Система интерферона
Введение
Полвека назад были открыт интерферон
(ИФН) - первое противовирусное вещество, первый и наиболее детально изученный
цитокин, первый биологически активный препарат, обладающий универсально широким
диапазоном эффектов.
Изучение ИФН претерпело стремительную
эволюцию от простого экспериментального наблюдения до научного объяснения и
последующего познания нового феномена, завершившегося созданием весьма
представительного поколения медицинских препаратов, которые широко применяются
сейчас при инфекционных заболеваниях, в онкологии, неврологии, офтальмологии,
дерматологии и т.д.
За прошедшие 50 лет накоплена
обширная информация о физико-химических и биологических свойствах ИФН, изучена
локализация интерфероновых и регуляторных генов в клетках, определены нуклеотидная
и белковая последовательности всех основных типов и субтипов ИФН и в основном
установлены роль и место ИФН в норме и при различных видах патологии. Именно
ИФН оказались первыми функционально активными белками эукариотов, созданных в
середине 80-х годов с помощью генной инженерии. Это решило проблему
производства интерферонов в необходимых для здравоохранения количествах и стало
поворотным событием в биологии и медицине, ознаменовавшим первый этап создания
нового поколения биопрепаратов.
Многообразие физиологических функций
ИФН указывает на их контрольно-регулирующую роль в сохранении гомеостаза.
Система ИФН относится к числу быстрореагирующих и является одной из важнейших
составляющих естественного (врожденного) иммунитета.
1. Интерфероны
.1 Общие сведения об
интерферонах
Интерфероны (ИФН) представляют собой
наиболее изученную группу цитокинов (медиаторов иммунитета). Они закодированы в
геноме клеток позвоночных и представлены семейством белков, обладающих
противовирусной, иммуномодулирующей, антипролиферативной и другими видами
биологической активности.
Интерфероны относятся к
полифункциональным биорегуляторам и гомеостатическим агентам. Система ИФН
относится к числу быстрореагирующих и их образование и действие можно
рассматривать как важнейший механизм врожденного (естественного) иммунитета,
играющий одну из ключевых ролей в провоспалительном и противовоспалительном
каскаде цитокинов. Многообразие физиологических функций ИФН указывает на их
контрольно-регулирующую роль в сохранении гомеостаза.
Функционирование системы ИФН
складывается из строго следующих друг за другом этапов, представляющих
своеобразную цепную реакцию организма в ответ на внедрение чужеродной
информации. В настоящее время полностью расшифрована сигнальная система клеток,
обеспечивающая передачу сигнала с рецепторов ИФН в клеточное ядро и геном с
активацией семейства генов, необходимым для формирования клеточной защиты от
вирусных и бактериальных инфекций.
1.2 Функционирование
системы интерферонов
Схематично можно выделить четыре
основных звена данной цепочки:
· Индукция
или «включение» системы, приводящей к дерепрессии генов ИФН, транскрипции их
информационных РНК с их последующей трансляцией. Индукция достаточно быстрый
этап взаимодействия внешних сигналов с клеткой. Сигнальная система передачи
организована таким образом, что уже через 30-40 мин. регистрируются признаки
ответа клеточного генома.
· Продукция
- синтез клетками ИФН альфа-, бета-, гамма- и других типов и секреция их в окружающую
среду. Продукция ИФН наблюдается сразу после завершения стадии индукции. Уже
через 2-3 часа в периферической крови наблюдается накопление функционально
активных молекул ИФН. Через 6-8 час. концентрация ИФН в периферической крови
достигает максимума.
· Действие
- защита окружающих клеток от чужеродной информации (вирусы, бактерии и т.д.)
вновь образованными ИФН. При большинстве инфекций ключевую роль играет
генерализованный ответ организма на инфекционный агент. Важная функция в
генерализованном ответе принадлежит дендритным клеткам. В том случае, когда
дендритные клетки эффективно отвечают на соответствующий стимул, концентрация
ИФН в периферической крови достигает того уровня, при котором обеспечивается
высокий уровень защиты от вирусной инфекции.
· Эффекты
- антивирусный, иммуномодулирующий, антитуморогенный, радиопротективный сильно
дифференцированы и имеют особенности проявления. В частности, при инфекционных
процессах важен быстрый ответ и противостояние механизмам подавления регуляции
синтеза ИФН вирус-специфическими белками. В механизмах противоопухолевой
активности ИФН принципиальное значение имеет специфическая активация
цитотоксических Т-лимфоцитов. Главенствующую роль в этот играет ИНФ-γ и распознавание этими
клетками опухоле-специфических антигенов.
Наряду с противовирусной активностью
интерфероны проявляют антипролиферативный и иммуномодулирующий эффекты,
оказывая воздействие на рост и дифференцировку клеток организма.
