза заключается, очевидно, в образовании электростатических связей между различно заряженными аминогруппами отростка фага и карбоксильными группами поверхности бактериальной клетки, обусловлено электростатическими силами и происходит в результате столкновения фаговых карпускул и клетки. На процесс адсорбции бактериальных вирусов влияют различные электролиты (P. Rees, B. Fry 1981). Установлено, что лишь при определенной концентрации и состава минеральных солей можно наблюдать полную и быструю адсорбцию (О.М. Дроздова и др. 1988). Вместе с тем при одной и той же ионной силе среды степень адсорбции зависит также от физиологического состояния бактерий, множественности инфицирования, температуры и рН среды (И.М. Габрилович, 1973; В.А. Булавкина, 1974; Н.Л. Лешкович, 1979; H. Dabud et al, 1980), степени выживаемости энергетического метоболизма клетки (D. Skandella, W. Arber, 1974, S. Kanegasaki, T. Tomita,1976, М.В. Тюрин, М.Б. Шепдеров, 1988).
Вторая - необратимая фаза адсорбции, обусловленообразованием тесной связи между специальными рецепторным аппаратом фпага и клеткой (И.П. Ривецко, 1978) и характеризуется, высокой энергией связывания типичной для реакций с образованием ковалентных связей (А. Feucht et al, 1989).
Взаимодействие фагов со специальными рецепторами является, очевидно, общим процессом для бактериальных вирусов различных видов микроорганизмов, а определение величины и скорости адсорбции бактериофагов служит одним из тестов для их биологической характеристики (А.В. Тимакова, 1966).
Поскольку рецепторы должны быть доступны для бактериальных вирусов, анриории можно утверждать о расположении их на поверхности клеток.
Хотя химическая природа клеточных фагорецепторов не выяснена, следует пологать, что она весьма разнообразна (R. Valyasevi et al., 1990, S. Merino et al. 1990). У многих грамотрицательных, микроорганизмов фагорецепторы ассоциированы с липополисахарид (ЛПС) - белковым комплексом (K. Lych et al., 1978; F. Castillo, 1980; K. Yarrell, A. Kropinsk; 1981).
Ведущая роль в необратимой инактивации бактериальных вирусов у грамположительных бактерий принадлежит комплексу тейхоевой кислоты и пептидогликака (И.В. Домарадский, Т.И. Домарадская, 1988).
Кроме клеточной стенки фагорецепторы могут распологаться на других структурах микроба на пилях жгутика, капсуле (А.А. Lindberg, 1973, Y. Wilson, I. Takahashi, 1978, M. Bayer et al.1979, M. Saxelin et al., 1979; S. Merino et al. 1990).
Вполне вероятно, что существуют общий механизм первичных этапов рецепции в различных биологических системах, связанных с тем, что на поверхности клетки экспонируются участки, обеспечивающие сродство для клеток-белковых взаимоотношений (А.А. Лихачёва, С.П. Синеокий, 1989).
При исследовании бактериальных вирусов большое значение имеет изучение специфичности начальных этапов взаимодействия фага с клеткой. Возможно, что узнавание рецепторов фагом происходит в результате ферментно-субстратной связи (R. Chaby, R. Girard, 1980), а специфичность бактериофагов в определенной мере условно и зависит, вероятно, от химического строения рецепторов клетки и собственно строения фага (L. Gloser et al. 1966, F. Young, 1967; Ю.С. Бабенко, М.З. Хаин, 1979; Л.Н. Шошиев, Н.Н. Новосельцев, 1980; Н. Steensma, 1981). По-видимому, одни рецепторы требуют менее сложной структурной организации отростка фаговой частицы, другие более сложной. Возможно одна и та же бактериальная клетка имеет рецепторы для нескольких различных фагов, каждый из которых соединяется лишь с определенными рецепторами (Д.М. Гольдфарб, 1961).
Вслед за адсорбцией происходит инфицирование клетки фагом, ведущее к диссинации трансмембранной разности электрических потенциалов и обратимой стимуляции клеточного дыхания (А.И. Винников и др.1989). Проникновение фагового генома в бактерию сопровождается физическим отделением нуклеиновой кислоты от большой части капсидных белков, которые остаются снаружи (А.D. Hershey, M. Chase, 1952). Механизм передачи фагового генома в клетку достаточно сложный и до конца не изучен, Возможно, что переносу фагового генома в бактериальную клетку способствует сокращение белковых структур головки фага и повышение в ней осмотического давления, а проникновение сквозь жесткий внутренний слой клеточной стенки осуществляется с помощью фермента, изодинамического лизоциму (В.А. Зуев, 1963, 1969).
После проникновения нуклеиновой кислоты начинается второй этап взаимодействия вириона с клеткой - период внутриклеточного развития, под которым понимают отрезок времени с момента инъекции фагового генома в клетку до полного созревания в ней фаговых корпускул.
Электронно-микроскопическое изучение ультраструктурных изменений в клетки при развитии бактериальных вирусов показало, что процесс развития вирионов происходит в области нуклеоида. Структурные изменения обнаруживаются обычно не ранее 10-15 минут после инфекции фагом, (С.А. Погорельская, 1969; C. Meyvisch et al., 1974) и проявляются в стирании четкой границы между ядерной субстанцией и цитоплазмой. В дальнейшем, идёт накопление фонда фаговой ДНК, её "конденсация" с образованием дискретных, лабильных структур с последующим их уплотнением (А.С. Тихоненко, 1968; Е.И. Смирнова, Н.Л. Новикова, 1976; И.Я. Худяков, А.В. Матвеев, 1981). Вслед за образованием новых молекул фаговой ДНК и достижением ею определённого уровня, начинается синтез белков капсида и образование предшественника головки, в которую затем инкапсидируется ДНК (T. Shea et al, 1979). Заключительный этап внутриклеточного развития - самосброска фаговых частиц, разрыв клетки и высвобождение клеточных вирионов, Лизис инфицированных фагов бактерий связан, вероятно, с действием фаг-индуцируемых ферментов, которые способны деградировать клеточные стенки (C. Ronda et al., 1989).
Важной биологической особенностью каждого конкретного бактериофага является величина латентного периода - интервал между исчезновением высееных вирионов и выходом в среду новых фаговых частиц (А.Д. Гендзехаррдзе, 1974; В.С. Ларина, 1974; В.А. Соболевыа, К.И. Качавшили, 1974; N. Hegari, F. Ciampor, 1976; И.П. Ревенко, 1978; M. Maiti, K. Chaudhuri, 1979, 1980, H. David et al., 1980).
Отечественными и зарубежными исследователями описаны фаги с коротким и длинным латентным периодом. Предполагают, что бактериальные вирусы медленно растущих микробов имеют, как правило, более продолжительный латентный период. (N. Hegari, F. Ciampor, 1976, H. David et al., 1980; Л.Н. Синяшина и др.,1982). Пологают, что длительный латентный период является более выгодным для вириона чем короткий, так как позволяет полнее использовать ресурсы клетки (S. T. Abedon, 1989).
При постоянных условиях эксперимента продолжительность латентного периода характерны для каждой конкретной системы фаг-клетка (Д.М. Гольдфарб, 1961).
Важной биологической характеристикой бактериальных вирусов является также "урожай фага". Этот показатель у аэробных спорообразующих бактерий колеблется в пределах от 8 до 1370 корпускул на бактерию (Р.Р. Азизбекян и др., 1977; P. Carvalho, Y. Vary, 1977).
У фагов других видов микроорганизмов урожай также имеет колебания в широком диапазоне (Н.А. Копырина, 1973; В.А. Горина, Л.Н. Маркина, 1979; M. Maiti, K. Chaudhyri, 1979,1980; W. Gaylor et al.,1980).
Таким образом, приведенные данные литературы показывают насколько глубоко изучен вопрос репродукции фагов. Вместе с тем, очень многие стороны этого сложного явления нам ещё полностью не ясны, и требуется немало усилий специалистов различных областей знаний, чтобы разобраться с проблемой антогенеза бактериальных вирусов.
.2 Некоторые вопросы биологии возбудителя листериоза и диагностики болезни
.2.1 Общая характеристика возбудителя
Листериоз - зооантропонозная болезнь животных и человека, характеризующаяся поражением нервной системы, септическими явлениями, абортами и маститами.
