Почвенные и водные бактерии-деструкторы полигидроксиалканоатов
Содержание
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Характеристика полигидроксиалканоатов
1.2 Области применения полигидроксиалканоатов
1.3 Биодеградация полигидроксиалканоатов
1.4 Выявление микроорганизмов-деструкторов
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде
2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве
2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария
2.2.2 Определение активной кислотности почвы прикорневой зоны
лиственницы
2.3 Определение способности бактерий к биодеградации
2.4 Методы идентификации микроорганизмов
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и
полигидроксигексаноата в прикорневой зоне лиственницы
3.2 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и
полигидроксивалерата в пресной воде
Заключение
Список используемых источников
Приложения
Одним из решений экологической проблемы утилизации и
переработки полимерных отходов является получение биоразлагаемых материалов.
Возможность получения полимеров, сохраняющих эксплуатационные характеристики в
период потребления, а затем разлагающихся под воздействием природных факторов
на углекислый газ, воду, гуминовые вещества и биомассу. Перспективными
полимерами данного типа являются полигидроксиалканоаты (ПГА). Это группа
полиэфиров, синтезируемых многими бактериями в качестве источника
внутриклеточного углерода и запасаемого источника энергии [1,7].
Биологическая деградация ПГА осуществляется под воздействием
ферментов-деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, которые используют
растворимые продукты расщепления полимеров в качестве субстрата для роста.
Выявлено, что факторами, наиболее воздействующими на биоразрушаемость данных
полимеров, являются концентрация микроорганизмов-деструкторов, их видовой
состав, физико-химические факторы среды, а также состав и свойства полимеров
[3,4,24].
Среди эффективных деструкторов ПГА - разнообразные бактерии,
относящиеся к широко распространенным почвенным и водным представителям (Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas,
Streptomyces, Ilyobacter) [2,3].
Создание экологически чистых материалов с полезными
свойствами остается одной из ключевых проблем современности. С ростом
перспектив применения ПГА все большую актуальность приобретает исследование
закономерностей разрушаемости ПГА в естественных природных условиях. Тем более
что результаты по биоразрушаемости ПГА в лабораторных условиях с использованием
чистых микробных культур, выделенных из природных источников, а также под
воздействием деполимеризующих ферментов, не позволяют предвидеть картину
разрушения данного биопластика в природной среде, в многокомпонентных и
разнообразных естественных экосистемах [10,21].
В связи с этим цель настоящей работы - идентификация
бактерий-деструкторов полигидроксиалканоатов, выделенных из пресной воды
тропических искусственных водоемов и бактериальной микрофлоры почвы дендрария,
участвующей в деструкции ПГА.
Были поставлены следующие задачи:
. Определить общее микробное число и численность
бактерий-деструкторов в почве.
2. Выявить биодеструктивные способности изолятов
бактерий, доминирующих в пресноводных и почвенных микробиоценозах.
. Изучить культуральные, морфологические,
физиолого-биохимические свойства бактерий-биодеструкторов для их идентификации.
Работа выполнялась на базовой кафедре биотехнологии ИФБиБТ.
Глава 1.
Обзор литературы
.1
Характеристика полигидроксиалканоатов
Полигидроксиалканоаты (ПГА) являются запасными веществами в
клетках бактерий. Они аккумулируются внутриклеточно в форме включений (гранул)
и их масса может составлять до 90% от сухого веса клетки [4,5].
Мономерное строение полигидроксиалканоатов зависит от видовой
специфики, условий роста и, особенно источника углерода в среде. Классифицируют
ПГА по числу атомов углерода в мономере. Они могут быть короткоцепочечными
(ПГАсцл, содержат 3-5 атомов углерода), среднецепочечными (ПГАмцл, 6-15
углеродных атомов) и длинноцепочечными (ПГАлцл, содержат более 15 атомов
углерода). Многие бактерии могут одновременно синтезировать ПГАсцл и ПГАмцл, то
есть являются гетерогенными [17].
Наиболее изученными из полигидроксиалканоатов являются
полигидроксибутират и его сополимеры с оксивалериановой кислотой [4].
Полигидроксибутират (ПГБ) способны накапливать различные
прокариотные микроорганизмы. Способность синтезировать данный полимер показана
для бактерий родов: Azotobacter, Pseudomonas, Spirillum, Bacillus, Nocardia, Alcaligenes, Chloroflexus и других (всего известно
около 100) [4, 15].