Всего же к настоящему времени
описано более 100 разнообразных эффектов ИФН, которые и определяют медицинскую
значимость препаратов ИФН. Основные биологические эффекты интерферонов указаны
ниже:
· Подавление
размножения внутриклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы
(хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие)
· Антипролиферативная
активность
· Антитуморогенный
эффект
· Антимутагенный
эффект
· Антитоксическое
действие
· Радиопротективный
эффект
· Регуляция
продукции антител
· Стимуляция
макрофагов, усиление фагоцитоза
· Усиление
цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов, направленного на
клетки-мишени
· Активация
естественных киллерных клеток
· Стимуляция
высвобождения гистамина базофилами
· Индукция
синтеза простагландинов
1.3 Классификация
интерферонов
Интерферон - семейство
белков-гликопротеидов с молекулярной массой от 15 до 70 кДа, которые
синтезируются клетками иммунной системы и соединительной ткани.
По источникам выделяют 4
типа интерферонов: ИФНα (альфа) синтезируется лейкоцитами периферической крови
(лейкоцитарный интерферон); ИФНβ (бета) -
фибробластами (фибробластный), ИФНγ (гамма)
- стимулированными T-клетками, естественными киллерами и (возможно) макрофагами
(иммунный). Об ИФН
(омега) информация ограниченна.
ИФН синтезируется в организме
постоянно и его концентрация в крови держится на уровне 2 МЕ/мл (МЕ -
международная единица = количеству ИФН, защищающему культуру клеток от 1 ЦПД50
вируса). Выработка ИФН возрастает при инфицировании вирусами, а также при
воздействии индукторов ИФН, напр., РНК, ДНК, сложных полимеров.
По способу образования различают ИФН
I типа (образуется в ответ на обработку клеток вирусами, молекулами
двухцепочных РНК, полинуклеотидами и рядом низкомолекулярных природных и
синтетических соединений) и ИФН II типа (продуцируется лимфоцитами и
макрофагами, активированными различными индукторами, действует как цитокин).
ИФН - видоспецифичны. Каждый
биологический вид, способный к их образованию продуцирует свои уникальные
продукты, похожие по структуре и свойствам, но не способные проявлять
перекрестный антивирусный эффект (т.е. действовать в условиях организма другого
вида).
2. Система интерферонов
Система ИФН
состоит из генов ИФН и рецепторов, а также эффекторных молекул трех видов,
относящихся к двум типам: I - ИФН- и ИФН-
и II - ИФН-.
Гены ИФН типов I и II расположены на разных хромосомах и имеют разные
рецепторы. Радикально различаются они и механизмами индукции и продукции.
Основные эффекты действия ИФН:
противовирусный, противоопухолевый (антипролиферативный) и иммуномодулирующий
(стимуляция фагоцитоза, естественных киллеров, регуляция АТ-образования
В-клетками, активация экспрессии ГКГС), радиопротективный.
ИФН I. Основной биологический эффект - подавление синтеза вирусных
белков. Эти ИФН способны воздействовать на различные этапы репродукции вирусных
частиц, включая отпочкование дочерних популяций. «Антивирусное состояние»
клетки развивается в течение нескольких часов после введения ИФН или индукции
его синтеза. Однако ИФН не влияют на ранние этапы репликативного цикла
(адсорбцию, пенетрацию и «раздевание» вирусов).
ИФН не проникают в клетки, а
взаимодействуют со специфическими мембранными рецепторами (ганглиозидами или аналогичными
структурами, содержащими олигосахара). По связыванию ИФН с рецептором и
реализации его эффектов механизм активности напоминает действие гликопептидных
гормонов. ИФН активирует гены, некоторые из которых кодируют образование
продуктов с прямым антивирусным действием - протеинкиназы и
2'5'-олигоаденилатсинтетазы. Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны
индуцируют синтез двух ферментов - 2/, 5/-олигоаденилатсинтетазы и
протеинкиназы, вероятно, за счет инициации транскрипции соответствующих генов.
Оба образующихся фермента проявляют свою активность в присутствии
двухцепочечных РНК, а именно такие РНК. являются продуктами репликации многих
вирусов или содержатся в их вирионах. Первый фермент синтезирует 2',
5'-олигоаденилаты (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеазу I; второй
фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции IF2. Конечным результатом
этих процессов является ингибирование биосинтеза белка и размножения вируса в
инфицированной клетке, а затем ее лизис. Доказано, что существуют и
альтернативные механизмы действия интерферонов (инактивация тРНК, вмешательство
в процессы метилирования и т. п.).