В отличие от таких заболеваний как сальмонеллезы, иерсиниозы и некоторые другие инфекционные болезни листериоз назван не в честь своего первооткрывателя. Возможно, что это связано с тем, что пальма первенства была в руках нескольких исследователей. Пристальное изучение листериоза и его возбудителя началось после публикации в 1926 году E. Murray, R. Webb, M. Swann работы о вспышке новой инфекционной болезни морских свинок и кроликов в питомнике Кембриджского университета и сообщении в 1927 J. Pirie году (Ю. Африка) о инфекционной болезни степных грызунов - "Tiger river disease" (болезни реки Тигр). Однако ещё в 1891 году M. Hayem во Франции и в 1893 L. Henlie в Германии наблюдали грамположительные палочки в срезах тканей пациентов погибших от болезни, которая ретроспективно была определена как листериозная инфекция. В 1892 году Lucent описал септическую болезнь кроликов, выделив бактериальную культуру, идентичную листериозной палочке. В 1911 году шведский ученый G. Hulphers выделил из гнойного узелка печени павшего кролика маленькую грамположительную палочку, похожую по описанию на листериозную. В 1917 году австралийский врач E. Atkinson сообщил о небольшой эпидемии менингита, вызванной грамположительной бациллой дифтероидного типа. Однако зачастую это всё была описательная информация. Первая хорошо сохранившаяся лабораторная культура листерий выделена J. Dumont, L. Cotoni в 1918 году из спинномозговой жидкости солдата больного менингитом. Она через 20 лет хранения в Пастеровском институте была идентифицирована J. Patersonom. Каждый из исследователей самостоятельно давал обнаруженной бактерии родовое и видовое название. И только после работ E. Murray, R. Webb, M. Swann, J. Pirie, когда была установленна идентичность выделенной ими бактериальной культуры, было дано официально признанное название рода Listerella и вида monocytogenes. В 1940 году родовое название изменили на Listeria.
Установлено, что листериоз поражает людей, многие вид домашних и диких животных, а также птиц, Есть сообщения о выделении листерий у рыб, раков, лягушек, некоторых видов клещей, блох, вшей, личинок оводов (Бакулов И.А. 1967)
.2.1.1 Устойчивость возбудители во внешней среде
Листерии могут длительное время сохранять свою жизнеспособность во внешней среде. Об этом свидетельствуют многочисленные данные литературы. Так, М.М. Халимбеков /226/ установил, что листерии сохраняются летом при температурах 26-32 °С в почве в течение 33 дней, в навозе - 22 и в завозной жиже - 27 дней; зимой при температурах 2-7°С в почве - 72 дня, в навозе - 69, в навозной жиже - 40 дней, в сене, соломе и стружке - от 40 до 120 дней.
В.В. Сливко /205/ показал, что листерии, находясь под действием солнечных лучей, сохраняются на поверхности почвы до 12 дней. В почве естественных выпасов, на глубине 2-3 см, они остаются жизнеспособными до 6 месяцев. При низких температурах /осенью, зимой и весной/ листерии на пастбищах или выгульных дворах могут сохраняться в активном состоянии и более продолжительное время. В прудах, болотах, как указывает автор, листерии не погибают в течение 72 дней. Они более трёх месяцев могут сохраняться в кормах. В 1968 году А.А. Триполитова /221/ установила, что в инфицированной воде листерии сохраняют жизнеспособность в условиях термостата, по крайней мере, в течение 2-х месяцев, а при комнатной температуре и в рефрижераторе при температуре 13-15° - до 5 месяцев.
Поманская Л.А. /176-178/, исследуя воду на содержание листерий, пришла к выводу, что этот микроб очень устойчив против воздействия неблагоприятных физических факторов /охлаждение, замораживание, резкая смена температур и прочее/. В её опытах листерии в прудовой воде оставались жизнеспособными от 299 до 928 дней /в зависимости от условий хранения воды/. Она отмечала, что листерии сохраняют свою жизнеспособность на пробах стерильной почвы и фуража в термостате 69 дней, а при комнатной температуре в почве - 42 дня и в овсе - 138 дней. В холодильнике в замороженном состоянии листерии сохранялись в почве в течение года и в овсе около трёх лет. В последующих опытах она установила возможность размножения листерий в почве и воде. Ею установлено, что за 6 суток при температуре 18-20 °С число микробных клеток возрастало: во влажной почве в 1530 раз /влажность 32% /, а в более сухой - в 3164 раза /влажность 25%/. По данным Ю.М. Ахмедова /19/ листерии сохраняют свою жизнеспособность при температуре 18-22 °С в водопроводной воде 395 дней, морской - 462 дня, речной - 540 дней, колодезной - 560 дней, прудовой - 610 дней. При температуре 2-5 °С листерии оставались жизнеспособными в водопроводной воде 475 дней, морской - 514 дней, речной - 572 дня, колодезной - 576 дней, прудовой - 675 дней. Автор показывает, что длительное пребывание листерий в водоёмах /почти 2 года/ не отражается на их биологических и вирулентных свойствах.
Таким образом, можно полагать, что инфицированная листериями вода может быть источником заражения животных и человека и, несмотря на сезонную смену температур, может представлять опасность в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношении.
Селиванов А.В. и Г.А. Гриницина /201/, изучая выживаемость листерий на досках без загрязнений, установили, что во дворе под действием прямых солнечных лучей в весенне-летние месяцы они погибали через 2 суток, в тени - через 5 суток, на дощечках, размещённых в камере, через 5 месяцев. Ими установлено также, что листерии сохраняют жизнеспособность в кале и моче овец от 5 до 12 месяцев. В водостоках возбудитель листериоза может сохраняться от 5 до 76 дней, особенно если он адсорбирован на частицах загрязнений. В воде, в условиях термостата, по наблюдениям авторов, листерии сохраняются свыше двух месяцев, а при комнатной температуре и в рефрижераторе - свыше 5 месяцев. В дистиллированной воде, а также в речной воде при комнатной температуре возбудитель листериоза сохраняется около двух лет, в колодезной воде, в тех же условиях - 15 месяцев. В навозе, по сообщению этих же авторов, возбудитель листериоза сохраняется в осенне-зимний период до 7 месяцев. В весенне-летние месяцы в навозе, находившемся в кошаре и на выгульном дворе, листерии оставались жизнеспособными и 3 месяца сохраняли вирулентность. Они сообщили, что листерии сохраняют жизнеспособность на стенках кошар, полу, кормушках, щитах до 8-12 месяцев, в решётках - до 14 месяцев, на выгульных двориках летом до 15-45 суток, зимой - до 6 месяцев; в грубых кормах - до 8 месяцев, в концентрированных - до 10 месяцев.
Бараненков М.А. /27/ установил, что листерии сохраняются до 90 дней в не консервированных и до 62 дней в консервированных шкурах, павших и вынужденно убитых животных. В последующих экспериментах/27/ им показано, что в воде, инфицированной испражнениями больных листериозом грызунов и дополнительно взвесью бактерий из расчёта 10 млрд. м.т. в 1 литре воды, в летнее время при колебании температуры воды от 7 до 23 °С, листерии сохраняли жизнеспособность до 70 дней, зимой, при колебании температур от +2 до состояния "лёд", более 5 месяцев. В помещениях, на загрязнённых навозом поверхностях, листерии сохраняют жизнеспособность: в весенний период до 48 дней, в летний период до 25 дней, в осенний период до 72 дней, в зимний период до 130 дней. Вне помещений, в затемненных местах, на загрязнённых навозом поверхностях: в весенний период - до 33 дней, в летний - 20 дней, в осенний - до 52 дней, в зимний - 115 дней. В почве: в весенне-летний период - от 33 до 38 дней, в осенне-зимний период более 5 месяцев. Вне помещения во дворе, в осенне-зимний период при колебании температуры наружного воздуха от +4° до -24° и относительной влажности от 62 до 89% листерии сохраняли жизнеспособность: в трупах мышей до 90 дней, в трупах морских свинок - до 120 дней, в трупах кур - до 140 дней. В указанных условиях листерии сохраняются также и в разложившихся трупах.
По данным И.П. Волгина /44/ в условиях Забайкалья в весенне-летне-осенний период листерии сохраняются в комбикорме 188 дней, в овсе - 150 дней, в воде - 140 дней, в сене - 145 дней. В зимне-весенне-летний период срок выживаемости листерий составляет в комбикорме 275 дней, в овсе - 300 дней, сене - 130 дней, в воде -300 дней. По сообщениям автора, культуры листерий, выделенные из объектов, хранившихся в условиях внешней среды, существенно не отличались по своим биологическим свойствам от исходных штаммов.
В исследованиях Жумаева Н.С. /81/ показано, что на пухе и пере листерии могут сохранять жизнеспособность 203 дней, на поверхности яиц - 31 день, в курином помёте 161 день, в подстилке 234 дня, на бязевой ткани 52 дня, на поверхности резины 66 дней.
Из приведённых данных литературы следует, что выживаемость листерий в объектах внешней среды /воде, почве, навозе, зерне и в производственных помещениях/ достаточно велика. Поэтому загрязнённые листериями объекты внешней среды опасны в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношениях.
