Вирощування женьшеню

Вирощування женьшеню

Вступ

Женьшень, Panax ginseng C.A. Меy («Корінь життя») - багаторічна трав'яниста рослина, рід сімейства Аралієві. Включає 11 видів, що виростають в Азії та Північній Амеріці.

Добре відома лікарська рослина. В основному використовується як адаптоген і в якості загальнотонізуючого лікарського засобу. У Кореї та Китаї корінь женьшеню також використовують у приготуванні їжі. Східна медицина стверджує, що препарати женьшеню продовжують життя і молодість женьшень справжній вперше почали вирощувати, мабуть, ще в 1 ст. до н. е. в північних районах Кореї. У цій країні він протягом майже двох тисячоліть був найважливішою статтею експорту. У 1957 р. загальна площа плантацій женьшеню в КНДР становила близько 200 га; більша частина посадок була зосереджена в провінціях Північний Хванхе і Південний Хванхе, при цьому 135 га - біля м. Кесон (Бєліков, 1959). З 1 га отримували 1,8-3,0 т сирого кореня, а середня вага 6-річних товарних коренів становив 60-75 р. У Китаї культивувати женьшень почали дещо пізніше, ніж в Кореї, в II-IV ст. н. е. (Gong Xichen, 1992). Спочатку викопані в лісі рослини розсаджували в одному місці, знову ж таки в лісі, і тільки потім стали обладнати плантації з штучними навісами.

Сучасний стан виробництва женьшеню. У відсталих країнах виробництво женьшеню ще не набрала промислових маштабів, вирощування женьшеню проходить в природі, на плантаціях.

Плюси: висока якість, нативність

Мінуси: порушення біоценозу женьшеню, висока собівартість, складність у стандартіаціі готового продукту, незначний об'єм виробництва.

У розвинених країнах біотехнологічні аспекти отримання гінзенозидів.

Плюси: технологічне виробництво, задоволення попиту, невисока прогнозована вартість, задане кількість продукту і безпечність.

Мінуси: продукт не природний, необхідність у визначенні біоеквівалентності до діючої субстанції.

Для збереження біоценозу женьшеню і задоволення потреби в гінзенозидів необхідно розробляти високоефективні біотехнологічні підходи культивування як самого женьшеню, так і отримання панаксозидів з культури клітин рослин. Підходи, що розроблюються повинні забезпечити високу якість продукту, значний об'єм виробництва, низьку собівартість і доступність за ціною. Актуальність обумовлена прагненням старіючого населення планети використовувати для профілактики хвороб та зміцнення життєвих сил органів нативних, натуральних рослинних компонентів.

В Україні немає власної сировини женьшеня. Спроби культивувати цілу рослину не мали широкого поширення у виробництві. Україна щорічно закуповує різних продуктів з екстрактом женьшеню на 2, 8 млн долларів. Необхідно знайти можливість для забезпечення населення вітчизняною продукцією та збереження золотовалютного резерву.

1. Нормативна документація

сировина гінзенозид настоянка

При розробці технологічних процесів і розрахунку апаратів і балансів була використана наступна нормативна література.

·   ГОСТ 7.9-95 Реферат и аннотация. Общие требования;

·   ГОСТ 19.101-77 ЕСПД. Види программ и программних документів;

·   СТВУЗ-ХПІ-1.03-2007 ССОНП. Нормоконтроль документів у сфері навчального процесу. Порядок організації та проведення;

·   СТВУЗ-ХПІ-3.01-2007 ССОНП. Текстові документи у сфері навчального процесу. Загальні вимоги до виконання;

·   СТВУЗ-ХПІ-3.03-2006 ССОНП. Конструкторські документи у сфері навчального процесу. Загальні вимоги до виконання;

·   СТВУЗ-ХПІ-3.04-2006 ССОНП. Формати. Основні написи. Вимоги до виконання.

·   СТВУЗ-ХПІ-3.05-2002 ССОНП. Конструкторські документи. Креслення. Вимоги до виконання.

·   СТВУЗ-ХПІ-3.06-2002 ССОНП. Конструкторські документи. Специфікації. Вимоги до виконання.

·   СТВУЗ-ХПІ-3.07-2007 ССОНП. Конструкторські документи у сфері навчального процесу. Схеми. Загальні вимоги до виконання.

·   СТВУЗ-ХПІ-3.08-2007 ССОНП. Технологічні документи у сфері навчального процесу. Вимоги до виконання.

2. Техніко-економічне обґрунтування

Одним з головних чинників побудови сталої та ефективної економіки в сучасних умовах об'єктивно вимагає формування інвестиційної політики в міжнародних відносинах, розвиток ринків продукції різних галузей, з урахуванням особливостей регіонів. Перехід до ринкових відносин і демонополізації української економіки зумовили формування проекту економічного співробітництва в галузі виробництва женьшеню. Поряд з традиційним збором цього найціннішого кореня женьшеню, інтерес до його виробництва через інвестиційні проекти економічного і промислового співробітництва необхідно розглядати не як альтернативу сформованим традиційним формам його видобутку, а як об'єктивно можливе його доповнення, що дозволяє більш повно розкрити і використовувати біоресурсного потенціал у індустрії. З цих позицій створення і функціонування проекту спільного співробітництва в галузі створює передумови для розвитку ефективної економіки України та країн учасниць, розширює горизонт пошуку раціональних форм і методів використання природних і економічних ресурсів регіону. Крім того, розвиток економічного співробітництва на основі раціональної спільної діяльності з ефективного використання біоресурсів, капіталу і технології Республіки Корея, дозволяє професійно займатися кожному учаснику проекту, що найбільшою мірою відповідало б його досвіду, навичкам і традиціям. У Північно-Східній Азії, Республіка Корея - добрий ринок, на якому знайде збут значна кількість продукції. На жаль, розвиток економіки для України стримується склалися економічними умовами в регіоні, що не дозволяє забезпечувати очікуваний результат. Практика останніх десятиліть показала, що обсяги женьшеню продовжує мати тенденцію до зниження. Багато в чому це пов'язано з недосконалою організаційно-виробничою структурою заготовок і непристосованістю до «жорстких» умов ринкових відносин.

У сучасній ситуації рішення даної проблеми стає особливо актуальним, оскільки для України відкриваються широкі можливості розвитку вирощування женьшеню і перспективою включення у світовий ринок женьшеню. У той же час, як показують дослідження, менші дивіденди в результаті здійснення даного проекту припадають Республіці Корея. Так, в результаті аналізу цього проекту фондової біржею цінних паперів Номура (Японія), страховою компанією Самсунг, Елджі, аналітики дійшли висновку, що при розділі прибутку по 1/3 частини, корейська сторона забезпечить собі прибуток лише V частини банківських відсотків при вкладенні передбачуваної інвестиційної суми в міжнародні банки. У республіці Корея питання виробництва та системи реалізації женьшеню мають свої особливості. Виробництвом женьшеню тут займаються господарства, бо достеменно відомо, що ніякої інформації про знахідки дикорослого женьшеню в Кореї не вдається отримати за останні більш ніж 70 років. Так, в 1989 році в Республіці було 38843 виробляють женьшень господарств, але вже за даними за 1998 рік їх число зменшилося до 20000. На жаль, з ряду причин виробництво женьшеню в країні йде на спад. У той же час споживання женьшеню на душу населення тут становить на рівні 10 американських доларів, при ємності ринку, включаючи реалізацію імпортного та вітчизняного продукту, на рівні 49 млрд. американських доларів. Експорт становить близько 10 млрд. дол. Як показують дослідження, за останній час зростає споживання женьшеню (дикого), що надходить до Республіки Корея щорічно з Північної Кореї, Китаю, Примор'я. Результати показують, що в 1998 році з 100 тис. коренів женьшеню, імпортованого з Північно-східного Китаю, приблизно 20 тис. Представляється, що в найближчому майбутньому до Республіки Корея буде завезено натурального (дикорослого) і дорощенного женьшеню не менше ніж на 100 млн. дол. Однак ринок може отримати розвиток за умови, якщо різниця в ціні складе між дико вирощеним і вирощеним женьшенем не в 100 разів, а хоча б близько 20. В даний час ємність ринку Кореї щодо дикорослого і культивованого женьшеню становить близько 100 млн. амер. дол Розрахунки показують, що в перспективі виробництво женьшеню в Примор'ї може забезпечити половину цієї потреби, тобто виробництво продукції може досягти 50 млн. амер. дол Такий прогноз підтверджується наведеними в роботі економічними розрахунками експортно-імпортних операцій на світових женьшеневий ринках, а також аналізі даних склалися навколо корейського ринку, що дозволяє обґрунтувати можливості виробництва женьшеню в Примор'ї для великого ринку країн Північно-Східної Азії та міжнародного ринку. Виконані дослідження, безумовно, внесли істотний внесок у вивченні біопотенціала українського женьшеню, вдосконалення організації його виробництва на основі проекту економічного співробітництва, а також конкурентоспроможності, особливо дикого женьшеню, на світових женьшеневих ринках. Необхідно відзначити, що в міжнародному співробітництві питання женьшеневий індустрії залежить не тільки від рішення комплексної проблеми виробництва необхідної кількості дикого і культивованих женьшеню, але він у тісному зв'язку і з їх якістю, можливостями закупівель та експорту, системи реалізації, переробки та зберігання. Наявність вищевказаних проблем зумовило потребу в пошуку і розробці наукових положень, спрямованих на розробку проекту економічного співробітництва в галузі вирощування женшеню.