Опыт почти 40-летнего использования
ИФН доказал их несомненную терапевтическую эффективность, что позволяет теперь
объективно оценить основные достоинства и недостатки этих препаратов. При этом
следует исходить из трех основных составляющих действия ИФН, которые лежат в
основе их медицинского применения:
· 1 -
интерфероны (особенно 1 типа) играют ведущую роль в сохранении гомеостаза,
защищая организм от вирусов и других внутриклеточных паразитов, т.к. обладают
уникальной способностью подавлять экспрессию чужеродной информации;
· 2 - не
менее важна способность ИФН регулировать деление клеток, которая лежит в основе
их антипролиферативных, в первую очередь, антитуморогенных эффектов;
· )
позволяет рассматривать их в качестве важного компонента иммунотерапии.g3 - выраженная иммуномодулирующая активность ИФН (в первую очередь
ИФН-
Наиболее широко ИФН используются при
вирусных инфекциях. В первую очередь это различные герпетические поражения
(кератиты и кератоконъюнктивиты, герпес гениталий, опоясывающий лишай), острые
и хронические вирусные гепатиты, грипп и другие ОРВИ.
Менее изучена, хотя и установлена,
эффективность ИФН при ВИЧ-инфекции, папилломавирусных инфекциях (остроконечные
кондиломы, ювенильный папилломатоз гортани, бородавки и др.), кори,
эпидемическом паротите и бешенстве. К этому перечню следует добавить вирусные
осложнения при пересадке органов с применением иммунодепрессантов,
гнойно-септические заболевания новорожденных, постнатально приобретенные
хронические цитомегаловирусные инфекции, псориаз, рассеянный склероз и,
наконец, различные бактериальные заболевания (хламидиозы, легионеллезы,
риккетсиозы).
К настоящему времени накоплена
обширная информация о применении ИФН при различных онкологических заболеваниях.
Достоверно установлена высокая эффективность (70% и более) при В-клеточных и Т
- клеточных злокачественных новообразованиях крови (лейкемии, лимфомы, миеломы,
тромбоцитопении и др.). Достаточно высокий эффект интерферонотерапии (30-70%)
наблюдался при солидных опухолях (карциномы, глиомы, меланомы).
Интерфероны альфа, бета и гамма за
последнее десятилетие стали препаратами, широко применяемыми в медицинской
практике. В настоящее время десятки фармацевтических фирм различных стран
производят около сотни лекарственных форм интерферонов трех основных типов:
альфа, бета и гамма. Вместе с тем, практические врачи не всегда достаточно
осведомлены о том, что представляют собой данные соединения, каково их
происхождение, в чем их отличия от природных веществ и какова совместимость
этих лекарственных препаратов с другими фармакологическими средствами
по степени изученности и масштабам
применения занимают лидирующее положение среди всех используемых в клинической
практике цитокинов. Эти препараты обладают выраженным антивирусным действием,
блокируя синтез вирусных белков и подавляя другие этапы репродукции вирусов.
Кроме того ИФН-α активно воздействует на иммуноциты (ЕК-клетки, Т-лимфоциты,
моноциты, макрофаги и гранулоциты), а также усиливает экспрессию мембранных
антигенов комплекса гистосовместимости (HLA).a 2а, 2b, 2c) близки по составу и могут рассматриваться как единая
группа. Различия касаются в основном лекарственных форм (препараты для местного
или парентерального применения, свечи, мази, линименты и др.), а также
показаний, доз и схем использования. ИФН-aАльфафероны (ИФН-
) применяются не столь широко. Они
хорошо зарекомендовали себя в терапии рассеянного склероза и онкологии (лечение
меланом и глиом).bБетафероны
(ИФН-
играет важнейшую роль в реакциях
клеточного иммунитета.g)
созданы относительно недавно и наименее изучены. Эффективность их применения
показана при ревматоидных артритах, вирусных гепатитах и генитальных бородавках.
Будучи мощным провоспалительным цитокином ИФН-gГаммафероны (ИФН-
Особое место среди ИФН занимают
комбинированные препараты, в которых интерферон является основным, но не
единственным компонентом (виферон, кипферон, генферон, гриппферон и др.).
Особенно широко указанные препараты используются при таких хронически
рецидивирующих инфекционных заболеваниях как герпес и заболевания, передающиеся
половым путем (ЗППП).
Вместе с тем практика длительного
(многомесячного) применения высокоактивных доз ИФН, когда препараты ИФН
являются основной составляющей терапии, например, при хронических вирусных
гепатитах В и С, неврологических заболеваниях (рассеянный склероз), в онкологии
(лейкозы, саркомы) выявила ряд серьезных недостатков ИФН-терапии:
· ряд
нежелательных побочных эффектов;
· появление
антиинтерфероновых антител, сводящих на нет дальнейшую интерферонотерапию;
· способность
ряда вирусов «избегать» действия ИФН (подробно эти эффекты разбираются в
монографии Ф.И. Ершова, О.И. Киселева «Интерфероны и их индукторы (от молекул
до лекарств)» - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005 г.