.2.2 Некоторые особенности эпизоотологии болезни
.2.2.1 Роль больных и переболевших животных как источников возбудителя инфекции
Основным источником распространения листериозной инфекции являются больные животные, переболевшие, а также листерионосители, которые выделяют возбудителя со слюной, калом, экскретами слизистых оболочек /22, 212, 229/.
Больные животные, выделяя в большом количестве листерии с мочой, калом, различными истечениями, молоком, загрязняют корма, воду, предметы. Заражение животных и людей происходит при использовании ими инфицированных продуктов, а также при употреблении овощей без термической обработки, собранных с полей, которые удобряли фекалиями /от носителей - людей и животных/.
Важно знать не только продолжительность бактерионосительства у переболевших листериозом животных, но и степень опасности листерионосителей, как источников инфекции, наличие которых может привести к новым вспышкам болезни.
По наблюдениям М.М. Халимбекова /229/ животные в течение 10-14 дней с начала болезни выделяют листерии во внешнюю среду с носовым истечением, истечением из глаз, с мочой и молоком. Особенно обильно выделение возбудителя с истечениями из половых органов у животных, абортировавших на почве листериоза. Со слизью и истечениями из половых органов листерии выделяются 25-30 дней с момента заражения или 13-14 дней со дня обнаружения первых клинических признаков болезни.
Лысенко И.П. с соавт. /127/ выделяли листерии у овец из ковъюнктивальной слизи через 2 суток, из смывов со слизистой влагалища до 9 суток, из кала - до 16 суток после заражения. Малахов Ю.А. /132-134/ в неблагополучном по листериозу хозяйстве обнаружил листерии у 2% свиней в носовой слизи. По его сообщению экспериментально зараженные крысы выделяли листерии с калом до 20 дней, с носовой слизью и мочой - до 10 дней.
Попов В.И. /181/ сообщил, что при экспериментальном заражении морских свинок и свиней возбудителем листериоза, выделение листерий у переболевших и больных морских свинок происходит с носовыми истечениями, мочой и калом в течение 40 суток, у поросят до 66 суток после заражения.
Изучая листериозную инфекцию у свиней, А.А. Вендров /40/ отметил, что свиньи заражались алиментарным путём, а не путём прямого контакта с больными животными.
О выделении листерии с молоком, носовой слизью, мочой, калом, абортированными плодами сообщают И.А. Попов /180/, Г.Г. Беденашвили /29/, Ch. Lehnert /233/.. Dedie /266/ установил выделение листерии с молоком у коровы до 22 суток, а у овцы - 2,5 года. J. Donker - Voet /268/ описывает случай, когда корова белее трёх лет выделяла листерии с молоком.. Rolle et al. /235/ установил наличие листерий в кале клинически здорового быка. По данным В.В. Сливко /207/ животные в стационарных очагах листериоза могут до 6 месяцев выделять листерии в окружающую среду. М.М. Халимбеков /229/ при наблюдении за 8-ю овцами естественно больныыи листериозом выделял листерии от 3-х - на 2-3 и 11 день заболевания из мочи. У 2-х овец - на З и 5, и у одной - на 11 день листерии были выделены с истечениями из носовой полости, у 2-х животных - на 2-4 день из глаз.
Кролики, переболевшие листериозом, также являются листерионосителями. Так, И.А. Попов /130/ выделял листерии не позже 18 дней после заражения кроликов.
О длительном листерионосительстве сообщают D.F. Eveleth et al. /271/. Они показали, что выздоровевшие животные, помещенные в здоровые стада, обусловливают заболевание овец. В течение 9 лет этим путём было заражено 12 стад овец. Длительные сроки носительства и выделения листерий говорят о том, что необходимо учитывать возможность заноса этой инфекции животными, поступающими из неблагополучных по данной болезни хозяйств в благополучные.
В передаче заразных болезней домашним животным и человеку большую роль могут играть домовые и полевые грызуны. Они могут быть носителями более, чем 20 возбудителей инфекций с природной очаговостью, в том числе и листерий.
Известно, что наиболее частым и опасным источником возбудителя инфекции являются больные домашние и дикие животные с острым течением листериоза и бактерионосители, особенно грызуны. Они своими выделениями инфицируют пастбища, помещения, водные источники, корма, продукты. Попав во внешнюю среду, возбудитель листериоза может длительное время выживать, создавая угрозу перезаражения животных. В помещениях для животных: в кошарах, конюшнях, свинарниках, скотных дворах обитают чаще всего большое количество крыс, мышей, если не проводят регулярные меры по их уничтожению. Роясь в навозе, в ямах с трупами животных, расселяясь по всем помещениям, они загрязняют кормушки, корм, воду, перемещаясь из одного хозяйства в другое.
При обследовании 97 крыс и 53 мышей на листерионосительство из стационарно неблагополучного по листериозу хозяйства, Ю.А. Малахов /133/ выделил 2 штамма листерий от крыс. Н.С.Огнева /157/ при исследовании свыше 100000 грызунов выделила 54 штамма листерий. По её данным, болезнь у них регистрируется в течение всего года, причём увеличение числа заболевших грызунов отмечается весной и осенью.
Юрков Г.Г. /253/ установил взаимосвязь между количеством вспышек листериоза у животных и численностью мышевидных грызунов. Автор сообщает, что в одном хозяйстве заболевание началось через две недели после скармливания овцематкам сена из скирд, в которых было много мышей. При бактериологическом исследовании 32 грызунов, отловленных в скирдах, листерии были выделены у четырёх.
Бакулов И.А. /22/, анализируя многочисленные наблюдения в различных районах страны и за рубежом, пришел к выводу о серьёзной роли грызунов и некоторых других диких животных в эпизоотологии и эпидемиологии листериоза, о возможности циркуляции возбудителя листериоза между дикими грызунами и домашними животными и считает, что листериоз следует отнести к числу факультативно-трансмиссивных болезней с природной очаговостью.
В настоящее время установлена возможность превращения в организме восприимчивого животного листерий в Л-форму. Этому способствует широкое применение антибиотиков, различных лечебных препаратов, а также слабо иммуногенных вакцин.
Установлено, что даже утратившие вирулентность Л-формы, сохраняясь в организме, потенциально опасны, так как при неблагоприятных условиях они могут активизироваться и вызывать заболевание сами или же, превращаясь в результате реверсии в вирулентную бактериальную форму, также вызвать заболевание и явиться причиной распространения инфекции /25, 103, 260/.. Flamm /273/ описал случай листериозного конъюнктивита у рабочих, обрабатывающих птицу. При контрольном обследовании из пяти тушек птиц, подлежащих обработке, были выделены листерии. Установлено, что эти птицы происходили из того округа, где год тому назад наблюдались бактериологически подтвержденные случаи заболевания листериозом. Эти данные, с одной стороны, показывают возможность заражения человека от птицы, и с другой - говорят о длительности листерионосительства у птиц.
Таким образом, роль больных и переболевших животных заключается в том, что они служат источником заражения людей и инфицирования окружающей среды.
.2.2.2 Факторы передачи возбудителя инфекции
Различные элементы внешней среды в подавляющем большинстве своём не являются сами по себе местом естественного пребывания и размножения патогенных микроорганизмов, но будучи инфицированными, они на протяжении определённого времени играют немаловажную роль в передаче инфекций восприимчивым организмам.
Вне живого организма патогенные микроорганизмы могут сохраняться в течение различного времени в воде, почве, навозе и других объектах внешней среды.
Способность листерий длительное время существовать, не утрачивая при этом патогенных свойств, в различных объектах внешней среды обусловливает потенциальную возможность заражения ослабленных молодых и беременных организмов животных и создает предпосылки широкой циркуляции возбудителя в природе, усугубляя эпидемиологическую опасность листериоза для человека. Через продукты животного происхождения, если они получены от больных животных, возбудитель может передаваться человеку и животным. Молоко больных листериозом животных может быть одним из факторов, способных передать возбудителя листериоза человеку и животных. При сосании вымени матерей, доении животных и сдаивании первых порций инфицированного молока, происходит рассеивание возбудителя листериоза на различные объекты в животноводческих помещениях, почву выгулов, пастбищ и т.д.
Инфицирование домашних животных листериозом возможно при поедании грубых кормов и концентратов. По данным I. Weis /312/ в районе Фрайбурга получены патогенные штаммы листерий из 44% проб растений некультивированных лесных пастбищ, из 51% проб поверхностных и 33% глубоких слоев почвы. Автор делает вывод, что природная целлюлоза является подходящей средой для размножения листерий. Ряд авторов указывает, что возникновение и распространение заболевания связано с сохранением листерий в почве /42, 54, 60, 176, 173/.
Водный фактор также играет значительную роль в возникновении эпизоотических болезней. Загрязнение поверхностных водоёмов, а вместе с этим контаминация патогенной микрофлорой рек, озёр, прудов может происходить различными способами. Сильные ливни, смывающие грязь, навоз с поверхности почвы, несут их в открытые водоёмы, способствуя контаминации патогенными микробами.