Накапливается полигидроксибутират в клетках в виде гранул,
которые образованы плотно упакованными тяжами, ограниченными фосфолипидными
оболочками с включенными в них белками. По физическим свойствам ПГБ близок к
полипропилену. Однако чистый ПГБ характеризуется очень низким растяжением на
разрыв, а так же более высокой температурой стеклования, чем полипропилен. Как
и все полигидроксиалканоаты он устойчив к воздействию УФ излучения, но
малоустойчив к растворителям, кислотам и щелочам. ПГБ нерастворим в воде и
относительно устойчив к гидролитическому разложению, это отличает
полигидроксибутират, как и прочие ПГА, от других биоразрушаемых пластиков,
используемых в настоящее время. ПГБ подвергается растворению хлороформом и
другими хлорпроизводными углеводородов [4, 5, 36].
Полигидроксибутират (ПГБ) - гомополимер D (-) - 3-β-оксимасляной кислоты. Он представляет собой изотактический
полиэфир с регулярными, повторяющими единицами (C4H6O2). Его формула выглядит
следующим образом:
Величина n определяется условиями
синтеза полимера микробными клетками, а также методами его экстракции,
молекулярный вес колеблется от 60000 до 250000 [7].
У полигидроксибутирата, аналогично многим полимерным
материалам, температура, при которой происходит его деформация, ниже
температуры кипения (температурной деградации), поэтому газовое состояние в
полимерах не реализуется и основным видом фазового равновесия в них является
конденсированное состояние - кристаллическое, стеклообразное, вязко-текучее и
жидкое [4].
Субстратом для синтеза ПГБ могут служить сахара, спирты,
ацетат, водород, органические кислоты. В настоящее время, с развитием
технологий и увеличением объема наших знаний, появилась возможность получать
полигидроксибутират и его сополимеры, используя широкий спектр исходных
веществ, в том числе из промышленных отходов [4, 7].
В зависимости от соотношения мономеров в полимере и их
природы свойства полимерных материалов изменяются, в т. ч. механическая
прочность, температура плавления, биоградируемость [4, 46,55].
Производство других полигидроксиалканоатов
зависит от субстрата, на котором выращивали микроорганизмы и от специфичности
синтетаз.
Биосинтез полимеров определяется тремя ключевыми ферментами: β-кетотиолаза, ацетоацетил-CoA-редуктаза и ПГА-синтаза кодируемые 25 генами,
которые можно клонировать и, благодаря чему создавать новые виды или
увеличивать количество необходимых [37,45].
Несмотря на то, что ПГА являются гидрофобными, частично
кристаллизованными полимерами, они могут подвергаться деградации различными
микроорганизмами, которые выделяют ПГА деполимеразы, разрушающие полимеры
[22,26,51].
.2 Области
применения полигидроксиалканоатов
ПГА, как уже было отмечено ранее, по ряду физико-химических
свойств сходны с широко применяемыми и выпускаемыми в огромных количествах и
неразрушаемыми в природной среде синтетическими полимерами типа полипропилена.