· некорректная
информация, которая бесконтрольно распространяется через интернет, что приводит
к серьезным нарушениям в научно обоснованном медицинском использовании ИФН.
· отсутствие
объективной информации о существующих среди ИФН различиях, что для практикующих
врачей делает все ИФН препаратами произвольного выбора;
· использование
ИФН согласно рекомендациям научно не обоснованной рекламы, которая часто
выходит за рамки утвержденных органами здравоохранения инструкций;
3. Интерфероновая
реакция лейкоцитов как диагностический тест.
.1 Оценка
интерферонового статуса
интерферон химический лечение
При возникновении инфекции в
организме человека развиваются иммунные реакции со сложными клеточными взаимодействиями.
Регуляторами этих взаимодействий являются специальные белки - цитокины. Одним
из ключевых цитокинов является интерферон.
Спектр основных биологических
эффектов ИФН:
• подавление размножения
внутриклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы (хламидии,
риккетсии, бактерии, простейшие);
• антипролиферативная активность;
• антитуморогенный эффект;
• антитоксическое действие;
• радиопротективный эффект;
• подавление или усиление продукции
антител;
• стимуляция макрофагов, усиление
фагоцитоза;
• усиление цитотоксического действия
сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени;
• активация естественных киллерных
клеток.
Существует три типа природного
интерферона: альфа (ИНФ-α), бета (ИНФ-β), гамма (ИНФ-γ). Это интерфероны 1-го поколения. Диагностическую ценность имеет
выявление уровня интерферона в сыворотки крови и определение способности
лейкоцитов периферической крови продуцировать различные типы интерферонов в
ответ на активирующий сигнал (вирусные частицы или иммуномодуляторы). Такое
исследование и получило название «Интерфероновый статус».
Целью определения интерферонового
статуса является:
. Исследовать способность иммунной
системы к развитию адекватных иммунологических реакций в ответ на
этиологический фактор.
. Выявить уровень продукции
интерферона в настоящий момент (в норме или на фоне заболевания).
. Подобрать иммуномодулирующий
препарат, на который развивается максимальный ответ иммунокомпетентных клеток
для применения в терапевтических целях.
Исследование интерферонового статуса
включает определение уровня сывороточного интерферона (ИФН), спонтанной
продукции ИФН, способности лейкоцитов к стимулированной продукции ИФН-α (под воздействием вируса
болезни Ньюкасла), а также способности продуцировать ИФН-γ под воздействием
фитогемагглютинина.
Показатель «Циркулирующий
интерферон», варьирующий в норме от 2 до 8 ед/мл, характеризует суммарное
«фоновое» количество всех типов интерферонов, циркулирующих в крови, смесь
интерферонов различных типов. У здоровых взрослых и детей старшего возраста в
кровотоке определяется незначительная часть интерферона в результате его
разведения и быстрого выведения. Процессы продукции и элиминации интерферона
находятся в равновесии, и уровень сывороточного интерферона в кровотоке не
выходит за пределы нормы. Уровень (циркулирующего) сывороточного интерферона
служит объективным суммарным показателем количества данного белка in situ,
повышенный уровень - показатель остроты процесса.
Анализ информативен, когда
необходимо оценить общее количество интерферона: подозрение на генерализованный
герпес, гепатит, рассеянный склероз (общее снижение), бронхиальная астма,
крапивница (корреляция со степенью тяжести) и др.
Определение уровня продукции α- и γ- интерферонов дает важную
информацию о потенциальной активности системы интерферона. Взрослые доноры
способны к значительной их продукции (до 640 ед/мл для γ-интерферона).
Все интерфероны обладают
противовирусным, иммуномодулирующим, противоопухолевым и антипролиферативным
эффектами.
ИНФ-α:
• обладает выраженным
противовирусным и противоопухолевым действием, в этом есть сходство с ИНФ-β;
• в меньшей степени проявляет
иммуномодулирующие свойства.
Основными клетками продуцентами для
ИНФ-α являются В-лимфоциты,
макрофаги (для ИНФ-β - клетки эпителия, фибробласты).
Титры ИФН-α в пробах цельной крови
- показатель функциональной активности В-лимфоцитов и состояния противовирусной
защиты организма;
Уровень ИНФ-α в норме варьирует от
128 до 640 ед/мл.
ИНФ-γ:
• обладает выраженным
иммуномодулирующим действием;
• вместе с интерлейкином-2 (ИЛ-2) и
фактором некроза опухолей (ФНО α) относится к основным провоспалительным цитокинам;
• является индуктором клеточного
звена иммунитета.
Противовирусные и противоопухолевые
свойства слабее, чем у ИНФ-α и ИНФ-β. Основными клетками-продуцентами являются Т-лимфоциты, натуральные
или естественные киллеры (NK-клетки).
Титры ИФН-γ - показатель
функциональной активности Т-лимфоцитов и способности к активации иммунной
системы (в частности, при вирусных инфекциях).