Помещения, где находились больные животные, окружающие их предметы /перегородки, щиты, кормушки, решетки, остатки кормов и т.п./ могут оказаться инфицированными. В этом случае они могут служить одним из факторов передачи заразных болезней животным и человеку.
Возможным фактором передачи инфекции могут служить трупы животных, погибших от заразных болезней. Если учесть, что при гибели больных сельскохозяйственных и диких животных возможны случаи вскрытия трупов, снятие шкур, растаскивание зверями, птицами, то становится очевидным, что трупы могут представлять опасность при всех инфекциях, возбудитель которых обладает устойчивостью во внешней среде.
Таким образом, инфицированные трупы животных, экскременты, почва, водные источники, помещения, продукты и сырье от животных и другие элементы внешней среды с давних пор известны как места сохранения вирулентных микробов и как эпизоотологические и эпидемиологические факторы, привлекающие внимание эпизоотологов и эпидемиологов.
.2.3 Вопросы диагностики болезни
Лабораторная диагностика листериоза основывается, преимущественно, на бактериологических и серологических методах исследования.
Это положительно окрашивающийся по Граму возбудитель, неспорообразующий, неустойчивый к кислотам. Большинство исследователей отмечали отсутствие видимой капсулы у листерий. Однако, C.W. Smith J.F. Metzger /303/, используя иммуноцитологические, электронно-микроскопические и гистохимические методы исследований указали на наличие у них мукополисахаридной капсулы.
Показательной особенностью листерий является четко выраженная подвижность клетки. Специфика проявления подвижности у листерий /дифференциальный признак от рожистых бактерий/ связана с наличием жгутиков /И.А. Бакулов, З.Н. Меньшикова, Л.Г. Астапович. В.М. Котляров /23/, Н.Д. Константинова, К.Н. Шлыгина /102/. При температуре 22°С листерии имели 1-8 жгутиков, при температуре 37 °С основная масса клеток лишена их и лишь 1-15% имели 1-2 жгутика. Соответственно, все культуры изученных штаммов обладали активной подвижностью при температуре 22 °С, при температуре 37 °С она отсутствовала или была слабовыраженной /З.Н. Меньшикова, 143/.
Листерия особой прихотливостью к питательным средам не отличается. Они растут на обычных питательных средах с довольно широким диапазоном рН /5,6-9,0/. Наиболее благоприятными следует признать среды с рН 7,2-7,4, содержащие глицерин, глюкозу, сыворотку крови, а также печёночные среды. Лучшей питательной средой является мясопептонный печеночный агар и бульон с добавлением 1% глюкозы и 2% глицерина /45, 109, 131/.
На МПА в первые сутки роста наблюдаются мелкие, слизистые, круглые, прозрачные при проходящем или молочно-белые в падающем свете, выпуклые колонии.
На МПБ листерии вначале вызывают равномерное помутнение среды; при встряхивании пробирки заметны муаровые волны, более грубые, чем при росте рожистых бактерий. На 5-7 день бульон просветляется и на дне образуется слизистый осадок, который при встряхивании поднимается в виде косички. Пленки и пристеночного кольца не образуется.
При посеве уколом на МПЖ листерии дают медленный рост в виде узловатой нити или полоски с небольшими отростками. Разжижение желатины не наступает.
Свежевыделенные культуры листерии продуцируют растворимый, фильтрующийся b-гемолизин, способный разрушать эритроциты человека, лошади, крупного рогатого скота, овец, кроликов /92/.
Листерии, по мнению большинства исследователей, по биохимическо-ферментативным свойствам, принадлежат к малоактивным видам бактерий. Они не образуют индола, аммиака, не восстанавливают нитраты в нитриты, не свёртывают и не пептонизируют молоко, не гидролизуют мочевину. Постоянным признаком листерий, который в числе прочих может быть использован для целей дифференциации их от эризипелотриксов, является каталазная активность /22, 236/. /Листерии способны ферментировать, с образованием кислоты /без газа/глюкозу, рамнозу, салицин, левулезу, но не изменяют среду с дульцитом, маннитом, арабинозой, изулином, сорбитом /22/.
Для биологической диагностики листериоза используют белых мышей, морских свинок, кроликов, степных пеструшек. Заражение целесообразно проводить интрацеребрально, внутривенно или подкожно. В.В. Сливио, В.Ф. Фомичев /208/ разработали интракраниальный /внутричерепной/ метод заражения белых мышей. Введение 100 клеток листерий обеспечивает 100% гибель мышей в течение 3-10 дней.
По данным И.А. Бакулова с соавт. /21/, наиболее удобным объектом для постановки биопробы на листериоз при подкожном введении оказалось степные пеструшки, чувствительность которых к возбудителю листериоза превышала чувствительность мышей в 100 тысяч раз.
Для дифференциации возбудителя листериоза от бактерий рожи свиней и определения вирулентности выделенных культур рекомендована конъюнктивальная проба, которая заключается в нанесении испытуемой культуры на конъюнктиву глаза морской свинки или кролика. Специфичным для листерий является развитие /через 2-3 дня/ гнойного конъюнктивита, который переходит в кератит; нередко происходят генерализация инфекций и животное погибает. На ценность и высокую специфичность конъюнктивальной пробы указывают многие исследователи /51, 137/.
Прижизненная диагностика листериоза связана, в первую очередь, с разработкой серологической диагностики, основанной на том, что в крови больных животных накапливаются разные антитела /агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела/. Их накопление происходит в разные сроки после начала заболевания и характеризует определённое состояние организма.
Чаще других используется реакция агглютинации /РА/, которая применяется как для идентификации культур с помощью специфической агглютинирующей сыворотки, так и для прижизненной диагностики путём исследования сыворотки крови с помощью специфического антигена. Данные литературы относительно специфичности РА с листериозным антигеном разноречивы. Некоторые исследователи считают её достаточно специфичной и пригодной для лабораторной диагностики листериоза /146, 172, 206/, другие авторы указывают на наличие нормальных антител у клинически здоровых животных и людей, а также на возможность перекрёстных реакций с другими микроорганизмами, в частности, с энтерококками и стафилококками /71, 297, 298/.
По данным Л.Ф. Николайчук /154/ перекрёстное взаимодействие в РА с золотистым стафилококком наблюдается, преимущественно, в пределах 1 серогруппы листерий. Ею было установлено, что сыворотки здоровых животных взаимодействовали с листериями 1 серогруппы, при этом наибольший процент положительно реагирующих сывороток выявлен у крупного рогатого скота и свиней /37,7% и 40%, соответственно, у кроликов-17,7%, у овец - 30%/.
Бакулов И.А. /22/ сообщает о возникновении перекрёстных РА между листериями и стафилококком, а также возбудителями рожи свиней и бруцеллёза. Неспецифичность РА при листериозе отмечали и другие исследователи /64, 136, 244, 283, 289/.
Ряд исследователей /22, 71, 222, 296/ приходят к выводу, что использование РА необходимо, но что она не может служить единственным методом лабораторной диагностики и является "не утверждающей", а "подтверждающей".
Шлыгиной К.Я. /245/ было обнаружено значительное взаимодействие в РНГА листериозных и стафилококковых сывороток с гетерологичными антигенами /титр 1:1280 - 1:5120/. Перекрёстное взаимодействие в РНГА между листериями I и II серогрупп, имеющих общий антигенный фактор Ш сохранялось даже после адсорбции листериозной сыворотки стафилококком. Следовательно, стафилококк удалял только видонеспе-цифические Рантц антитела, оставляя в листериозных сыворотках антитела специфической части фактора Ш, за счёт которых происходили перекрёстные реакции между двумя серогруппами листерий.
Триполитова А.А. /222/ считает, что в РНГА участвуют, в основном, полисахаридные и монополисахаривные антигенные компоненты, а у листерий эти вещества являются наиболее неспецифическими.
При использовании РП установлена общность антигенов листерий и гемолитических стафилококков /290, 299/..P. Pease с соавт. /233/ доказали существование перекрестного взаимодействия в РДП между листериями и Erysipelathrix rhusiopatiae.
Николайчук Л.Ф. /154/ отмечено перекрёстное взаимодействие в РДП листерий с золотистым стафилококком.
Используя РА, РСК, РДП, H.P.R. Seeliger /237/ показал четко выраженное антигенное родство листерий и энтерококков.
Таким образом, мнения различных исследователей относительно диагностической ценности серологических реакций при листериозе разноречивы, вследствие чего, очевидно, следует считать, что серологические реакции могут использоваться для выявления листериоза только в комплексе с другими методами лабораторной диагностики.