На прикладі вищесказаного бачимо, що вирощування та збір натурального «лісового» женьшеню для України є не доцільним, приходимо до висновку що виробництво женьшеню in vitro є більш вигідним і економічно вірним рішенням. З економічної точки зору виробництво женьшеню в лабораторії має великі перспективи в Україні, тому що всі можливості для цього в нашій державі є. Для приклад можна посилатися на цифри, на кожен вкладений 1 долар маємо 15 доларів чистого прибутку. Таке виробництво забезпечило б все населення вітчизняним, не дорогим продуктом і принесло прибуток державі.

3. Технологічна частина

.1 Характеристика кінцевої продукції виробництва

Кінцевим продуктом виробництва є суха речовина гінзенозиду, виділенного з біомаси калусної культури женьшеню, номер реєстраційного посвідчення UA/11370/01/01 від 1 березня 2011 року.

Форма випуску: порошок (субстанція) у ємкостях з поліетилену високої щільності, нержавіючої сталі для виробництва стерильних лікарських форм (зручних для вживання) або настоянка у влаконах 40-50 мл, та промислові 100-300 мл.

Сучасні медичні дослідження показали, що женьшень містить унікальний набір речовин, що надають сильну дію на організм людини. Серед них такі біологічно активні речовини, як гінзенозид (сапоніни або тритерпенові глікозиди)

Гінзенозиди - це основні діючі біологічно-активні компоненти, як натурального кореня женьшеню, так і вирощеного in vitro. Гінзенозиди за хімічною класифікацією належать до тритерпенових сапонінових гликозидів і поділяються на: панаксозіди А і В, панаквілон, панаксін, гінзенін, які часто називають просто панаксозіди.

Сапоніни - безазотисті глікозиди рослинного походження з поверхнево-активними властивостями. Розчини сапонінів при збовтуванні утворюють густу стійку піну. Назва походить від латинського sapo (нар. відмінок saponis) - мило. Широко поширені в природі, зустрічаються в різних частинах рослин - листі, стеблах, коренях, кольорах, плодах. Містять аглікон (сапогенін) і вуглеводну частину. Для виділення групи сапонінів з інших вторинних метаболітів використовуються властивості поверхневої активності і гемолітичної активності. Однак не всі сапоніни можуть ними володіти. Тому речовини можуть поміщати в групу сапонінів на основі структурної формули (стероїдні та терпеноідние глікозиди). Гінзенозиди належать до терпиноїдних глікозидів.

Рисунок 3.1-основні біологічні речовини кореню женьшеню

Хімічний склад. Корінь женьшеню містить суміш тритерпенових тетрациклічних сапонінів даммаранового ряду - панаксозіди (гінзенозіди). Крім того, в корінні є ефірна олія (0,25-0,5%), пектинові речовини (до 23%), вітаміни В1, В2 і ін, мікро-і макроелементи, крохмаль (до 20%), даукостерін.. З калусної тканини штаму БІО-2, отриманої in vitro від кореня женьшеню, виробляють біомасу женьшеню суху (Biomassa Ginseng sicca).

Зовнішні ознаки. Суха біомаса женьшеню являє собою шматочки округлої або неправильної форми, легкі, пористі, легко розсипаються при розтиранні в порошок.

Рисунок 3.2-хімічний склад кореня женьшеня

Колір від світло-жовтого до світло-коричневого. Запах слабкий, специфічний. Смак солоновато-гіркий.

Мікроскопія. При розгляді порошку біомаси видно обривки округлих меристематичних і овальних паренхімних клітин з тонкими стінками; в клітинах багато простих крохмальних зерен з освітнім центром у вигляді крапки або щілини; зустрічаються кристали у вигляді призм.

Якісні реакції. Для ідентифікації біомаси використовують також мікрохімічний реакцію на крохмаль з розчином люголя після попереднього набрякання біомаси у воді протягом 15 хв. Під мікроскопом видно скупчення червоних і коричнево-фіолетових набряклих крохмальних зерен. Справжність біомаси встановлюють також за допомогою хроматографії спиртового розчину суми тритерпенових глікозидів після проведення кількісного визначення в тонкому шарі сорбенту на пластинах в системі н-бутанол-95% етанол-концентрований розчин аміаку (9:2:5 за об'ємом). Після висушування хроматограм, прояви 5%-ним розчином сірчаної кислоти і нагрівання в струмі гарячого повітря на хроматограмі має з'явитися не менше чотирьох плям від світло-бузкового до фіолетового кольору в області Rf = 0,26 ± 0,43 (тритерпенові глікозиди).

Числові показники. Вміст суми глікозидів в кінцевому продукті, визначених гравіметричним методом, повинно бути не менше 1,5%; вологість не більше 8%; золи загальної не більше 13,5%.

Дія і застосування. Гінзенозиди - тонізуючий засіб - знімає втому і підвищує працездатність, має адаптогенні і імуностимулюючі властивості. Адаптогенні речовини допомагають пристосуватися людині до нових умов клімату, невагомості, хвороби і т. п. Такі властивості женьшеню пов'язані з панаксозидами, які підвищують опірність організму шкідливим фізичних, хімічних і біологічних факторів. Імуностимулюючу дію їх виражається в стимуляції продукції антитіл, що супроводжується збільшенням кількості загального білка і гамма-глобулінів в крові. Панаксозиди стимулюють кровотворення, майже в 2 рази підсилюють біосинтез нуклеїнових кислот, білків і жирів в кістковому мозку, збільшують міотичної активність клітин кісткового мозку. Ці глікозиди мають і радіозахисним дією як при внутрішньому (інкорпораціонному), так і при зовнішньому впливі іонізуючих випромінювань, сприяють виведенню з організму інкорпорованого в кістковій тканині стронцію-90, що, мабуть, пов'язано з посиленням обміну кальцію в кістках. Це відноситься і до інших радіоактивних ізотопів. Захисний ефект проявляється не тільки при профілактичному введенні женьшеню перед гамма-опроміненням, а й при введенні його через деякий час після опромінення. Біологічно активні речовини женьшеню зменшують поглинання полісахаридів, посилюють ресинтез глікогену та фосфатів високої енергії. Встановлено тенденція до прискорення відновлення альбуміну в крові в постгеморатичному періоді, підвищення загальної реактивності організму, благотворний вплив на функції залоз внутрішньої секреції. Зокрема, препарати женьшеню посилюють статеву збудливість і мають позитивну дію при імпотенції. У малих дозах панаксозиди збуджують руховий і дихальний центри довгастого мозку, а у великих, навпаки, викликають їх пригнічення. Більшість клініцистів вважають женьшень засобом, збудливим центральну нервову систему і за широтою терапевтичної дії набагато перевершує фенамін. Проте у великих дозах женьшень надає не збуджує, а має седативну дію. Деякі дослідники вважають, що під впливом препаратів женьшеню проявляється дуже добрий ефект у поліпшенні самопочуття людей, що займаються розумовою працею. Зокрема, підвищується продуктивність праці в нічний час і поліпшується пам’ять. Панаксен, панаксозиди і панаксовая кислота знижують вміст цукру в крові до нормального рівня, прискорюють синтез глікогену з глюкози. Подібно до інсуліну вони прискорюють синтез в печінці і сприяють накопиченню їх у жирових тканинах. Є відомості про те, що женьшень не тільки гальмує виникнення надлишку холестерину в крові, але і є хорошим профілактичним засобом при атеросклерозі. Під впливом препаратів підвищується поглинання метіоніну в печінці і прискорюється його перехід в альбумін сироватки крові, стимулюється тканинне дихання печінки та головного мозку і тому споживання кисню ними збільшується. Женьшень посилює скорочення серця, нормалізує артеріальний тиск. Препарати женьшеню нетоксичні і практично нешкідливі. У них немає абсолютних, з медичної точки зору, протипоказань, але незважаючи на те що під впливом женьшеню знижується артеріальний тиск, не слід призначати його при гіпертонічній хворобі, особливо під час літньої спеки, як і в інших випадках в цей час.