Уровень ИНФ-γ в норме варьирует от 32
до 256 ед/мл.
Нормализация показателей уровня
интерферонов является критерием эффективности терапии, и, как правило,
коррелирует с положительной динамикой заболевания.
Показатели ИФН-статуса в целом
позволяют судить об иммунореактивности организма:
. У здоровых лиц наблюдается
определенное содержание сывороточного интерферона и значительный «запас»
продукции α- и
γ-интерферонов.
. Стрессы и острые вирусные
инфекции, аллергические состояния характеризуются повышением уровня сывороточного
интерферона и снижением уровня индуцируемой продукции α- и γ-интерферонов.
. Хронические вирусные инфекции
(герпес, гепатит, рассеянный склероз) сопровождаются глубоким подавлением всех
показателей интерферонового статуса.
. Аутоиммунные заболевания
(системная красная волчанка, ревматоидный артрит) характеризуются подавлением
индуцируемой продукции α-интерферона, наличием спонтанно вырабатываемого ИФН.
. Острый лимфолейкоз,
злокачественные образования, проказа сопровождаются подавлением индуцируемой
продукции γ-интерферона.
. При бронхиальной астме, крапивнице
уровень сывороточного интерферона коррелирует с тяжестью заболевания.
3.2 Интерфероновые
диагностические тесты
Система интерферона (ИФН)
обеспечивает противовирусную резистентность организма и влияет на весь комплекс
его специфических и неспецифических защитных реакций.
Отражением функционального состояния
системы ИФН является ИФН статус (1, 4), оценка которого проводится по
нескольким показателям, основные из которых:
. Количество (активность)
циркулирующего в крови ИФН (общий сывороточный ИФН).
. Уровень продукции ИФН -α/β лейкоцитами (или
лимфоцитами) in vitro при его индукции вирусными индукторами (интерфероновая
реакция лейкоцитов - ИРЛ).
. Уровень продукции ИФН -γ при его индукции
митогенами в лейкоцитах (лимфоцитах) in vitro (2).
Исследование ИФН статуса позволяет
определить количественные параметры физиологического интерферонового ответа у
здоровых людей (1, 3, 5) и выявить интерферонодефицитные синдромы при острых,
хронических, рецидивирующих инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, первичных
и вторичных иммунодефицитах (9, 11). Определение ИФН статуса достаточно
информативно и может служить надежным клиническим ориентиром при диагностике,
лечении и прогнозе исхода заболевания, как вирусной, так и невирусной
этиологии.
Известен способ определения
активности ИФН в сыворотке и плазме крови на основе торможения роста
микроорганизмов в культуре. Однако данный метод не обладает достаточной
чувствительностью и воспроизводимостью, не дает возможности выражения
результатов в общепринятых международных единицах (ME), а также, выбора
иммуномодулирующей терапии и прогноза исхода заболевания (МКИ 5 A 61 K 37/66,
AC N 1082422, 1984 г.). Известен способ определения интерферонового статуса и
прогноза исхода заболевания, включающий следующие стадии: кровь доноров или
больных в объеме 1-1,5 мл берут из вены, добавляют гепарин, далее в 2
центрифужные пробирки вносят по 800 мкл Среды RPMI-1640, 100 мкл цельной крови,
100 мкл вируса болезни Ньюкасла (NDV) и фитогемагглютинин (ФГА) для индукции
ИФН -α/β и ИФН -γ соответственно.
Конечное разведение цельной крови в объеме 1 мл - 1/10. Оставшееся количество
крови использовали для получения проб сывороточного ИФН. Индукцию ИФН -α/β и ИФН -γ проводили в течение 24
часов при 37oC в атмосфере 5% CO2. После инкубации пробы
центрифугировали, надосадочную жидкость отсасывали. В пробах с индукцией
синтеза ИФН -α/β лейкоцитами in vitro
проводили инактивацию NDV инкубацией при pH до 2.0 в течение 2-3 суток при 4oC
с последующим восстановлением до рН 7.4. Пробы хранили при 4oC до
титрования. При постановке титрования микрометодом использовали 96-луночные
микропланшеты. Для титрования использовали клетки линии М-19 (фибробласты
человека). Каждую реакцию ставили в объеме 200 мкл с двумя повторами, общий
расход цельной крови при этом составлял 200 мкл. В качестве тест-вируса
использовали вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. За единицу
активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, задерживающую
деструкцию монослоя на 50%. У здоровых доноров уровень общего сывороточного ИФН
соответствовал 2-8 ед/мл, индукция ИФН -α/β
в культуре лейкоцитов равняется 1280 ед, ИФН-γ - 256 ед, при острой вирусной инфекции сывороточный ИФН равнялся
128 ед/мл, продукция ИФН -α/β
- 10 ед, ИФН-γ
- 64 ед. При хронической вирусной инфекции эти показатели составляли:
сывороточный ИФН 32-64 ед/мл, продукция ИФН -α/β
- 80 ед, ИФН -γ
<2 ед. (Григорян С.С. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной
крови. Вопросы вирусологии, 1988, т. 3, N 4, с. 433-436).