Таким образом, представленные в настоящей главе данные литературы свидетельствуют о том, что листериоз - болезнь широко распространенная как географически, так и по количеству поражаемых представителей животного мира. Наличие больных животных - листерионосителей, существование природных очагов листериоза, длительная сохраняемость листерий во внешней среде объясняют эпизоотологические особенности болезни: листериоз в хозяйствах может продолжаться неделями, месяцами и даже годами.
За листериозом в современных условиях всё более утверждается признание широкой распространенности, эпизоотологической и эпидемиологической важности /26, 77, 135/. Тем не менее, диагностика болезни в значительной степени затруднена. Во-первых, это зависит от различий в биологических свойствах культур, сложности их антигенной структуры; во-вторых, интерпретация результатов серологических реакций затруднительна, так как существуют микроорганизмы, имеющие общие антигены с листериями.
Поэтому окончательный диагноз устанавливают только в случае обнаружения возбудителя.
Однако трудность выделения возбудителя листериоза из объектов внешней среды и патологического материала, заставляют искать такие методы лабораторной Основной задачей данного учебного пособия является демонстрация следующих фактов:
- показать специфичность листериозных бактериофагов и спектр их литической активности;
- описать оптимальные условия постановки РНФ при обнаружении возбудителя листериоза;
- продемонстрировать возможность использования РНФ для обнаружения возбудителя листериоза в патологическом материале и в объектах внешней среды.
Исследователи, работавшие в области лабораторной диагностики листериоза, подчёркивают трудность выделения листерий из организма и различных субстратов, несмотря на то, что лабораторные расы этих микроорганизмов легко культивируются на искусственных питательных средах.
В ходе бактериологического исследования возникают определённые проблемы и при идентификации листерий, имеющих много общего с эризипелотриксами, коринебактериями и другими. Схожими по морфологическим и тинкториальным свойствам бактерий. С большими трудностями и материальными затратами сопряжено получение листериозных антисывороток, к тому же они не всегда обладают строгой специфичностью. Для метода люминесцирующих антител, ИФА, РИА, требуется специальная аппаратура и реактивы. Постановка биологической пробы затягивает бактериологические исследования до 8-14 суток.
Всё это вызывает необходимость разработки более эффективных высокопроизводительных и менее трудоёмких методов диагностика листериоза. Поэтому основной целью исследований представленных в публикации является демонстрация метода по использованию реакции нарастания титра фага /РНФ/ для обнаружения возбудителя листериоза в органах животных и объектах внешней среды.
В начальных исследованиях была изучена специфичность и спектр литической активности листериозных бактериофагов. Эксперименты были проведены с использованием двух листериозных бактериофагов 2A и 4а и 333 штаммов бактерий, из которых 285 гомологичных и 48 гeтepoлогичных. Указанные идентифицированные бактерии были выделены из различных источников, в том числе, от овец, ягнят, поросят, свиней, крупного и мелкого рогатого скота, лошади, кроликов, песцов, птиц и человека, а также из почвы, силоса и отходов мельничного производства. Культуры листерий получены из зон, отличающихся по природно-климатическим условиям. Большинство бактериальных штаммов - 257, присланы из различных областей нашей страны, 28 штаммов получены из Болгария, Германии, Голландии, Канады, Чехословакии,
В результате изучения биологических свойств листериозных бактериофагов установлена их высокая специфичность и активность по отношению к бактериальным культурам Listeria monocytogenes. Фаг 2А лизировал культуры листерий, относящиеся к 1-й серологической группе, а фаг 4А лизировал культуры листерий, относящиеся ко 2-й серологической группе. Какой либо зависимости от вида животного, его географического распостранения или аналогичного происхождения изучаемых штаммов, а так же срока давности выделенных культур не наблюдалось. Как показали исследования, только 4,3% листериозных штаммов не лизировались указанными бактериофагами. Возможно, это связано с наличием в геноме бактериальной клетки профага, сообщающего микроорганизму иммунитет к заражению тем же или близкородственным фагом или же отсутствием в клеточной стенке бактерий специфических субстанций, обеспечивающих первый этап взаимодействия фага с клеткой - адсорбцию.
Отсутствие адсорбции может быть также обусловлено обволакиванием рецепторов слоем какого-либо другого вещества, как, например, у сальмонелл при мутации от шероховатой формы к гладкой /Prehм е. а1. 1976/. По мнению ряда авторов /Luria, Selbruc, 1943/, Г. Стент /1974/ формирование фагорезистентности является результатом спонтанной мутации, а фаг выполняет роль селективного фактора. Кузнецовой В. /1963/ установлено, что появление свойства фагорезистентности необязательно связано с присутствием фага в среде и может возникнуть под влиянием разнообразных воздействий, среди которых важную роль играют антибиотики.
Не исключена возможность, что животные, от которых получены фагорезистентные штаммы, также обрабатывались антибиотиками.
Таким образом, механизм получения устойчивых к фагу культур пока что остается неясен.
Изучение диапазона литического действия листериозных бактериофагов показало высокую их специфичность. Литический спектр фагов l 2А и L 4А не выходят за пределы бактериального вида. При испытании 48 штаммов других видов бактерий, в число которых вошли микроорганизмы, встречающиеся как сопутствующая микрофлора при листериозе /кишечная палочка/ и имеющие антигенное родство /стафилококки/, ни в одном случае не было отмечено наличие чувствительности к литическому действию листериозных фагов.
Особый интерес представляет отсутствие литической активности листериозных фагов по отношению к стафилококкам, имеющим антигенное родство с антигенами листерий.
В экспериментах К.Н. Шлыгиной /1970/ установлено, что перекрёстные серологические реакции у листерий, стафилококков и энтерококков обуславливаются наличием видонеспецифического антигена Рантца, входящего у листерий в состав антигенных факторов. Исходя из полученных данных можно считать, что указанный антиген не является структурным компонентом фаговых рецепторов, чем и объясняется высокая специфичность листериозных бактериофагов по сравнению с серологическим тестом. Определённую ценность имеет работа B.a'atson" 7.3valand /1966/, в которой с помощью флуоресцирующих антител, используемых для демонстрации прикрепления фагов к микробной клетке, доказано отсутствие у листериозных бактериофагов способности адсорбироваться на золотистом стафилококке, имеющих антигенное родство с листериями,.Листериозные бактериофаги 2А и L4A, обладающие высокой видовой специфичностью, могут в значительной степень облегчить задачу дифференциации листерий от антигенно родственных микроорганизмов.
Как указывает В.Д. Тимаков и Д.М. Гольдфарб /1956/, идентификация возбудителей инфекционных заболеваний при помощи бактериофагов является очень тонким методом, превосходящий по чувствительности все известные иммунологические реакции, добавим кроме ИФА, РИА.
Полученные результаты исследований по определению специфичности и спектра литической активности листериозных бактериофагов 2А 4А показывают, что они относятся к числу активных диагностических фагов, дающих возможность идентифицировать свыше 90% культур листерий. Кроме того, различная активность фагов в отношении листерий 1 и 2 серогрупп, позволяет использовать их с целью серогрупповой идентификации.
Полученные результаты по изучению специфичности бактериофагов 2А и l 4А позволили перейти к разработке оптимальных условий постановки РНФ для обнаружения возбудителя листериоза в различныx субстратах. В первую очередь для постановки РНФ были испытаны различные питательные среды. На основании этих экспериментов было показано, что среда, содержащая 0,5% глюкозы обеспечивает лучшую репродукцию фаговых корпускул и позволяет учитывать результаты РНФ на 6 часов раньше, чем на средах без содержания глюкозы.
Указанные выводы о зависимости эффективности в проведении РНФ от используемой питательной среды совпадают с данными Н.А. Капыриной /1974/. Она считает, что инкубирование листерий зараженных фагом, в обогащенной среде, к числу которых относится и бульон Мартена с глюкозой, способствует не только интенсификации внутриклеточного цикла развития вирусных частиц, но и повышает количественное содержание вновь образовавшихся потомков фага в клетке.
Использование при постановке РНФ таких, общедоступных для любой бактериологической лаборатории, питательных сред как: МПБ 1,5 и 0,7% МПА с 0,5 % глюкозой значительно упрощает и облегчает применение РНФ в сравнении с методами бактериологического исследования. Эффективность РНФ от состава питательных сред отмечали и другие исследователи: М. Абдусаматов /1960/, И.В. Дoмapaдcкий с соавт. (1958), С.Е. Филичкин (1965), В.Э. Шнейдерман (1963) при обнаружении возбудителей дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллезе, холеры.