Настоянки - це рідкі спиртові або водно-спиртові витяги, отримані зазвичай з висушеного або свіжого рослинного або тваринного сировини без нагрівання і видалення екстрагента. Згідно з визначенням ДФУ (I вид., 2001 р. с. 513) настоянки - це рідкі препарати, звичайно одержувані з висушеної рослинної або тваринної сировини. Готують настоянки мацерацією, перколяції або іншим відповідним методом із застосуванням спирту відповідної концентрації. Готують їх у співвідношенні 1:10 або 1:5. Майже всі настоянки представляють собою темно-пофарбовані рідини.

3.2Характеристика сировини, матеріалів та напівпродуктів

Показники, що регламентують вимоги до якості сировини, матеріалів та напівпродуктів, що використовуються у виробництві гензинозиду наведені у таблиці 3.1

Таблиці 3.1 - Показники, що регламентують вимоги до якості сировини, матеріалів та напівпродуктів

3.3Обгрунтування вибору технологічної схеми

Культура клітин вищих рослин є альтернативним способом отримання рослинної сировини для медицини, ветеринарії, парфумерії та харчової промисловості. Суть способу полягає в отриманні біомаси культивованих клітин рослин у стерильних умовах в біореакторах промислового обсягу. Суть методу виражається в наступному: з одиничного рослини виділяють клітини і отримують за відпрацьованою технологією культуру клітин цієї рослини, тобто клітини, здатні активно рости при багаторазових пересіву. Для нарощування значних кількостей клітинної біомаси використовують біореактори значних обсягів, аж до десятків куб. м. Часто біомаса клітин in vitro перевершує за властивостями природне або плантаційне сировину. На сьогоднішній день природні сировинні запаси лікарських рослин виснажуються, багато видів (женьшень, золотий і маралів корінь, солодка) знаходяться на межі зникнення. Плантаційний спосіб вирощування часто нерентабельний, непридатний для тропічних рослин, рідкісних, зникаючих видів лікарських рослин і передбачає використання гербіцидів, інсектицидів, що негативно позначається на якості одержуваного сировини та її екологічності. Таким чином, за відсутності ареалу виростання високоцінної лікарської рослини або у зв'язку з його вкрай рідкісною зустрічаються на будь-якому з континентів земної кулі отримання біомаси культур клітин виявляється незамінною. При цьому аналоги розробляються в проекті лікарських засобів за хімічною структурою, біологічної ефективності і спектру властивостей у світовій практиці фактично відсутні.

Переваги біопрепарату: Не дивлячись на те, що дані біологічні субстанції загальновідомі в світовій практиці, пропоновані до комерціалізації біопрепарати є принципово новими продуктами на відповідному ринку біопрепаратів:

) вперше пропонується випускати клітинні біомаси, отримані в штучно відтворених «природних» умовах, що стали можливими завдяки: - Оригінальному штаму клітинної культури, створеному автором і не має аналогів у світі (де стабільний синтез вторинних метаболітів у клітинах in vitro можливий тільки для з'єднань, що сприяють проліферації клітин - ця концепція ефективно використовується для цілеспрямованого отримання штамів-продуцентів культур рослинних клітин); - Унікальної біотехнології відтворення клітинної маси, розробленої за участю вчених МДУ і ІФР (не дивлячись на неодноразові спроби біотехнологів, заяву аналогічного продукту на Західному ринку не відбулося саме через відсутність рівноцінних стабільних технологій продукування клітинної маси, зокрема з Dioscorea deltoidea. Автором вивчений зростання суспензійних культур клітин рослин і розроблена ефективна система і способи їх вирощування, де застосовуються закономірності росту культур клітин в періодичному, напівпроточних, проточному (хемостат, закритий протока) режимах культивування в біореакторах різної конструкції і обсягу).

) вперше пропонується екстенсивно вийти на ринок космоцевтікі з біопрепаратом даного класу (субстанції фуростанолового глікозидів стабільного контрольованого змісту), що стало можливим завдяки розробленій за участю авторів тексту оригінальною технологією масового виробництва субстанції з культивованої клітинної культури Dioscorea deltoidea

) авторами розробки реалізовані багаторазово менш трудомісткі і менш витратні методи виділення діючої субстанції з клітинної маси.

) Продукція вирішує проблеми споживачів:рядовий споживач вирішує для себе проблему забезпечення доступним і, що дуже важливо - ефективним і безпечним лікувально-профілактичним засобом за доступною ціною. Біопрепарат відповідає таким критеріям:

Широкий спектр дії біопрепаратів;

Ефективність (явний оздоровчий ефект);

Порівняно низька ціна;

Добрі рекомендації (від лікарів, спеціалістів, які мають досвід збуту БАДів на ринку РФ, вченими і т.д.)

Виробники вирішують для себе проблему необхідності додаткової експансії на ринку, підвищення конкурентоспроможності своєї продукції, що випускається. Так, виробники харчової продукції, що орієнтуються на сектор продуктів функціонального призначення (тут - лікувально-профілактичних продуктів харчування), отримують можливість проривного виходу на ринок з продуктами незвичайного, досить нового і широкого спектру лікувально-профілактичної дії. Виробники косметичної продукції - кремів, бальзамів, пін і т. п. - отримують у своє розпорядження інгредієнт, який будучи застосовуємо в мізерних кількостях (отже - мала націнка) надає ефективну і зриме захисне і відновлює дію на шкіру. Для таких виробників дуже важлива динамічна реакція споживачів на що випускається косметичний продукт, так як вкладення в запуск і розкручування його на ринку, як правило, вельми великі в цій області. Наявність таких яскраво виражених актопротекторний характеристик у пропонованого препарату, на нашу думку, буде відразу відзначено і підтверджено споживачами.

3.4 Характиристика біологічного об’єкту

Основним типом культивованої рослинної клітини є калус. Значно рідше культивують клітини пухлин рослин різного походження. Культури пухлинних клітин незалежно від способу культивування на рівні морфології мало відрізняються від культур калусних клітин. Значною фізіологічною відміною між ними є гормононезалежний пухлинних клітин, що дозволяє їм ділитися і рости на поживних середовищах без добавок фітогормонів або їх аналогів. Однак пухлинні клітини позбавлені здатності давати початок нормально організованим структурам. У деяких випадках вони здатні утворювати тератоми (потворні органоподобні структури), нормальний розвиток яких не походить. Калусні клітини в пересадковій культурі можуть спонтано отримати гормононезалежність. Природа такої незалежності до ауксину і цитокинин, найчастіше застосовуваним при вирощуванні клітинних культур рослин, може бути генетичної (результат мутації) або епігенетичної (результат експресії генів, що визначають гормононезалежність клітини). При генетичній гормононезалежності калусні клітини поводяться як пухлинні, при епігенетичної вони мають ознака в ряду перетворень клітина - рослина - клітина. Калусних клітина, в результаті поділу якої виникає калусная тканина, або калус, представляє один з типів клітинної диференціювання, притаманній вищій рослині. Для рослини калус є тканиною, що виникає при виняткових обставинах (зазвичай при травмах) і функціонуючої нетривалий час.