Сущность изобретения состоит в том,
что для анализа ИФН статуса в стерильные пробирки отбирают венозную кровь
объемом от 0.5 до 5 мл. В часть пробирок предварительно вносится необходимое
количество стерильного гепарина в виде концентрированного (для исключения
разбавления исходного образца) раствора на среде RPMI - 1640 или на
физиологическом растворе, так, чтобы конечная концентрация гепарина составила
10-15 ед/мл. Отобранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при 4oC
без потери всех необходимых свойств.
Цельную негепаринизированную кровь
центрифугируют 10-15 мин при 1000 g, после чего в стерильный эппендорф отбирают
50-200 мкл сыворотки для анализа содержания общего сывороточного ИФН. Для
типирования ИФН в сыворотке крови (ИФН -α, ИФН -β, ИФН -γ) образцы инкубируются с моноклональными антителами (MAT) к
различным типам ИФН в течение 1 часа при 37oC. Содержание ИФН
каждого типа определяют, исходя из активности общего сывороточного ИФН и
величины падения активности ИФН в каждом образце после инкубации с МАТ. Образцы
хранят при -25oC.
Для определения
содержания кислотолабильного ИФН -α
в сыворотке крови в исследуемые образцы добавляют раствор 0.1 н. HCl до pH 2.0,
образцы инкубируют в течение 1 часа при 37oC, после чего pH доводят
до 7.4 добавлением 0.1 н. NaOH. Параллельно с этим, другую аликвоту
исследуемого образца инкубируют с МАТ к ИФН -γ
1 час при 37oC для осаждения сывороточного ИФН -γ.
Содержание кислотолабильного ИФН -α
определяют как разность активностей образца, инкубированного с МАТ к ИФН -γ,
и образца, инкубированного при pH 2.0. Образцы хранят до анализа при -25oC.
Для определения уровня
продукции различных типов ИФН лейкоцитами крови in vitro в стерильные
эппендорфы вносят среду RPMI-1640 с добавлением глутамина, антибиотиков
(пенициллин, стрептомицин до 100 ед/мл), 2% сыворотки КРС, растворы индукторов
ИФН (5-7 lg ЭИД50 NDV для ИФН -α/β)
и энтеротоксин St. aureus (СЭА, 10 мг/мл) для ИФН -
и цельную гепаринизированную кровь в соотношении 8/1/1 (например, 100 мкл
PRMI-1640, 12.5 мкл раствора индуктора ИФН и 12.5 мкл цельной крови). Для
определения уровня спонтанной продукции ИФН вместо раствора индуктора вносят
эквивалентный объем питательной среды. Полученную индукционную смесь инкубируют
24 часа при 37oC, затем в эппендорфы, в которых производится
индукция ИФН -α/β, добавляют 0.1 н. раствор HCl до pH 2.0, пробы инкубируют 1 час
при 37oC, после чего в них вносят 0.1 н. раствор NaOH до pH 7.4.
Таким же образом обрабатывают пробы спонтанно продуцированного ИФН, в которых
определяют содержание ИФН -γ по падению
активности ИФН в закисленной / восстановленной пробе (ее активность
соответствует активности спонтанно-продуцируемого ИФН -α/β)
по сравнению с обычной. Обработанные таким образом пробы с индуцированным и
спонтанно продуцированным ИФН хранятся до анализа при -25oC.
Непосредственно перед анализом пробы, подвергшиеся закислению / восстановлению
(индуцированный и спонтанный ИФН ИФН -α/β,
центрифугируют 10-20 мин при 3000-4000 g для осаждения коагулированных
макромолекул.
При определении индуцированной
продукции кислотолабильного ИФН-γ, индукцию его синтеза проводят в тех же условиях и параллельно
индукции общего ИФН -α/β
с той разницей, что вместо закисления / восстановления после инкубации и NDV
образцы инкубируют с поликлональной сывороткой к NDV 1 час при 37oC.
Обработанные таким образом пробы центрифугируют при 4000-7000 g для осаждения
NDV и хранят до анализа при -25oC.
Определение активности ингибиторов /
активаторов действия ИФН в физиологических жидкостях производят совместным
титрованием исследуемого образца на фоне постоянной концентрации референс -
препарата ИФН при прочих условиях, соответствующих обычному титрованию (см.
ниже). Активность ингибиторов / активаторов действия ИФН определяют по
отношению активности стандартного препарата ИФН к активности стандартного
препарата той же концентрации в присутствии исследуемой сыворотки крови и
выражают как коэффициент стимуляции. Образцы физиологических жидкостей
(сыворотка крови, цереброспинальная, синовиальная и пр. жидкости) аликвотируют
и хранят до анализа при -25oC.