В последующих опытах определяли количественный показатель листериозного фага, имеющий диагностическое значение. Из литературы /Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. 1962/ известно, что при обнаружении дизентерийных бактерий РНФ считают отрицательной, если увеличение количества фага в опытной пробе по сравнения с контрольной составляет до 3 раз. Увеличение количества фага от 3 до 5 раз учитывается как слабо положительная реакция; от 5 до 10 раз - положительная, свыше 10 - резко положительная. При постановке диагноза, методом РНФ, на брюшной тиф Д.М. Гольдфарб, З.С.Островская /1957/ считали РНФ cлaбoположительной, если увеличение количества фага было лишь в 2,5 раза. При увеличении этого показателя в 3-5 и более раз РНФ диагноз считали положительным.
Для определения количества фага, имеющего диагностическое значение при обнаружении возбудителя листериоза, было проведено свыше двух сотен исследований различных субстратов (МПБ, вода, почва) контрольных и инфицируемых культурой листерий обеих серогрупп в концентрации от 10 до 100 000 000 м.т. в мл.
В результате проведенных исследований установлено, что РНФ положительна в случае, если количество "стерильных пятен" на чашках Петри, засеянных из опытных проб, было в 5 рaз больше по сравнению с контролями титра фагов.
Выбранный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага. Достоверность РНФ определяли путём выделения возбудителя листериоза бактериологическим методом исследования и специфичностью РНФ с контрольными пробами.
Выбрав питательную среду для постановка РНФ и определив количество фага, имеющее диагностическое значение при обнаружении возбудителя листериоза в исследуемых субстратах, были начаты исследования по разработке режима PНФ. Для этой цели были поставлены эксперименты с использованием двух основных модификаций, заключающихся в предварительном проращивании или увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом.
При отработке вопросов предварительного подращивания исследуемого материала использовали 7 режимов, различающихся по времени данного процесса (1, 2, 3, 4, 16 часов) и условиям аэрации /шуттелирование/. После предварительного подращивания к исследуемому субстрату добавляли определённое количество фага и смесь выдерживали при температуре 28 °С в течение 8 часов. В результате этих исследований было показано, что при подращивании изучаемого материала в течение 16 часов при температуре 37 С РНФ оказалась менее чувствительной, так как позволяла обнаруживать 105 м.т. в мл. Вероятно, при столь длительной экспозиции /16 часов/ культивирования при температуре 37 °С сильно развивается посторонняя микрофлора, которая оказывает антагонистическое действие на листерии.
При подращивании исследуемого материала в течение 2-х часов при шуттелировании или 3-4 часа без шуттелирования при температуре 37 °С, мы могли обнаружить листерии в исследуемом материале в количестве 103 м.т./мл. Таким образом, эти режимы подращивания мы считаем оптимальными. Для выяснения оптимального времени контакта исследуемого материала с фагом было испытано 5 параметров. В результате этих исследований установлено, что при культивировании исследуемого субстрата с фагом в течение 6 часов при температуре 28 °С заметное нарастание количества листериозного фага наблюдается при концентрации гомологичных бактерий не менее 105 в мл. Удлинение сроков инкубации /16-24 час./ дало возможность получить увеличение количества фага в пределах, имеющих диагностическое значение уже при концентрации листерий 102 до 103 м.т. в мл.
Исходя из выше изложенного можно предположить, что значение инкубации смесей в течение I6-24 часов при температуре 22 °С или 28 °С сводится к тому, что за это время бактерии, находящиеся в исследуемом субстрате в очень малых количествах, размножаются. В результате этого между добавленным индикаторным фагом и бактериями устанавливаются такие количественные соотношения, при которых вероятность встречи между ними повышается и бактерии инфицируются фагом. Отсюда вытекает, что исход реакции зависит не только от свойств индикаторного фага, но и от биологических особенностей данного возбудителя, обнаруживаемого с помощью РНФ.
При этом, как пишет А.П. Пехов /1962/: "Взаимодействие фагов и бактерий представляет собой сложный биологический процесс, характеризующийся полной зависимостью биологии фагов от биологии бактерий и тесной связью жизни бактерий с развитием фагов".
Ранее В.А. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1960) было показано, что чувствительность реакции является функцией времени и концентрации бактерий. Из этого следует, что, как и при выявлении других микроорганизмов, чувствительность РHФ при экспериментальном листериозе является функцией времени и концентрации бактерий. Удлинение срока контакта исследуемого субстрата с фагом способствует выявлению бактерий при незначительном содержании их в объекте исследования. Таким образом, из числа испытанных pежимов наиболее быстрым, но менее чувствительным, является подращивание исследуемого материала в течение 3 часов при температуре 37 °С с последующим контактом исследуемого материала с фагом при температуре 28 0 в течение 8 часов. Учёт результатов проводят в этом случае через 24 часа. Бактерии удается обнаружить в количестве 103 м.т./мл /г/.
Наиболее чувствительным, но более длительным, методом является выдерживание исследуемого материала с фагом /без предварительного подращивания/ в течение 24 часов при комнатной температуре или температуре 280 °С. При данном режиме выявляются листерии в концентрации 102 м.т. мл.г/, на проведение РНФ затрачивается не более 48 часов. Этот метод наиболее удобен в практических условиях лаборатории.
Установив специфичность и спектр литической активности листериозных фагов, и разработав условия и режим постановки РНФ, необходимо было изучить возможность использованная РИФ для обнаружения листерий, прежде всего, в органах и тканях животных. Для этой цели были использованы органы 20 кроликов и 11 овец, павших в результате экспериментального заражения культурой листерий 1 и 2 серогрупп. В качестве контроля в этих экспериментах использовали органы от 10 интактных (незараженных) животных. Для подтверждения специфичности при обнаружении листерий в исследуемых органах было проведено бактериологическое исследование. Листерии в исследуемых органах идентифицировали с помощью листериозных бактериофагов 2А и l 4А методами накапывния и РНФ.
2. Протокол вскрытия
Вскрытие трупа кота возраст 2 года, кличка Барсик, беспородный, владелец Забегайлов, производили ветврач Кондрущенкова С.Ю. в присутствии главного ветврача станции Батырова А.А. в помещении операционной 19.11.2012 г.
Животное было подобрано с улицы весной 2011 г., в возрасте около 6 мес. В июне 2011 г. кота кастрировали. Кот содержался в домашних условиях, на протяжении последних полутора лет получал сухие корма «Whiskas», «Kitekat», «Katinka», а также иногда рыбу и мясо.
ноября 2012 г. владельцы кота заметили многократные, но безрезультатные попытки мочеиспускания и общее ухудшение состояния животного (угнетение, отказ от корма). 10 ноября 2012 г. кот был доставлен для осмотра и лечения на районную станцию по борьбе с болезнями животных (рег. № 197 по амбулаторному журналу).
При осмотре объективно было установлено: ректальная температура 37,6 °С, пульс 120 уд/мин., частота дыхания 20 мин-1; слизистая оболочка ротовой полости, конъюнктива покрасневшие; живот вздут, болезненный при пальпации; в животе обнаруживается переполненный (Æ>10 см) мочевой пузырь; почки увеличены, болезненны при пальпации. Проведенная катетеризация мочевого пузыря выявила обструкцию уретры на уровне седалищной вырезки. Лабораторное исследование выведенной мочи позволило установить диагноз: струвитный уролитиазис, острая задержка мочи.
Лечение кота, начатое 10.11.2012 г., включало в себя внутримышечные инъекции баралгина (по 0,5 мл), викасола (по 0,5 мл), подкожное введение раствора глюкозы (5%-20 мл) с димедролом. Внутрь был назначен метионин по 1/2 таб. 2 р. в день и диетический корм (Whiskas low pH-control diet). Лечение продолжалось в течение девяти дней; весь этот период состояние кота постепенно ухудшалось и в ночь на 19.11.2012 г. кот погиб.
Труп кота доставлен для вскрытия в районную станцию по борьбе с болезнями животных 19 ноября 2012 года.
Наружный осмотр:
.Труп кота вышесредней упитанности лежит на правом боку, передние конечности параллельно вытянуты в положении максимального разгибания. Задние конечности согнуты в тазобедренных, коленных и запплюсневых суставах. Голова и шея вытянуты в положении разгибания.
.Вес трупа около 4 кг, длина тела 45 см. Телосложение пропорциональное, конституция крепкая.
.Температура трупа около 20 °С. Окоченение выражено на жевательной мускулатуре, а также мышцах шеи и передних конечностей. На других участках тела окоченение выражено слабо. Трупные пятна отсутствуют. Трупное разложение не отмечено.
.Шерстный покров равномерный. Шерсть рыжего цвета, взъерошена, тусклая, удовлетворительно удерживается в коже в области промежности и задней поверхности бедер испачкана жидкостью темно-красного цвета с запахом мочи.
.Кожа желтоватого цвета дряблая, в области передней поверхности правого предплечья - синие пятна: следы внутривенных инъекций.
.Ушные раковины подвижные, слуховой проход загрязнен незначительным количеством ушной серы светло-коричневого цвета.