Ця тканина захищає травмоване місце, накопичує живильні речовини для анатомічної регенерації або генерації органу. Для отримання культивованих калусних клітин in vitro фрагменти тканин різних органів вищих рослин (експланти) поміщають на штучне живильне середовище в пробірки, колби, чашки Петрі. Процес отримання первинного калусу і підтримка пересадковою культури вимагає строго стерильних умов. Для цього за допомогою стерильних розчинів, що містять хлор або ртуть (гіпохлорити, сулема, діацід), до яких для кращого змочування додані детергенти, стерилізуют експланти, ретельно відмиваючи їх потім від використовуваного розчин стерильною водою. Живильні середовища, розчини, інструменти, матеріали, необхідні для роботи, стерилізують в автоклавах або сухожарових шафах. Всі маніпуляції з культурами проводять в мікробіологічних боксах, опромінюваних перед роботою ультрафіолетом, або ламінарбоксах, де стерильність досягається постійною подачею стерільной повітря в робочий об'єм. Особливості дедіфференціровкі клітин експланти і каллусогенеза залежать від епігенетичних характеристик складових його тканин. Клітини спеціалізованих тканин, експлантованних на живильне середовище, що містить мінеральні солі, джерела вуглецю, вітаміни і гормоноподібні речовини, тобто структури, характерні для їх специфічної функції в рослині, і повернутися до стану ділиться клітини. Часто експланти, що використовують для отримання калусу, є фрагментом органу і включає тканини, клітини яких по-різному диференційовані. Різне тканинне походження первинних калусних клітин є однією з причин гетерогенності культури калусної тканини, так як деякі функциональні особливості вихідних диференційованих клітин передаються у ряді клітинних поколінь як стійкі модифікації або епігенетично успадковані ознаки. У клітинах експланти, що складається з неподілених спеціалізованих клітин, на самому початку культивування можуть спостерігатися зміни в метаболізмі, що викликаються і травматичними синтезами, і діференцировка, і підготовкою до процесу розподілу. Для розділення цих процесів можна застосовувати предінкубацію експлантів на середовищі без гормонів протягом декількох діб (3-6). Це дозволяє виключити не тільки зміни, пов'язані з травмою, але й можливе неконтрольоване вплив ендогенних гормонів експлантати на досліджувані процеси. У підготовлювану до поділу клітці стимулюється синтез всіх типів РНК, зникають тканспеціфічні білки-антигени і з'являються білки, специфічні для клітин, які діляться і калусної тканини. Це свідчить про зміну активності генів і білкового апарату клітин при діференціровці. Освіта калусу не у всіх випадках пов'язане з травматичним впливом. Калус може виникнути в результаті проліферації внутрішніх тканин експланти без зв'язку з поверхнею зрізу. Зростаючий калус розриває шари тканини і розвивається на поверхні. Освіта калусу при експлантуванні фрагмента тканини в умовах in vitro свій-ного дводольним і однодольних покритонасінних і голонасінних рослинам, папоротям, мохам, печеночникам. Первинний калус, що виник на експланти через 4-6 тижнів (залежно від швидкості росту клітин), переноситься на свіжу живильну середу (субкультівіється). Розмір трансплантації при культивуванні на агаризованому живильному середовищі зазвичай становить від 60 до 100 мг маси тканини на 30-40 мл живильного середовища. Таким чином, техніка культивування тканин рослин дозволяє отримати тривалу пересадочних калусних культуру з будь-яких живих тканинних клітин інтактного рослини. Клітини різному дифференцирувати (у тому числі і меристематические) переходять in vitro до складного процесу дедиференціації, втрачають притаманну їм структурне організацію і специфічні функції і індукуються до справжньої, утворюючи первинний калус. [8] У процесі субкультування формується штам, характеризує індивідуальними генетичними і фізіологічним можливостям. При культивуванні рослинних клітин і при вирощуванні культури тканин застосовуються середовища Мурасіге - Скуга, Нагата - Такебе, Хеллера, Нича-Нича, Кнудсон та інші в різних модифікаціях. Основними компонентами поживних середовищ для культури клітин і тканин рослин є мінеральні солі (макро-і мікроелементи), джерело вуглецевого живлення (зазвичай сахароза або глюкоза), вітаміни, регулятори росту. Іноді до складу поживних середовищ включають комплексні органічні добавки (гідролізат казеїну або суміш амінокислот, дріжджовий екстракт, екстракти з різних органів рослин).

Методи вирощування культури калусних тканин

Поверхневе культивування. Культура калусних тканин вирощується поверхневим способом на напіврідкому агаризованому середовищі (концентрація агару - 0,6-1%), де із застосуванням інших желюючих полімерів або на містках з фільтрувального паперу або дисках з пінополіуретану, занурених у рідке живильне середовище. Калусна тканина, що вирощується поверхневим способом, представляє собою аморфну ​​масу тонкостінних паренхімних клітин, що не має чітко визначеної анатомічної структури. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим або червоним; пігментованим повністю або зонально.

Рисунок 3.4-Культивування калусу на живильному середовищі.

Залежно від походження і умов вирощування калусних тканини бувають:

) пухкими, сильно обводненими, легко розсипається на окремі клітини,

) середньої щільності, з добре вираженіми меристематические вогнищами;

) щільними, із зонами редукуватиго камбію і судин.

Як правило, в тривалій пересадковою культурі, на середовищах, де є ауксини, особливо синтетичний аналог ауксину - 2,4 - дихлор-феноксиуксусной кислоту (2,4 - Д), калусні тканини втрачають пігментацію і стають більш пухкими. У циклі вирощування калусні клітини після низки поділів проходять звичайний для клітини рослин онтогенез: вони приступають до зростання розтягуванням, потім диференціюються як зрілі калусниі клітини і, нарешті, деградують. Калусні клітини, вирощувані поверхневим способом, часто застосовують для збереження в зростаючому стані колекцій різних штамів, ліній, мутантів, для регенерації рослин, з них також виходять суспензії клітин, культивованих в рідкому живильному середовищі. [4]

Суспензійне культивування. Культури клітин рослин, що вирощуються в рідкому живильному середовищі, зазвичай називають суспензійного культурами. Термін цей не є строго науковим і точним, так як не пояснює основний особливості поведінки клітин при такому вирощуванні. Отримано ще порівняно мало культур клітин вищих рослин, за своїми параметрами повністю задовольняють вимогам суспензіоного (глибинного) культивування. Значною мірою це ґрунтується труднощами отримання культури клітин, що складається переваг громадської з окремих клітин або невеликих їх агрегатів. Безумовно, вирощування клітинних суспензій в рідкій живильної середи має ряд переваг перед вирощуванням калусних клітин поверхневим способом. Суспензійні культури зручніше для проведення біохімічних і молекулярно-біологічних експериментів - вивчення індукції ферментів і зв'язку їх з подіями клітинного циклу, експресії та репресії певних генів, ізолювання і характеристик мутантів. Суспензійну культуру можна отримати з фрагментів органу рослини (диски запасаючої паренхіми м'ясистих коренів моркви, петрушки, бульб картоплі та ін), проте цей шлях більш трудомісткий і вимагає більшого часу. Клітини експланти повинні при цьому утворювати первинний калус, і тільки після цього поверхневі калусні клітини, що потрапили в рідку середу і розмножилися в ній, дадуть початок лінії, здатної рости в суспензії. Зазвичай для отримання культури клітин використовується культура калусной тканини. Пухкі обводнені культури калусних тканин більш придатні для переведення в суспензію, ніж структуровані щільні калус[9]. Оптимальними підходами для отримання суспензії є вирощування калусів на середовищі з 2,4 - Д, виключення з середовища іонів кальцію, обробка пектиназа трансплантації, призначеного для вирощування в суспензійний культурі. Для отримання культури клітин береться найбільш життєздатна частину калусної тканини, а її кількість повинна бути в 15-20 разів більше в розрахунку на обсяг живильного середовища, ніж при серійному культивуванні на агарі. При цьому може використовуватися живильне середовище того ж складу, що і для поверхневого культивування, але в деяких випадках збільшують кількість ауксинів і (або) зменшують кількість цитокінів. Режим перемішування та аерації при ініціації культури клітин зазвичай такий же, як і при подальших серійних субкультуванні культур клітин на ролерах і гойдалках (кругова гойдалка -10-12 оборотів / хв). Освіта первинної суспензії рослинних клітин можна вважають результатом трьох процесів:

1) розпадання калусної тканини на клітини і невеликі клітинні агрегати в момент внесення в рідку живильне середовище,

) відділення клітин і клітинних агрегатів з поверхні шматочків тканини протягом перших субкультуванні;

) ділення і росту клітин, що утворилися по перших двох способів, і розростаються клітинних агрегатів на більш дрібні агрегати і клітини. Останній процес є типовим для зростання стабілізувати розщепленої культури клітин вищих рослин. Первинну суспензію перед субкультивуванням або в спец. циліндрі поділяють на фракції за швидкістю седиментації (викорис - товують вехньої фракцію), або фільтрують через 1-2 шари марлі, нейлонові або металеві сита, щоб позбутися від великих щільних шматків калусної тканини, залишків експланти і дуже великих агрегатів. Фільтрування рекомендується і в кількох наступних субкультуваннях до придбання клітинної суспензією бажаних характеристик. Однак агрегованість суспензії залежить не тільки від характеристик початкової лінії, але і від умов культивування. Для глибинного культивування рослинних клітин застосовують способи, розроблені для мікробіологічних цілей. Використовують закриті або відкриті системи в періодичному або проточному режимах. Хоча при глибинному вирощуванні рослинних клітин принцип турбідостата практично не застосовується. Однією з причин цього є руйнування частини клітин при відведенні їх до оптичного приладу. Вирощування суспензії клітин рослин в установках безперервного культивування за принципом хемостат застосовується як для вивчення метаболізму клітин, стабільно підтримуються в різних фазах клітинного циклу, так і при промисловому вирощуванні клітинної біомаси з метою отримання економічно важливих продуктів. Однак до теперішнього часу найбільш вивченим і поширеним режимом глибинного культивування клітинних суспензій є закрита періодична система. У цьому випадку для аерації та перемішування суспензії використовують ролери, гойдалки, ферментери з механічними і магнітними мішалками або ферментера барботажного типу, де аерація і перемішування здійснюється повітряним потоком. Критеріями росту в циклі вирощування служить збільшення числа клітин, їх сирої та сухої маси. Модельна ростова крива має типові Б-подібну форму (рис. 3.5).