Активность ингибиторов /
активаторов синтеза ИФН в физиологических жидкостях определяют следующим
образом: в индукционную систему контрольных проб, аналогичную таковой для
оценки индуцированной продукции ИФН, вносят стандартные индукторы ИФН -α/β
и ИФН -γ
(NDV и СЭА соответственно) и, вместо цельной крови, клетки линии Namalva (до
концентрации 106 кл/мл) в эквивалентном объеме. Опытные пробы, кроме
этого, содержат раститрованные образцы исследуемых физиологических жидкостей.
Индукцию синтеза ИФН проводят при тех же условиях и количественных соотношениях
компонентов, как при определении индукции ИФН -α/β
и ИФН -γлейкоцитами in vitro. По соотношению активностей ИФН в опытных и
контрольных пробах определяют активность ингибиторов / активаторов синтеза ИФН
в исследуемых образцах как коэффициент стимуляции / ингибирования синтеза ИФН
in vitro. После индукции пробы замораживаются и хранятся до анализа при -25oC.
Определение чувствительности
естественных потенциальных продуцентов ИФН (лейкоциты крови) к применяемым в
медицинской практике и экспериментальным лекарственным препаратам проводится
при тех же условиях, как и определение индуцированной продукции ИФН лейкоцитами
in vitro. При этом, вместо стандартных индукторов ИФН (NDV и СЭА) используют
препараты, чувствительность к которым определяют. Оценивают влияние
интересующего препарата на процессы продукции ИФН клетками донора in vitro.
Чувствительность к препарату считают положительной, если активность ИФН в пробе
на чувствительность в 1.5 и более раза выше общей активности
спонтанно-продуцируемого лейкоцитами ИФН. Методически данный тест повторяет тест
на индуцированную продукцию ИФН -α/β
и ИФН -γ лейкоцитами in vitro с
соблюдением всех соответствующих условий. Подготовленные таким образом пробы
хранят до анализа при -25oC.
Анализ активности ИФН в
подготовленных вышеописанными методами пробах проводят с помощью титрования
исследуемых проб в 96 - луночных микропланшетах над монослоем клеток
перевиваемых культур (L-41, Нер-2, A-549, MG-63, L-929), инкубации 24 часа при
37oC в атмосфере 5% CO2, последующей инкубации в тех же
условиях в присутствии 100 ЦПД50 вируса везикулярного стоматита
(ВВС), штамм Индиана. После этого, для стандартизации и автоматизации учета
результатов анализа микропланшеты окрашивают 5-10 мин 0.1% раствором
кристаллического фиолетового на 30% этаноле, отмывают и высушивают на воздухе.
Дальнейший учет результатов проводят либо визуально, либо автоматически с
помощью ридера для иммуноферментного анализа, растворением окрашенного монослоя
клеток 2% раствором додецилсульфата натрия на 5% глицерине (или экстракцией 30%
этанолом 1 час при 37oC) и измерением оптической плотности
полученных растворов при длине волны 570-590 нм.
Активность ИФН в
анализируемом образце определяется с помощью калибровочной кривой зависимости
(% сохранившихся клеток)/(активность стандартного препарата ИФН) для визуального
учета или (оптическая плотность)/(активность стандартного препарата ИФН). Это
дает возможность выражать результаты анализа в стандартных (международных)
единицах (ME), а также значительно повысить точность получаемых результатов до 0.5
ME. Учет проводится по той титровочной точке, в которой сохранилось 30-50%
клеток от исходного числа (при визуальном учете) или по точке, оптическая
плотность которой лежит в интервале 0.2-0.7 ед оптич. плотности (при
автоматическом учете).
Приведенный комплекс показателей
представляет собой полный вариант анализа ИФН статуса. На практике бывает
достаточно использовать три основных показателя: задержание общего ИФН
сыворотки крови (sИФН), продукция ИФН -α/β
и ИФН -γ лейкоцитами крови при
индукции in vitro.
В норме, содержание в крови sИФН
соответствует диапазону 0-10 МЕ/мл, продукция ИФН -α/β 250-520 ME, ИФН -γ110-250 ME. Низкое
содержание ИФН в сыворотке крови сочетается с высокой потенциальной
способностью к продукции различных типов ИФН.
При содержании sИФН 25
МЕ/мл, продукции ИФН -α/β 110, ИФН -γ
55 прогнозируют благоприятный исход при остром течении заболевания, поскольку
система ИФН адекватно реагирует на патологию выбросом достаточного количества
ИФН. Действию естественных механизмов защиты не препятствует этиотропная
терапия (антибиотики, химиопрепараты), с которой целесообразно сочетать
препараты ИФН (виферон и др.) для предотвращения развития ИФН- и иммунодефицитов
и усиления эффективности лечения. Применение индукторов ИФН малоэффективно
(система ИФН не в состоянии ответить на дополнительную стимуляцию синтеза ИФН).