Линейная структура молекул ПГА придает им свойство термопластичности и
изменения прочности. При нагревании молекулярные цепи в ПГА легко сдвигаются
относительно друг друга, в результате этого материал размягчается и приобретает
текучесть. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность,
так как позволяет с использованием различных методов получать из этих полимеров
разнообразные изделия. Масштабы применения ПГА в настоящее время сдерживаются
достаточно высокой стоимостью, тем не менее сферы их применения постоянно
расширяются. [18, 42]
Полигидроксибутират и его сополимеры с валератом используют
для получения термоплавких адгезивных материалов, а длинноцепочечные ПГА
используют в качестве адгезивов, устойчивых при прессовании. ПГА можно
использовать также для замены нефтехимических полимеров в качестве тонеров и
проявителей, а также ион-проводящих полимеров. [31, 50, 25, 48, 49]
Из ПГА возможно получение гибких пленок различной толщины, в
том числе полупроницаемых мембран, нитей, нетканых материалов, различных полых
форм (бутылки, контейнеры, коробки и пр.), а также гелей и клеев. Совокупность
свойств, характерных для ПГА, делает их перспективными для применения в
различных сферах - медицине, фармакологии, пищевой и косметической
промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, радиоэлектронике и других
сферах. ПГА активно исследуются с целью переработки в США, Скандинавии и
Германии и Голландии. Большой интерес к биодеградируемым ПГА в настоящее время
сформировался в США. [18, 42]
Безусловные перспективы и широкий рынок изделий из ПГА
наметился в косметологии - это получаемые экструзией различной формы флаконы,
банки, бутылки, контейнеры и коробки. Первой бутылкой из ПГА для шампуня стала
использовать компания "Wella AG" в Германии. [57]
Отдельные типы ПГА образуют прочные гелии и латексы, поэтому
на их основе возможно изготовление клеев, наполнителей, в том числе для
стабилизации красителей. Ламинаты ПГА с бумагой и другими полимерами хорошо
зарекомендовала себя для изготовления мешков и пакето для хранения разрушаемого
мусора, а также одноразовой посуды. Помимо упаковочной тары, контейнеров для
пищи и одноразовой посуды, ПГА используют также в качестве пищевых добавок,
например, заменителя сливок, средств доставки ароматизаторов и отдушек. [58,59]
Данный материал исследуется и внедряется в различные сферы,
включая необычные, например использование в условиях морской воды. Это
направление возникло после того, как стало известно, что ПГА достаточно прочны,
но при этом хорошо разрушаются не только в почве, но и в морской воде.
Моножильные крученые нити из сополимерных ПГА используются для изготовления
рыболовных сетей, крабовых ловушек, канатов, а также в практике морской аквакультуры.
[28, 52]
Рынок существует и по отношению к продуктам деполимеризации и
гидролиза ПГА. Из этих полимеров возможно получение спектра оптически чистых
многофункциональных гидроксикислот. [34]
Новое открывающееся направление перспективности ПГА - это получение
биотоплива. Недавно показано, что метиловые эфиры 3-гидроксибутирата и
среднецепочечных ПГА, полученные этерификацией П3ГБ и среднецепочечных ПГА,
могут быть использованы как биотопливо. Температура сгорания этих соединений
порядка 20-30 кДж/г, что сопоставимо с температурой сгорания этанола (27кДж/г).
По предварительным оценкам, стоимость биотоплива на основе ПГА может составить
порядка 1200 дол. США за тонну. [43]
Сегодня существует рынок изделий из ПГА сельскохозяйственного
назначения - это пленочная продукция для упаковки продуктов, удобрений, для
тепличных хозяйств; горшечная продукция; сетки, канаты и др. В этой связи новым
и экологически значимым направлением применения ПГА может стать его
использование для депонирования и доставки сельскохозяйственных препаратов.
Бурное развитие химии и переход сельского хозяйства на интенсивные технологии
привели к появлению и применению огромного разнообразия химических веществ для
борьбы с вредителями, сорняками и возбудителями болезней культивируемых видов.
Используемые в виде порошков, суспензий и эмульсий, пестициды зачастую не
обеспечивают адресную доставку препаратов, что ведет к их рассеиванию и
последующей аккумуляции в биосфере. Это вызывает необходимость поиска более
эффективных средств и методов защиты полезной биоты, не оказывающих
отрицательного воздействия на человека и окружающую среду в целом. [43, 11, 20]
Новым направлением исследований, ориентированных на снижение
риска неконтролируемых распространения и аккумуляции ксенобиотиков в биосфере,
является разработка экологически безопасных препаратов нового поколения с
адресным и контролируемым выходом активного начала за счет использования
специальных покрытий или матриксов из биоразрушаемых материалов. Описаны не
многочисленные примеры использования полимерных носителей: этилцеллюлозы,
полиуретана, альгината натрия, полимеров с памятью формы для депонирования
отдельных ядохимикатов. [33, 11, 44, 53]
.3
Биодеградация полигидроксиалканоатов
Способность ПГА к разложению в биологических средах до безвредных
продуктов является одним из главных преимуществ, отличающий этот класс
соединений от небиоразрушаемых пластиков. ПГА подвергаются биодеструкции как в
экосистемах (в почве, водной среде), так и внутри организма. Скорость процесса
может сильно варьировать, однако можно выделить несколько основных факторов,
влияющих на биологическую деструкцию ПГА и их сополимеров:
· стереоконфигурация полимера (только
эфирные соединения мономеров R-конфигурации гидролизуются микробными деполимеразами);
· степень кристалличности полимера (скорость
деградации более кристалличных образцов ниже);
· молекулярная масса полимера (чем ниже
молекулярная масса ПГА, тем быстрее происходит разложение);
· состав полимеров [24,27].