Рисунок 3.5-Модельна ростова крива

На ній розрізняють: Фази кривої зростання популяції рослинних клітин: I - лаг-фаза; II - експоненціальна фаза; III - фаза лінійного росту; IV - фаза уповільненого зростання; V - стаціонарна фаза; VI - фаза відмирання

) латентну (лаг) фазу, в якій видимий ріст інокуляту не так видно не по одному з критеріїв. При цьому спостерігається висока інтенсивність дихання, максимальні значення енергетичного рівня, інтенсивний синтез ДНК, РНК, білків та інших компонентів клітини, але низький мітотичний рівень. Тривалість періоду адаптації залежить від кількості та фізіологічного стану інокуляту й умовний культивування;

) експонентну фазу, що характеризується зростанням з максібітної швидкістю, максимальними величинами мітотичної активності, а також переважанням дрібних клітин меристематичниго типу;

) лінійну, протягом якої швидкість росту постійна;

) фазу уповільненого зростання, пов'язаного з субстратним лімітованих та інгібуванням продуктами обміну, що характеризується незбалансованим зростанням популяції за основними критеріями, зниженням рівня дихання, переходом частини клітин в диференційоване складаючись, збільшенням частки великих вакуолізірованние клітин, збільшенням синтезу вторинних метаболітів (серцевих глікозидів, антрахінону, диосгенина);

) стаціонарну фазу, що характеризується ще малою швидкістю деградації клітин, яка врівноважується поділом клітин, високіми біосинтетичними і біотрансформуються потенціями життєздатних диференційованих клітин, низьким рівнем дихання і явищем надзвичайно великих вакуолізуванням клітин;

) фазу деградації клітин з питомою швидкістю росту, що приймає негативне значення. Форма реальних ростових кривих може значно відрізнятися тривалістю фаз від модельної. Процеси ростового циклу залежать від виду рослини, кількості внесеного матеріалу і умов культивування (склад живильного середовища, температура, початкове значення рН, склад газової фази, швидкість перемішування). Первинний і вторинний метаболізм культивованих клітин рослин відоспеціфічний, залежить від типу диференціювання вихідних клітин рослини і регулюється умовами вирощування. Генетична мінливість клітин як наслідок їх культивування поза організмом, зникнення одних і поява інших стійких ознак, що передаються у ряді клітинних поколінь, призводить до виникнення з первинної калусної тканини генетично і фенотипічно розрізняються ліній клітин. Це дозволяє відібрати або створити експериментально лінії, що зберігають біосинтетичні системи, характерні для вихідної рослини, і лінії, що синтезують принципово нові речовини. Культивування окремих клітин джерелом окремих (одиночних) клітин є клітинні суспензії в рідкому живильному середовищі, мацерація тканин рослин, ізольованої протопласти після відновлення ними клітинної стінки. Причому ізольовані протопласти є ідеальними окремими клітинами. Культивування окремих клітин дозволяє отримувати клони і досліджувати генетичну і фізіологічну стабільність чи мінливість при вирощуванні клонового матеріалу. Окремі клітини важливі для клонової селекції мутантних, гібридних, трансформованої ліній. Зазвичай в ці клітини вводять маркерні гени або створюють маркерні ознаки для забезпечення селективних умов відбору. Мацерованної клітини тканини рослини є гарною моделлю для порівняльного вивчення фізіологічних процесів в тканини і відслушною клітині. Разом з тим при культивуванні цих клітин на середовищі, стимулюючої поділ клітин, вони диференціюються і утворюють калусні клітини. Для отримання окремих мацерованної клітин використовують спеціальні мацеріруєтся ферментативні препарати, що містять мацеразу (полігалактуронази), пектиназу, полівінілпіролідон, сульфат калію, сорбіт (маніт), 2-ГЯ-морфоліно-етансульфонова кислоту. Дана процедура проводиться в ламінарному боксі в умовах суворої стерильності. Окремі клітини також можуть бути отримані з суспензій із використанням мікроманіпулятора, проточного цитофлюориметрів або шляхом послідовних розбавлень. У цьому випадку суспензії готуються різними способами:

) 1 -2 мл суспензії відбирають з супернатанта після осідання основної маси клітин,

) суспензію фільтрують через фільтри з зменшеним діаметром пор. Для послідовних разкладів використовують плати для мікротітрувань, що дозволяє мікроскопічно контролювати клітинний склад при послідовних розведеннях.Індукція поділок окремих клітин можлива при застосуванні дуже багатою живильного середовища, причому об'єм середовища повинен бути мінімальним. Однак навіть при дотриманні всіх цих умов відсоток розділилися клітин залишається дуже низьким. Більш ефективні методи «годуючого шару» або «тканини-няньки». Для створення «годуючого шару» беруть суспензію клітин того ж виду рослини. Клітинна суспензія повинна знаходитися в ранній стадії ростового циклу. Калусна культура, що служить «тканиною-нянькою», також повинна бути в стадії активного зростання. При досягненні колонією, що виросла з окремої клітини, розміра 0,5-1 мм, вона може бути перенесена для подальшого вирощування на агаризоване живильне середовище безпосередньо або на фільтр, поміщений на поверхню поживного агару. Використання «годуючого шару», «тканини-няньки» або мінімального обсягу середовища, в яку поміщається окрема клітина, пов'язане з явищем, званим «дія фактора кондиціонування». Незважаючи на численні спроби визначити природу речовин, які індукують поділ окреної клітини, і механізм дії фактора кондиціонування, дане питання остаточно не вирішене. Вивчення механізму взаємодії клітин при розмноженні їх в популяції - важлива наукова проблема, яка вирішується на рівні культивування окремих клітин. [9]

Принципи складання поживних середовіщ

Всі живі клітини потребуються екзогенних джерелах живлення, что тримаються в поживних середовищах. Живильне середовище забезпечує жіттєдіяльність, ріст і розвиток біооб'єктів. Перш ніж починати роботи з культівування різніх тіпів клітін, звітність, точно знаті їх.

Постійнім компонентом поживної середи є вода, в якій потребуються всі живі клітини. Живильні речовини утворюють (мінеральнісолі, цукри, амінокислоти, карбонові кислоти, спирту, альдегіди) або колоїдні (білки, ліпіді, неорганічні з'єднання) розчини. Деякі компоненти поживних середовищ, що знаходяться в твердому агрегатному стані, можуть або утворюваті придонних облог, або рівномірно розподілятіся по всьому об'єму у вигляді суспензії, або плавати на поверхні розчин (частки вугілля). Жидкі вуглеводні при внесенні у воду утворюють фракцію, что не змішується. У живильному середовіщі повинні буті присутні всі елєменти, необхідні для побудова компонентів живих клітін в доступній для усвійськовій формі. У великих кількостях клітинам необхідні макроелементи: вуглець, азот, кисень, воден, фосфор, сірка, калій, кальцій, магній. Постачання клітін киснем здійснюється за рахунок води. Вуглець є складових частин всех органічних з'єднань и его джерела численні и різноманітні: найчастіше цукри, багатоатомні спиртами и органічні кислоти. У якості азотного субстрату для виготовлення поживніх середовищ службовців у основного білки твариного і рослиного походження. Крім макроелементів, клітини потрібні деяк мікроелементах: натрій, марганець, нікель, кобальт, хлор, цинк, мідь, кремній, молібден, бор, ванадій и деякі інші. Крім основних пластичних и енергетичних компонентів, живильне середовища може містити і так звані чинниками зростання. Це органічні з'єднання (вітаміни, амінокислоти, пурінові и пірімідінові підстави та ін), в яких потребуються ауксотрофності клітини и які сінтезувати не в змозі. Відсутність таких речовин приводить до порушення обмінних процесів и припиненням зростання клітин. В якості необхідніх компонентів поживної середи можуть виступати гази: (КН3, Н2б), помірно (С02) або погано (1ч2, 02, Н2, СН4) розчинні у воді. Живильні середовища можуть мати невизначений склад, тобто включати біогенні добавки (рослиного, твариного або мікробного оходження). Застосовують також середовища, приготовані з чисто хімічних. Сполука у заздалегідь визначених співвідношеннях. Це так звані синтетичні середовища. Застосування знаходять и полусинтичні поживних середовища, що поєднують у своєму складі компоненти як натуральних, так и синтетичних середовіщ. Середовіща даних типів мают як переваги, так и недоліки.