.Глаза открыты, слегка запавшие, веки подвижные, без повреждений; конъюнктива красного цвета, липкая, дряблая; роговица прозрачная; зрачок расширен.
.Ротовое отверстие закрыто, кончик языка выставлен наружу. Окружность губ сухая, чистая.
.Анальное отверстие открыто, запавшее, по окружности слегка испачкано фекальными массами черного цвета.
Внутренний осмотр:
.Молочные железы развиты соответственно полу.
.Подкожная клетчатка хорошо развита, желтого цвета мягкой консистенции, кровенаполнение сосудов слабое (с правой стороны - умеренное). На передней поверхности правого предплечья вдоль подкожной вены - кровоизлияния. Значительные скопления жира симметрично располагаются вдоль прямых мышц живота под кожей брюшной стенки.
.Поверхностные лимфоузлы (исследовали подчелюстные и паховые) не увеличены, подвижные, плотной консистенции, на разрезе суховатые, серого цвета.
.Мускулатура развита удовлетворительно. Мышцы с поверхности и на разрезе темно-красного цвета липкие, дряблые, без повреждений.
.Сухожилия белого цвета упругие, блестящие.
.Целостность костей не нарушена. Окостенение диафизов длинных трубчатых костей хорошо выражено. Надкостница бледно-красного цвета, гладкая, блестящая. Подвижность задних конечностей в суставах хорошая, на передних конечностях - затруднена вследствие окоченения. Полость суставов (исследовали коленные и тазобедренный) содержит небольшое количество вязкой прозрачной жидкости соломенного цвета. Суставные поверхности костей гладкие, блестящие, белого цвета, без видимых повреждений.
.Грудная полость содержит 10 мл прозрачной жидкости красного цвета. Положение органов грудной полости анатомически правильное. Париетальная и висцеральная плевра гладкая, блестящая, влажная, прозрачная, сосуды плевры запустевшие. По всей поверхности париетального листка - множественные точечные кровоизлияния.
.Бронхиальные и средостенные лимфатические узлы не увеличены.
.Диафрагма темно-красного цвета, без повреждений, блестящая, купол диафрагмы находится на уровне восьмого ребра.
.Гортань, трахея и главные бронхи не повреждены. Слизистая оболочка их матовая, липкая, желтовато-серого цвета.
.Легкие с поверхности и на разрезе неравномерно окрашены от красного до темно-красного цвета, верхушечные доли обоих легких более светлые. Консистенция легких равномерно мягкая, на ощупь наблюдается крепитация, с поверхности разреза стекает небольшое количество красноватой пенистой жидкости. Кусочки легкого, опущенные в воду хорошо держатся на поверхности.
.Полость перикарда содержит около 3 мл прозрачной желтовато-красной жидкости. Перикард матовый, гладкий, снаружи покрыт жировыми отложениями желтого цвета, толщина перикарда 2 мм.
.Сердце овальной формы, увеличено. Эпикард гладкий, прозрачный, мутный. Коронарные сосуды умеренно кровенаполнены. Под эпикардом диффузно расположены множественные кровоизлияния.
.Миокард дряблой консистенции, с поверхности и на разрезе неравномерно окрашен: на кирпично-красном фоне встречаются участки светло-коричневого цвета со сглаженным рисунком волокон, соотношение толщины стенок левого и правого желудочков - 1:3.
.Желудочки и предсердия равномерно расширены и заполнены не свернувшейся кровью.
.Эндокард гладкий, блестящий, прозрачный с желтоватым оттенком. Клапаны сердца анатомически правильной формы и размеров блестящие, гладкие, без каких-либо наростов и наложений, сухожильные струны клапанов эластичные, не повреждены.
.Аорта заполнена не свернувшейся кровью темно-вишневого цвета. Стенка аорты потная, упругая, толщиной в области дуги 3 мм.
.Брюшная полость содержит около 10 мл прозрачной жидкости соломенного цвета с запахом мочи и ацетона. Положение органов брюшной полости анатомически правильное.
.Париетальная и висцеральная брюшина гладкая, блестящая, прозрачная. Сосуды брюшины запустевшие, с правой стороны - умеренно кровенаполнены. Под париетальным листком брюшины диффузно расположены множественные точечные кровоизлияния.
.Брыжейка и сальник содержат значительные отложения жира бледно-желтого цвета. Между листками серозной оболочки сальника - участки множественных кровоизлияний. Сосуды брыжейки и сальника умеренно наполнены темно-вишневой не свернувшейся кровью.
.Брыжеечные лимфатические узлы не увеличены, на разрезе суховатые, желтовато-серого цвета, плотной консистенции.
.Слизистая оболочка ротовой полости красного цвета, мутная, гладкая, липкая. Количество и развитие зубов соответствует виду и возрасту животного. Кончик языка зажат между резцами. Язык красного цвета, поверхность его мутная, липкая. Десна интенсивно красного цвета.
.Глотка и пищевод без видимых повреждений. Их слизистая оболочка желтовато-серого цвета, мутная, складчатая, покрыта небольшим количеством желтоватой тягучей слизи.
.Желудок пустой, анатомически правильной формы. Стенка желудка дряблая, равномерной толщины. Слизистая оболочка желудка мутная, не утолщена, покрыта желтоватой слизью. Под слизистой оболочкой - небольшое количество точечных кровоизлияний.
.Двенадцатиперстная и тощая кишки - без содержимого, подвздошная кишка содержит незначительное количество газов. Под серозной оболочкой тонкого отдела кишечника - множественные полосчатые кровоизлияния. Стенка тонкой кишки не утолщена. Слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки мутная, покрыта небольшим количеством желтой слизи. Слизистая оболочка тощей и подвздошной кишок мутная, не утолщена, покрыта беловатой слизью и темными остатками переваренного корма.
.Ободочная кишка содержит небольшое количество черного кала мягкой консистенции. Прямая кишка пустая. Слизистая оболочка толстой кишки гладкая, мутная, местами покрыта небольшим количеством слизи.
.Поджелудочная железа желтовато-розового цвета, плотной равномерной консистенции, длиной 8 см.
.Печень не увеличена: края органа острые. Капсула печени гладкая, блестящая, прозрачная. С поверхности и на разрезе печень коричневого цвета, окрашена неравномерно. Соскоб скудный. Консистенция печени дряблая, кровенаполнение слабое. Желчный пузырь слабо наполнен вязкой жидкостью желто-зеленого цвета, слизистая оболочка желчного пузыря гладкая, блестящая, не утолщена.
.Селезенка дряблая красновато-лилового цвета длиной 7 см, края острые, соскоб умеренный кровянистый.
.Почки симметрично увеличены. Околопочечная жировая клетчатка развита хорошо. Капсула почек гладкая, прозрачная, блестящая, снимается легко. Под капсулой обеих почек видны темно-красные пятна округлой формы диаметром от 2 до 6 мм. Цвет почек с поверхности и на разрезе коричнево-красный. Границы между корковым, пограничным и мозговым слоями сильно сглажены. На разрезе почек - темно-красные пятна треугольной формы, направленные вершиной к почечной лоханке. Лоханки почек пустые. Слизистая оболочка лоханок матовая, гладкая.
.Мочеточники без видимых повреждений, проходимость мочеточников хорошая.
.Мочевой пузырь слабо наполнен жидкостью темно-красного цвета. При промывании мочевого пузыря обнаружено 23 конкремента размером от 1 до 5 мм. Стенка мочевого пузыря утолщена, под серозной оболочкой - множественные полосчатые кровоизлияния. Слизистая оболочка мочевого пузыря складчатая, утолщенная, местами повреждена (царапины).
.Проходимость уретры удовлетворительная. Слизистая оболочка уретры местами утолщена, поцарапана. Вдоль мочеиспускательного канала, особенно в области седалищной вырезки - множественные кровоизлияния.
.Семенники отсутствуют.
.Половой член бледно-красного цвета, головка его - вишнево-красная, отверстие мочеиспускательного канала окружено темно-красными корочками.
.Кости черепа анатомически правильной формы, целостность черепной коробки не нарушена. Головной мозг бледно-серого цвета, желеобразной консистенции. Сосуды головного мозга умеренно кровенаполнены, под мягкой оболочкой мозга - единичные точечные кровоизлияния.
.Спинномозговой канал не вскрывали.
3. Патологоанатомические диагнозы
- Множественные кровоизлияния под плеврой и брюшиной.
- Серозный перикардит.
- Дилятация сердца.
- Дистрофия миокарда.
- Восковидный некроз сердечной мышцы.
- Дистрофия печени.
- Дистрофия почек.
- Геморрагические инфаркты почек.
- Цистит.
- Уролитиазис.
- Уретрит.
Специальные исследования не проводились.