Наиболее изучаемым аспектом биодеградации ПГА является
способность микроорганизмов использовать данные полимеры в качестве субстратов
для роста [27]. ПГА могут разрушаться как внутриклеточно внутриклеточными
деполимеразами в период аккумулятивной фазы при отсутствии стабильного
источника углерода, так и внеклеточно под влиянием внеклеточных деполимераз.
Бактерии, секретирующие полимер после его выделения в среду гибнут.
Внутриклеточные ПГА деполимеразы не гидролизуют внеклеточные
полигидроксиалканоаты, а внеклеточные деполимеразы не могут разрушать
внутриклеточные гранулы, что определяется различиями в физической структуре
внутриклеточных "нативных" и внеклеточных
"денатурированных" гранул ПГА. Последние являются высоко
кристаллизованными полимерами. ПГА нативных гранул полностью аморфны и имеют
поверхностный слой, состоящий из протеинов и фосфолипидов. Поверхностный слой
постепенно разрушается при выделении гранул или под действием других физических
и химических факторов. Структуру и состав слоя изучают биохимически, с помощью
молекулярной биологии и электронной микроскопии. Когда поверхностный слой
гранул разрушен в течение процесса выделения, полимер агрегируется.
Кристаллизованные ПГА не связываются с внутриклеточными ПГА-мобилизованными
системами [4, 15,14,51].
В литературе изучена динамика разрушения сополимеров
гидроксибутирата и гидроксивалерата, с различной величиной включения последнего
и установлено, что сополимерные образцы разрушаются быстрее [35].
Полигидроксиалканоаты могут разрушаться под воздействием
высоких температур (свыше 300оС), в результате кислотного и
щелочного гидролиза, а также биологическим путем.
При термальном разложении происходит случайное разделение
полимера. Под влиянием кислот или щелочей полигидроксиалканоаты разлагаются,
как обычные эфиры. В разбавленных растворах процесс химического гидролиза
полигидроксиалканоатов протекает крайне медленно, но увеличивается при высоких
температурах. Биологическая деградация ПГА происходит гидролитически под
воздействием специфических ферментов - деполимераз, продуцируемых
микроорганизмами, а также ферментами крови и тканей высших животных [19].
В естественных условиях ПГА разрушаются до конечных продуктов
- диоксида углерода и воды в аэробных условиях, метана в анаэробных, причем
процесс происходит довольно быстро. ПГА главным образом разрушаются за счет
деятельности микроорганизмов [27,21].
Разрушение полиоксибутирата и сополимера ПГБ/ПГВ (с 10 мол. %
гидроксивалерата) изучено при различной температуре (от 15 до 40 оС)
в почве. Скорость деградации полимера варьировала от 0,03% до 0,64 % в сутки в
зависимости от типа почвы, химического состава полимера и температуры. В
основном, с увеличением температуры скорость деструкции возрастала. При
исследовании биодеградации ПГБ в почвенном компосте при температуре 24 и 46оС
наилучшие показатели деградации зафиксированы при 46°С [23].
Области применения ПГА в связи с его уникальными свойствами
различны. ПГА с успехом может быть применен в качестве матрицы для получения
лекарственных форм пролонгированного действия. На основе ПГА существует
возможность создания макромолекулярных терапевтических систем - матриц и
резервуарных мембран и микросфер для контролируемой доставки лекарственных
веществ в организм широкого спектра применения (диабетические средства,
антагонисты наркотиков, антиалкогольные средства и противоопухолевые препараты)
[3,4].
В число применений ПГА входят биоразлагаемые упаковочные
материалы и формованные товары, нетканые материалы, одноразовые салфетки и
предметы личной гигиены, пленки и волокна, связывающие вещества и покрытия,
связующие материалы для металлических и керамических порошков,
водоотталкивающие покрытия для бумаги и картона [7,8].