З Економічної точки зору найбільш доцільно використання природного, більш дешевої сировини, ніж речовини в чистому вигляді. Однак тільки застосування середи дозволяє точно реєструвати и регулювати протікання в культуральному середовищі.

Процеси, які допомагають їх оптімізації. Компромісним підходом є використання напівсинтетичних середовищ, до складу яких поряд із з'єднаннями відомої хімічної природи входять біогенні добавки. В якості біологічних добавок для індукції первинного калусу можно використовувати рослинні екстракти (10-15% від загального обсягу середовища): кокосове молоко (рідкий ендосперм кокосового горіха), витяжки з незрілих зернівок кукурудзи (краще в період молочної стиглості), які містять цитокініни - кинетин і зеатин (6-ти заміщені амінопурин) і NN-діфенілмочевіна.У культурі in vitro застосовують рідкі та агаризовані (тверді) середовища. Рідкі середовища використовуються для культивування суспензій, калусов, ізольованих органів і тканин, рослин - регенерантів. При цьому для підтримки експлантів в пробірці з середовищем поміщають спеціальні містки - підтримки з фільтрувального паперу або синтетичних пористих матеріалів. Агаризовані середовища готують на основі агар-агару - полісахариду, що входить до складу морських водоростей, який утворює з водою гель при pH 5,6-6,0. іноді в якості ущільнювача і замінника агар-агару використовують поліакриламідні гелі (біогелі) P10 і P200. Для штучних поживних середовищ розчини макро-і мікросолей готують заздалегідь і використовують багато разів. Це маткові (концентровані) розчини. Їх зберігають у спеціальних умовах: макро-і мікросолі в холодильнику в посудинах з притертими пробками при 0… +4 оС; вітаміни, фітогормони, ферменти, рослинні екстракти - при-20 оС в невеликих по 5-10 мл посудинах з пробками (пеніцилові флакони). Маткові розчини макросолей зазвичай перевершують робітники по концентрації в 10-40 разів, мікросолей - в 100-1000 разів, вітамінів - в 1000 разів. Розчини фітогормонів бажано готувати безпосередньо перед роботою з середовищами. Для приготування маточного розчину макро-і мікросолей кожну сіль розчиняють в окремому стаканчику при нагріванні, потім зливають і доводять до потрібного обсягу. В охолоджену суміш мікросолей останнім додають розчин солей молібдену, а в макросолі - розчин солей магнію (для запобігання випаданню осаду). Маткові розчини хлористого кальцію і хелату заліза (сірчанокисле залізо + ЕДТА, або Na ЕДТА - трилон Б) готують і зберігають окремо від інших солей. Концентровані розчини вітамінів готують наступним чином: 10-кратні навішування розчиняють у 10 мл дистильованої води кожен окремо. Фітогормони - це речовини, які погано розчиняються у воді. Тому попередньо 100 мг речовини розчиняють у невеликих кількостях (0,5-2,0 мл) спирту (ауксини, гібереліни), 0,5-1н HCl або КОН (цитокініни), потім підігрівають до повного розчинення (крім абсцизовой кислоти і кінетіна) і доводять до 100 мл об'єму (1 мл містить 1 мг речовини). У таблиці представлено склад найбільш часто використовуваних живильних середовищ. Як правило, починаючи працювати з новим об'єктом, дослідники модифікують складу стандартних середовищ, особливо часто варіюючи концентрації і набір органічних компонентів. Приватні приклади поживних середовищ (рис. 3.6).

Рисунок3.6 - Приватні приклади поживних середовищ

3.5 Опис технологічного процесу

Рисунок 3.7-Гідро-пневматична схема виробництва гінзенозиду

СТ1.1-приготування компонентів живильного середовища; Ст1.2.-підготовка води; Ст1.3-приготування живильного середовища; ТП2-приготування спирту етилового; ТП3-нарощування біомаси; ТП4-екстракція біомаси; ТП5-очищення витяжки; ТП6-відстоювання і фільтрування напівфабрикату; ТП7-отримання настоянки; ПМВ1-розлив та маркування; ПМВ2-пакування сухої речовини

Приміщення для роботи з культурами клітин

Стерилізація живильних середовищ, як і всі інші маніпуляції при роботі з клітинними культурами, проводиться в боксових приміщеннях або в ламінарному боксах. Боксове приміщення являє собою ізольовану кімнату з не сорбуючим пил покриттями, що має передбоксник і забезпечену необхідним загальним і спеціальним освітленням, системами припливної та витяжної вентиляції, холодним і гарячим водопостачанням, а також підводами газів та стисненого повітря. Альтернативою боксовим приміщенням, що вимагає менших витрат на устаткування, є ламінар-бокси, або стерильні робочі місця. У цьому випадку в будь-якому приміщенні може бути створений локальний стерільний об'ем, необхідний для роботи і створює біологічну захист користувачів. Технічно завдання вирішується шляхом постійного обдування місця проведення робіт ламінарним потоком. При роботі з завідомо непатогенними матеріалами потік Обезпилення повітря з робочої зони виходить безпосередньо в навколишній простір. У випадку роботи з потенційно патогенним матеріалом повітря перед виходом з робочої зони додатково фільтрується, можливість обдування оператора при цьому виключена. Залежно від пристрою ламінар-боксу потік обезпилення повітря в робочій зоні може бути горизонтальним, вертикальним або похилим.

Ламінар-бокс з горизонтальним потоком. Обезпилення повітря типу УОБГ (установка обеспилування біологічна з горизонтальним потоком) забезпечує очищення повітря, що подається в робочу зону, шляхом фільтрації на фільтрах грубого і тонкого очищення, вбудованих в прилад (у міру забруднення грубий фільтр промивається, тонкий змінюється). Прилад має вбудовані джерела освітлення, УФ опромінення (для стерилізації робочої зони в перервах між використанням боксу) і регулятор швидкості повітряного потоку. [11]

Ламінар-бокс для робіт з потенційно патогенними культурами типу БП-4004 («Бокс-Р») має деякі відмінності. У приладі забезпечується рециркуляція повітряного потоку, яка полягає в тому, що повітря з робочого об'єму потрапляє на спеціальний фільтр тонкого очищення, звідки частина його виходить в навколишній простір, а решті потік повторно проходить через фільтр тонкого очищення і знову надходить у робочий об'єм. Цим досягається неможливість виносу оброблюваного матеріалу в приміщення. Можливість потрапляння повітря, що виходить на оператора, запобігається створенням зони підсосу на відкритій стороні робочого об'єму боксу. Прилад має вбудовані джерела світла і УФ опромінення, стільницю з нержавіючої сталі. Передню частина робочого об'єму закрита прозорим склом, що переміщуються по висоті. Бокс забезпечений системою регулювання швидкості потоку повітря і індикаторами забруднення фільтру тонкого очищення.

Перераховані вище типи ламінар-боксів призначені для разміщення в будь-яких виробничих приміщеннях, що мають припливну вентиляцію з грубої попередньої очищенням повітря.

Прилади та апарати для миття та стерилізації посуду. Прилади та апарати для миття та стерилізації посуду забезпечують виконання всіх етапів технологічного процесу: попередню стерилізацію посуду, що надходить з досвіду, насиченим водяною парою в парових стерилізаторах (автоклавах); попереднє замочування у водних розчинах хімічних реагентів (5% розчині гипохлоріта натрію, 3% розчині перекису водню і т.д.); полоскання після замочування холодної або злегка нагрітою водою; миття гарячим розчином детергенту з низьким піноутворенням; вторинне полоскання гарячою водою; фінішне полоскання дистильованої або загальнолабораторною водою; сушку в сушильних шафах з примусовою продувкою гарячим повітрям; упаковку і фінішну стерилізацію в парових або повітряних стерилізаторах.