На основании анамнеза, клинических признаков и результатов патологоанатомического вскрытия трупа кота, принадлежащего г. Уральск, проживающему по ул. Заводская, 16 кв. 37, можно заключить, что смерть животного наступила в результате остановки сердца, произошедшей из-за декомпенсированной сердечной недостаточности. Уремия и ацидоз были проявлениями прогрессирующей почечной недостаточности, к которой привело длительное механическое нарушение оттока мочи (первичная обструкция уретры уроцистолитом) вследствие образования конкрементов (струвитных уроцистолитов) в мочевом пузыре.
4. Этиопатогенез и дифференциальный диагноз
Листериоз (Listeriosis) - инфекционная болезнь животных, протекающая с признаками поражения центральной нервной системы (менингоэнцефалиты), половых органов (аборты, метриты), молочной железы (маститы), в виде общего лихорадочного заболевания (септицемия).
Листериям свойственна изменчивость: температура культивирования ниже оптимальной ведет к изменению формы микробных клеток и числа жгутиков; при выращивании на твердых средах колонии S-формы превращаются в R-форму; под влиянием ряда факторов (пенициллин и др.) образуются L-формы; под действием стрептомицина возникают стрептомицинорезистентные, а под влиянием ультрафиолетовых лучей - радиорезистентные мутанты
Предрасполагающими факторами, ведущими к закупорке уретры являются уретрит, неоплазия и стриктура уретры. Кастрация является предрасполагающим фактором к нарушению водного обмена из-за ожирения животного.
В данном случае предположительно имели место диетзависимые причины в комплексе с ожирением (наиболее характерная ситуация при мочекаменной болезни у котов).
Заражение животных листериозом в естественных условиях происходит через слизистую оболочку носовой и ротовой полостей, конъюнктиву, пищеварительный тракт, поврежденную кожу. Внедрение листерий в организм может привести к развитию сепсиса, поражению отдельных органов и систем, а также к бессимптомному переболеванию. Возникновение различных форм болезни зависит от вирулентности микроба, инфицирующей дозы, путей заражения, а также от возраста животного, физиологического состояния (беременность), характера кормления и содержания, наличия сопутствующих заболеваний.
Распространение листерий по организму происходит нейрогенным (по периневральным путям), лимфогенным и гематогенным путями. Листерий попадают в различные органы, в том числе, преодолевая защитный барьер, проникают в головной мозг. По современным представлениям, листерий в организме в основном размножаются внутри макрофагов. Инфицированным свободным и фиксированным макрофагам отводится особая роль в распространении и сохранении листерий в организме. У взрослых животных чаще поражается центральная нервная система, а в период беременности - половая система. У молодняка развивается сепсис, а затем генерализованный гранулематоз. У взрослых животных болезнь протекает иногда бессимптомно, при этом животные длительное время остаются носителями листерий. Длительное листерио-носительство обусловлено неспособностью макрофагов полностью фагоцитировать возбудителя, чему также способствует продолжительный (до года) срок жизни макрофагов.
Образование камней в мочевом пузыре протекает бессимптомно, пока они не начинают продвигаться с мочой по уретре. Раздражая слизистую оболочку уретры, камни вызывают болевую реакцию при мочеиспускании и рефлекторный спазм этрузера, что клинически выражается в учащении мочеиспускания при малом количестве мочи, выделяемой за один акт. Травмированная уролитами слизистая оболочка уретры воспаляется и отекает, что сопровождается сужением просвета мочеиспускательного канала и повышением вероятности его закупорки. При сокращении мочевого пузыря камни, находящиеся в нем, травмируют слизистую, иногда повреждая капилляры (клинически это выражается в виде гематурии). При неполной обструкции уретры уролитом на поверхности последнего адсорбируются клетки десквамированного эпителия, мелкие кристаллы (песок) эритроциты, лейкоциты, вызывая образование уретральной пробки. Прекращение адекватного выведения мочи сопровождается безрезультатными позывами к мочеиспусканию, сильной болевой реакцией, угнетением. Перенаполнение мочевого пузыря ведет к усилению вышеназванных симптомов, а также способствует диапедезу клеток крови из сосудов стенки пузыря в мочу и всасыванию компонентов мочи в кровь. При затянувшейся задержке развивается мочевой перитонит вследствие пропотевания мочи в брюшную полость, происходят дегенеративные изменения в клетках стенки мочевого пузыря под действием компрессии, прогрессируют уремия и гидронефроз. Каждое из перечисленных осложнений сопровождается характерными клиническими признаками.
5. Дифференциальный диагноз
При нервной форме ярко выраженных признаков, патогномичных для этой болезни, установить, как правило, не удается. Обнаруживают лишь инъекцию сосудов и отек мозга, кровоизлияния в мозговой ткани и в отдельных внутренних органах. При гистологическом исследовании отмечают менингоэнцефалит.
При септической форме болезни регистрируют гиперемию или отек легких, катар слизистых оболочек пищеварительного тракта, кровоизлияния в сердечной мышце и паренхиматозных органах, увеличение селезенки, дегенеративные изменения и некротические очажки в печени, селезенке, почках, миокарде; увеличение лимфоузлов.
При поражении половых органов у самок обнаруживают эндометрит или метрит.
Заключение
Морфологически листерии представляют собой мелкие кокковидные палочки длиной 0,5-2 мкм и шириной 0,4-0,5 мкм, факультативные аэробы, хорошо, но не обильно развиваются на обычных нейтральных или слабощелочных (при рН 7,0-7,2) мясопептонных средах, пышно растут при добавлении в среды глюкозы или сыворотки. Листерии ферментируют <#"justify">Список литературы
1.Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблемы и факты / В.Ю. Литвин, Е.Н. Емельяненко, В.И. Пушкарева // Микробиология, 1996. - №2. - С.76-83.
2.Поздеев О.К. Медицинская микробиология / О.К. Поздеев - М.: FЭOTAP-Медиа, 2006. - с.302-310.
.Радчук Н.А, Дунаев Г.В. Ветеринарная микробиология и иммунология / Радчук Н.А, Дунаев Г.В. - М.: Агропромиздат, 1991. - с.202-205.
4.Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / И.С. Тартаковский. - М.: Наука, 2002. - с.130-145.
.Тимаков В.Д., Левашев В.С. Микробиология / В.Д. Тимаков, В.С. Левашев. - М.: Медицина, 1983. - с.344-349.
6.Черкасский Б.Л. Частная эпидемиология / Б.Л. Черкасский.-М.: «Интерсэн», 2002.- с. 354-359.
.БМЭ/ под редакцией Б.В. Петровского. - М.: Советская энциклопедия, 1980. - с. 200-205.
.Под редакцией Третьякова А.Д. //Организация и экономика ветеринарного дела / Агропромиздат. 1987.
.Под редакцией Конопаткина А.А. //Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных /Колос, 1984
. Безредка А.М. Местная иммунизация 1925.
. Вышелесский С.Н. Антисибирязвенная сыворотка и ее практическое применение. Труды 2-го Всероссийского ветеринарного съезда, 1910.
. Гинсбург Н.Н. Сибирязвенная вакцина СТИ. Сборник работ НИИЭГ, вып.1, Медгиз, 1946.
. Гордзялковский И. Причины осложнений при предохранительных прививках сибирской язвы. //Архив ветеринарных наук №10, 1909.
. Михин Н.А. Методы и научное обоснование борьбы с сибирской язвой. Труды 1-го Всес. Вет. Научно-организ. - съезда, 1927.
.Нагорский В. Опыт эпизоотологии. Сибирская язва. СПб,1902.
. Олсуфьев Н.Т. и Лелеп П.П. О значении слепней в распространении сибирской язвы. В книге: Паразиты, переносчики и ядовитые животные, 1935.
. Покшишевский Н.А. и Головин А.Д. Сибирская язва как почвенная инфекция. «Практическая ветеринария», № 7, 1931.
. Степанова Е.П. О сущности иммунитета при сибирской язве. Сообщение IV. О значении вегетативной нервной системы в инфекции и иммунитете. «Ветеринария», №5, 1951.
. Терентьев Ф.А. и Зотов А.П. Современное состояние вопроса об организации мер профилактики и борьбы с сибирской язвой. Сибирская язва. Работы XI Пленума ветеринарной секции ВАСХНИЛ, Сельхозгиз, 1940.
. Терентьев Ф.А. Сибирязвенная сапонинвакцина. Труды ВИЭВ, т. XIII, 1937.
. Терентьев Ф.А. и Старцев И.С. Осенние противосибирязвенные прививки и их эффективность. «Ветеринария», №3,1941.
. Терентьев Ф.А. и Степанова Е.П. К вопросу о роли нервной системы в иммуногенезе и новом принципе вакцинации инактивированной микробной культурой. Труды ВИЭВ, т. XIX, вып. 1, 1952.