.4 Выявление
микроорганизмов-деструкторов
Важным вопросом, решение которого необходимо для понимания
закономерностей и механизма биоразрушения ПГА, является выявление и
идентификация микроорганизмов-деструкторов этих полимеров. Среди деструкторов
ПГА описаны представители бактерий разных родов: Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Rhodococcus, Rhodocyclus, Syntrophomonas, Ilyobacter, Terrabacter, Terracoccus, Brevibacillus, Agrobacterium, Duganella, Ralstonia, Gracilibacillus, Enterobacter, Matsuebacter, Rhodoferax, Variovorax и Acinetobacter, Azospirillum, Mycobacterium и Streptomyces и др. [29,54,40,13,6].
При описании и идентификации бактерий изучают их
культуральные свойства - характерные особенности бактерий на плотных и жидких
питательных средах. Морфологическая характеристика и организация клеток
бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность,
наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию. Полезным
может оказаться также выявление в клетках характерных мембранных систем,
присущих отдельным группам бактерий, а так же включений. Первостепенное
значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению
их клеточных стенок. Изучение физиолого-биохимических свойств включает
установление способа питания и типа энергетического метаболизма исследуемых
культур. Важно определить такие признаки, как отношение бактерий к
молекулярному кислороду, температуре, pH среды, солености, освещенности и другим факторам
среды. В данную группу признаков входит также перечень субстратов,
утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в
витаминах и других факторах роста, образование характерных продуктов
метаболизма, наличие некоторых ферментов [12, 9].
Наиболее активными деструкторами ПГА признаны грибы, включая Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes, Zygomycetes, Mixomycetes, Penicillium, Fusarium [38,16,32]. Более
высокий деградационный потенциал грибов связывают с большей подвижностью
грибных ПГА-деполимераз по сравнению с ПГА-деполимерами, экскретируемыми
бактериями [47].
Авторы более ранних работ показали, что в изучаемых условиях
в почве преобладают деструкторы короткоцепочечных ПГА, тогда как численность
микроорганизмов, расщепляющих среднецепочечные ПГА невелика, от 0,8 до 18 % от
обнаруженных деструкторов [41,54].
Следует отметить, что при выявлении деструкторов ПГА
анализируют среды (почва, компост, вода), в которых экспонировали образцы
полимеров, и микроорганизмы, выделенные из пленок обрастания на поверхности
полимеров, высевая их на стандартные микробиологические среды. При этом среди
анализируемых микроорганизмов могут присутствовать организмы-комменсалы,
утилизирующие мономеры и другие продукты разрушения высокомолекулярных ПГА,
которые появляются в среде благодаря жизнедеятельности первичных и истинных
ПГА-деструкторов. Для выделения истинных деструкторов ПГА необходимо
использовать метод прозрачных зон, который предусматривает высев проб на
минеральный агар, содержащий в качестве единственного источника углерода ПГА.
Рост на такой среде микроорганизмов, обладающих ПГА-деполимеразной активностью,
сопровождается образованием вокруг колоний на поверхности агаризованной среды
характерных прозрачных зон как результат разрушения полимера [39].
Среди морских микроорганизмов-деструкторов ПГА
идентифицированы бактерии Pseudoalteromonas sp. NRRL B-30083,
Marinobacter sp, NK-1, Alcaligenes faecalis AE122, актиномицеты Nocardiopsis
aegyptia, Streptomyces sp. SNG9; доказана их способность секретировать экзодеполимеразы и
утилизировать гомогенный П3ГБ и сополимеры П3ГБ/3ГВ. [30, 32, 54, 56]
Глава 2.
Объекты и методы исследования
2.1 Объекты
исследования микробной деградации в пресной воде
Объектом исследования в настоящей работе были пресноводные
тропические бактерии, обладающие способностью к биодеградации ПГА.
Материалом для исследования служили образцы полигидроксиалканоатов
(ПГА) двух типов - гомополимера 3гидроксимасляной кислоты (П3ГБ) и сополимера
3-гидроксимасляной и 3гидроксивалериановой кислот (П3ГБ/3ГВ), имеющие близкие
физико-химические свойства. Образцы помещали в чехлы из мелкоячеистого
мельничного газа и погружали на глубину 0,3-0,5 м в искусственный водоем на
климатической испытательной станции (г. Нячанг, Вьетнам) (Рисунок 1).
Рисунок 1 -