Оптимальним варіантом для миття посуду є використання автоматичних мийних машин («Forma Scientific», «Miele», «Hotpack-Heinicke» чи вітчизняних машин типу P3-AMM).

Прилади для дозування, розведення і пробовідбор. У практиці робіт з клітинними культурами постійно виникає необхідність масового дозування, пробовідбору або розведення біологічно активних рідин. Для цього використовуються автоматичні або напівавтоматичні пристрої, звані в різних джерелах дозатори-ділютори, автоматичні піпетки і т. п.

Одним з основних вимог до такого роду приладів є відсутність контакту між дозованим розчином і частинами конструкції дозатора. Даним вимогам відповідають напівавтоматичні та автоматичні шприцеві дозатори, які виробляють розведення або дозування одночасно по двох каналах і можуть працювати як в автоматичному, так і напівавтоматичному режимах.

Найбільш часто вживаний автоматичний шприцевий дозатор типу «Дозатрон-4» призначений для автоматичного дозування рідин в імунологічні планшети з мікрокювет. Обсяг одиничної дози встановлюється залежно від цілей експерименту.

Піпетки лабораторні типу ПЛ-01, дозатори піпеточні типу КДП-1 і П1 виробляють напівавтоматичне дозування біологічно активних рідин. Піпетки лабораторні ПЛ-01 поставляються в наборах з 3 моделей. Величина дози задається користувачем у певному діапазоні (2-20 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл). Комплект дозаторів піпеточних КДП-1 включає 8 моделей, кожна з яких забезпечує видачу 2 фіксованих за обсягом доз (від 5 до 1000 мкл). Комплект дозаторів П1 включає 5 моделей, налаштованих на 1 фіксовану дозу (від 20 до 500 мкл). Всі зазначені типи пристроїв припускають викокористування змінних наконечників, які можуть піддаватися парової стерилізації і повторно використовуватися.

Описані вище прилади дозволяють роботу з рідинами, нагрітими до 40° С і мають в'язкість, близьку до в'язкості води. Тим самим не забезпечується дозування поживних середовищ на основі агару, які для додання їм малої в'язкості повинні бути нагріті до температури не менше 60о С. У таких випадках використовуються прилади типу «Агар-1». Цей апарат для розливу поживних середовищ, що складається з перистальтичного насоса-дозатора і розливного механізму, обеспечити кільсть автоматичне одночасне заповнення протягом 1 хв 16 стеклянних чашок Петрі діаметром 100 мм, що знаходяться в спеціальних планшетах. Стерильні умови в апараті підтримуються шляхом УФ опромінення його внутрішнього об'єму.

В експериментах також застосовуються пристрої малої лабораторної техніки, які не є за своєю суттю дозаторами, але здатні полегшити цей процес. Це так звані прилади «Pipet-Aid» (фірми «Flow», «Bellco», «Cole-Parmer» та інші), призначені для проби-відбору і видачі дози при роботі з піпетками Пастера і будь-якими градуйованими піпетками ємністю до 75 мл. Піпетка вставляється в спеціальний тримач, з'єднаний з малогабаритним вакуумним насосом, що знаходяться або безпосередньо в тримачі, або автономно. Управління роботою приладу проводиться натисненням кнопок, розміщених на утримувачі[6].

Огляд та підготовлення обладнання перед використанням

Під підготовкою обладнання має на увазі очищення, миття та дезінфекційну обробку внутрішніх і зовнішніх його поверхонь.

Підготовку обладнання проводять перед початком або після закінчення технологічної операції, або в кінці зміни. Її слід проводити у спеціальному одязі, призначеної для роботи у виробничих приміщеннях відповідного класу чистоти і, при необхідності, в респіраторі.

Для обробки обладнання рекомендується використовувати поролонові губки або серветки з тканини без ворсу із закладеними краями. При необхідності слід застосовувати щітки або лопатки з синтетичних матеріалів, а також застосовувати пилосос. Після використання матеріали перуть, а інвентар миють у розчині теплої води з миючим засобом, потім прополіскують у чистій водопровідній воді, висушують у спеціально призначеному для цього місці. Перед використанням матеріали та інвентар знезаражують у розчині дезінфікуючого засобу.

Перед початком підготовки відключають від електричного струму обладнання та електроприлади. Видаляють за допомогою щіток, лопаток, пилососа або вологої серветки механічне забруднення або пил з зовнішніх і внутрішніх поверхонь обладнання. Рідини витирають, а при необхідності використовують засоби для знежирення. Обладнання миють спочатку теплою водою (45 ±5) ºС з миючим засобом, потім промивають водою очищеною і висушують або витирають насухо.

Проводять дезінфекційну обробку, протираючи поверхні дезинфікуючим розчином або витримуючи в ньому. Після дезінфікуючої обробки обладнання промивають гарячою водою очищеною.

Після закінчення підготовки обладнання оформлюють відповідний протокол, який підписується відповідальними особами за підготовку цього обладнання. Якість підготовки обладнання контролюється представником відділу контролю якості. Обладнання маркують, вказуючи його готовність до роботи. Зберігати обладнання необхідно в чистому і сухому стані.

Вирощування біомаси штаму-продуцента R1

Проростки насіння женьшеню справжнього Panax ginseng CA Mеy тримісячного віку, інокулював агробактерій Agrobacterium rhizogenes A4. Пухлини, отримані на стеблах проростків в місцях інокуляції бактерій, переведені в стерильну культуру і є вихідним матеріалом для отримання калусу штаму R1. Насіння женьшеню справжнього Приморської популяції отримані з Зональної дослідної станції Всесоюзного інституту лікарських рослин (сел. Стара Варварівка Приморського краю).

Культуральні властивості. Зростаюча калусна культура являє собою тканину пухкої консистенції світло-зеленого кольору, рідше жовто-зеленого кольору без запаху. Ростової індекс культури 14 ± 2 по сирому вагою для калусів початковою масою 80 мг, вміст сухої речовини 5,3 ± 1,3% Живих клітин в середині експоненційної фази росту 90-94%

Спосіб культивування вирощування в накопичувальному режимі на агаризованому живильному середовищі за відсутності освітлення при температурі 25 ± 1оС, відносної вологості повітря 70 ± 10% на живильному середовищі наступного складу, мг / л води: NH4NO3350-450, KNO3 1500-2300, CaCl2,2H2O 400-480, MgSO4, 7H2O 350-400, KH2PO 150-190, H3BO3 4,2-8,0, MnSO4.4, H2O 15,6-26,7, CoCl2, 2H2O 0,02-0,03, CuSO4 ˙, 5H2O 0,02-0,03, ZnSO4,7H2O 6,0-10,3, Na2MoO4,2H2O 0,2-0,3, KJ 0,53-0,90, FeSO4,7H2O 25,0-30,6, Na2EDTA, 2H2O 33,6-41,0, тіаміну гідрохлорид 0,15-0,25, піридоксину гідро-хлорид 0, 4-0,6, нікотинова кислота 0,4-0,6, мезо-інозит 80-120, казеїну гідролізат 80-1204-, хлорофеноксі-оцтова кислота (А-СРА) 0,35-0,45, сахароза 23000-30000, агар 5800-6200рН, середовища до автоклавування 5,6-5,8, каллус пасеруйте з інтервалом 30 діб. Номер пасажу 19-й. [13]

Цитологічна і каріологічна характеристики штаму. Тканина складається на 86-94% з клітин меристематичних типу круглої або овальної форми розміром в середньому 57 х 67 мкм, і з клітин паренхімних типу подовженої форми розміром в середньому 80 х 160 мкм. Крива мітотичної активності має одновершинний характер з максимумом на 9-й день культивування. Середнє число хромосом 56 ± 6 з варіацією від 24 до 190. Здатність до морфогенезу. Спостерігається рідко спонтанний ризогенез при збільшенні тривалості культивування калусыв в пасажі до 1,5-2,0 місяців.

Характеристика біосинтезу гінзенозидів. Штам продукує гінзенозиди (глікозиди дамароновой групи) Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rb1, Rc, Rb2, Rd в кількостях, порівнянних з їх змістом до коренях плантаційний рослин. Гінзенозиди в середу культивування не виділяються. Загальний вміст гінзенозидів (Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rb1, Rc, Rb2, Rd) у калусах штаму R1 4,3 ± 1,0 мг / г сухої маси.