Назначение препаратов ИНФ позволит компенсировать возможный дефицит активности
систем защиты, что приведет к повышению способности к продукции ИФН -α/β
и ИФН -γ, и, в дальнейшем, позволит эффективно применять индукторы ИФН и
иммуномодуляторы микробного происхождения.
При содержании sИФН >35,
продукции ИФН -α/β
60, ИФН -γ<30
прогнозируют тяжелое острое протекание заболевания, требующего срочного
терапевтического вмешательства. От применения иммуномодулирующей терапии лучше
воздержаться до стабилизации состояния пациента.
При содержании sИФН 12-25 МЕ/мл,
продукции ИФН -α/β
85-250 ME, ИФН -γ 45-110 ME прогнозируют подострый характер протекания заболевания
и высокую вероятность хронизации, поскольку реакция системы ИФН недостаточна
для обеспечения защиты организма. Назначают иммуностимулирующие препараты
(индукторы ИФН, препараты микробного происхождения, полимерные препараты:
циклоферон, неовир, пирогенал, ликопид, полирем и др.). Для усиления их эффекта
их комбинируют с препаратами ИФН (виферон) по схемам: 1-й день виферон (2
приема по одной свече 150000 - 1000000 ME), 2-й день индуктор ИФН (циклоферон,
неовир - 1 инъекция, 2 мл 12.5% р - р) и т.д. в течение 20-30 дней; 1-2
10-дневных курса виферона (2 раза в день через 10-12 часов по 1 свече 150000 -
1000000 ME, перерыв между курсами 5-7 дней) и через 5-7 дней 1-2 курса
индукторов ИФН (циклоферон, неовир, по 1 инъекции 2 мл 12.5% р-ра на 1, 2, 4,
6, 8 дни, перерыв между курсами 5-7 дней). Чем выше sИФН и ниже продукция ИФН -α/β и ИФН -γ (острее протекание
заболевания), тем более показаны препараты интерферона (виферон). Наибольшая
эффективность достигается при 1-2 курсах виферона и, затем, сочетании виферона
и индукторов ИФН по вышеприведенной схеме.
При содержании sИФН 0-10 ME,
продукции ИФН -α/β
<40 ME, ИФН-γ <20 ME делают неблагоприятный прогноз исхода заболевания. Для
компенсации ИФН- и иммунодефицита назначают иммунозаместительную терапию:
препараты ИФН (виферон), гамма-глобулина, интерлейкинов (ронколейкин) и других
препаратов, содержащих экзогенные защитные факторы. Использование препаратов
этой группы может предварять назначение антибиотиков и химиопрепаратов или они
могут применяться совместно. При повышении резервов системы (повышение
способности к продукции ИФН -α/β
и ИФН -γ) продолжают этиотропное
лечение в сочетании с иммуномодулирующим (при этом в лечебные схемы уже можно
включать и препараты иммуностимулирующего ряда - индукторы ИФН, полимеры
микробного происхождения и др.). Также возможно и комбинирование различных
видов иммунокорригирующих воздействий. При дальнейшей стабилизации состояния
продолжают этиотропное и патогенетическое лечение.
При содержании sИФН 12-40 МЕ/мл,
продукции ИФН -α/β
60-400 МЕ и значительно повышенной продукции лейкоцитами ИФН-γ (свыше 250 ME)
прогнозируют развитие нейроиммунной патологии (рассеянный склероз и др.),
назначают препараты ИФН -β (бетаферон) в комплексе с традиционными методами лечения.
Заключение
В целом, учитывая все «за» и
«против» интерферонов, можно утверждать, что эта группа белков вступила в пору
зрелости, разумного и взвешенного к ним отношения. Нет сомнения, что
интерфероны еще долго будет служить прекрасной моделью для биологических
исследований и одновременно широко использоваться как высокоэффективные
лекарственные средства при разных формах патологии.
Список использованных
источников
1. Галактионов, В.Г. - Иммунологический словарь: учеб. пособие для
вузов по спец. 012000 «Физиология» и другим биол. спец. рек. УМО РФ / В.Г.
Галактионов. - М.: Академия, 2005.
. Внутриклеточные цитокины: проблемы детекции и клиническое
значение / Л.В. Пичугина, Б.В. Пинегин // Иммунология. - 2008.
. кисленко В.Н. Иммунологические методы диагностики,
новосибирск-2010. 2010
. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. - М.:
Мир, 2000.
. http://immuninfo.ru/immunologiya/citokiny/
6. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования
в норме и патологии // Иммунология. 1997. - № 5. - С. 7-14.