У колби Ерленмейера ємністю 100 мл розливають по 30 мл живильного середовища наступного складу, мг / л води: NH4NO3400, KNO31900, CaCl2,2H2O 440, MgSO4,7H2O 370, KH2PO4170, H3BO36,2, MnSO4,4H2O22,3, CoCl2,2H2O 0,025, CuSO4,5H2O 0,025, ZnSO47, H2O 8,6, Na2MoO4,2H2O 0,25, KJ 0,83, FeSO4,7H2O 27,8, Na2EDTA, 2H2O 37,3 тіаміну гідрохлорид 0,2, піридоксину гідрохлорид 0,5; нікотинова кислота 0,5, мезо-інозит 100, казеїну гідролізат 1004, хлорофеноксі-оцтова кислота (4-СРА) 0,4, сахароза 25000, агар 6000, рН до автоклавування 5,6. [13].Колби із середовищем автоклавують при 117оС протягом 20 хв, потім охолоджують. На поверхню агару поміщають калус штаму R1 в кількості 0,5 г на кожну колбу. Культуру інкубують у темряві при 25оС і відносної вологості повітря 70% протягом 30 діб. Потім калус витягують з колб і зважують. Після ліофільної сушіння калусів в них визначають зміст гінзенозидів за методом, розробленим в Тихоокеанському інституті біоорганічної хімії ДВО АН СРСР (Маханьков В.В. Самошина Н.Ф. Малиновська Г.В. Атопкіна Л.М. Денисенко В.А. Ісаков В.В. Калиновський А.І. Уварова Н.І.) Аналіз глікозидів дамаранового ряду в природних і синтетичних сумішах методом високоефективної рідинної хроматографії. (Хімія природних сполук, 1990, №1, с. 57-61).Для цього суху біомасу штаму R1 вичерпно екстрагують 70%-ним водним метанолом. Отриманий упаренний екстракт розчиняють у 70% водному метанолі. Отриманий упаренний екстракт розчиняють у воді і послідовно екстрагують спочатку пентаном, а потім насиченим водою н-бутанолом. Бутанольна частина упарюють при зниженому тиску до постійної ваги, потім розчиняють у метанолі. Отриману суму гінзенозидів аналізують за допомогою мікроколончатого хроматографа «Міліхром» зі сталевими колонками 64 х 2 мм, заповненими сорбентом «Сферісорб» ОДС 5 мкм. Елююють градієнтом суміші ацетонітрил вода від 20:80 до 50:50. Час поділу 25 хв, витрата розчинника 2,5 мл. Детектування елюата здійснюють при 204 нм.

Пріготування живильного середовища

Завдання фахівця, оптимізуючого склад середовища для конкретного виду клітини, - вибрати такі джерела вуглецю, азоту, фосфору та інших речовин, які найбільш виправдані в економічному та екологічному відношеннях.

Принцип складання поживних середовищ. Кожен конкретний вид клітин, що використовуються в біотехнології, суворо вибірковий до живильних речовин. Потреба клітини в тих чи інших з'єднаннях визначається фізіологічними особливостями даного виду клітини, але у всіх випадках середовище має бути водним розчином цих речовин і забезпечувати в певній кількості їх приплив у клітку.

Найважливішою умовою приготування поживних середовищ є дотримання правил асептики. Для знезараження поживних середовищ застосовують, як відомо, хімічний вплив (дезінфекцію), вплив температури та інших фізичних факторів (ультразвуку, ультрафіолетових променів, ультрафільтрації). Кожен з цих методів вельми вибірковий. У біотехнології широко застосовують термічні методи знезараження поживних середовищ (автоклавування, стерилізацію, кип'ятіння тощо). Спори мікроорганізмів більш стійкі до високої температури, тому саме спори бактерій є лімітуючим фактором, що визначає температурні режими стерилізації середовищ.

Для стерилізації повітря в разі аеробних процесів культивування використовують фільтрування і ультрафіолетове опромінення

Постійним компонентом поживних середовищ є вода, в якій потребують всі живі клітини. Живильні речовини утворюють у воді істинні (мінеральні солі, цукру, амінокислоти, карбонові кислоти, спирти, альдегіди) або колоїдні (білки, ліпіди, неорганічні сполуки) розчини. Деякі компоненти поживних середовищ, що знаходяться в твердому агрегатному стані, можуть або утворювати придонний осад, або рівномірно розподілятися по всьому об'єму у вигляді суспензії, або плавати на поверхні розчину (частки вугілля). Рідкі вуглеводи при внесенні у воду утворюють незмішану фракцію.

В якості необхідних компонентів поживних середовищ можуть виступати гази: добре (КН3, Н2б), помірно (С02) або погано (1ч2, 02, Н2, СН4) розчинні у воді. Живильні середовища можуть мати невизначений склад, тобто включати біогенні добавки (рослинного, тваринного або мікробного походження), наприклад м'ясної екстракт, дріжджовий екстракт, кукурудзяну муку, морські водорості і т.д. Такі живильні середовища називаються натуральними. Застосовують також середовища, приготовані з чисто хімічних сполук у заздалегідь визначених співвідношеннях. Це так звані синтетичні середовища. Застосування знаходять і напівсинтетичні поживні середовища, що поєднують у своєму складі компоненти як натуральних, так і синтетичних середовищ.

Устаткування для очищення води

Якість води, що використовується для приготування поживних середовищ або для миття культурального посуду, має важливе значення. До недавнього часу така вода приготовувалася шляхом простої і дворазовою дистиляції питної води. В даний час поряд з традиційними широке застосування отримали методи очищення води шляхом використання фізико-хімічних процесів зворотного осмосу, іонного обміну та мембранної фільтрації. Водопровідна вода, що використовується в якості вихідної і пройшла в цих установках через очищення зворотним осмосом, надходить на фільтри з активованого вугілля, з них - на колонки з іонообмінними смолами і потім - на мембранні фільтри з діаметром пор 0,22 мкм. При необхідності вода додатково піддається впливу потужного потоку УФ опромінення. Для очищення води подібним способом найбільш часто застосовуються установки типу, які з двох конструктивно самостійних частин, що допускають незалежне використання. Установка здійснює приготування загальнолабораторні води, висхідній за якістю очищення дистильовану воду. Установка призначена для отримання придатної для приготування поживних середовищ надчистої з загальнолабораторній або дистильованої води. [10]

Приготування спирту етилового

Спирт етиловий 96% надходить па фармацевтичну фабрику від спиртзаводів в цистернах або спиртових бочках і зберігається в спиртосховище.

При надходженні кожна партія спирту етилового проходить вхідний контроль згідно з ГОСТ 5962-67, ГОСТ 5964-93, ФС 42-3072-94, изм. 1. В кількості добової потреби галенового цеху, спирт за вагою передається в цех, де зберігається в приймачі. Розрахунок кількості спирту етилового 96% і води очищеної для приготування спирту 70% ведуть відповідно з «Алкоголеметрическими таблицями» ГФ XI. Приготування спирту етилового 70% проводять в ємності для приготування водно-спиртових сумішей.

У ємність, встановлену на вагах, перекачують з приймача спирт етиловий 96% по вазі, і туди ж перекачують воду очищену із збірки для зберігання води очищеної за вагою. Отриману водно-спиртову суміш перемішують мішалкою протягом 10 хвилин при тиску стисненого повітря 0,1-0,15 кг/см2. Апаратник заміряє спирт спиртоміром. На цій стадії отримують 435,6 кг спирту етилового (69,96%. про.).

Приготування спирту етилового 70% проводять у три прийоми: 217,8 кг, 108,9 кг і 108,9 кг. Виходячи при цьому з наступних розрахунків: при приготуванні першої порції водно-спиртової суміші змішують 143,2 кг спирту етилового 96,7% і 74,6 кг води очищеної; для приготування другої та третьої порцій водно-спиртової суміші змішують з 71,6 кг спирту етилового 96,7% та 37,3 кг води очищеної. Всього на стадії приготування етилового спирту 69,96% використовують 286,4 кг спирту етилового 96,7% і 149,2 кг води очищеної. Вихід на стадії становить 99,9%

Обладнання культуральних лабораторій

Лабораторні термостати. Лабораторні термостати для культивування клітин повинні відповідати ряду спеціальних вимог:

) забезпечувати високу стабільність підтримки заданої температури,

) створювати мінімальний градієнт температури по корисного об'єму;

) мати системою швидкого відновлення температури після короткочасного відкривання корисного об'єму;

) внутрішній обсяг повинен виготовлятися з біологічно пасивних матеріалів, тобто не впливають на життєдіяльність клітин і стійких до впливу компонентів поживних середовищ. Матеріали і покриття внутрішніх та зовнішніх частин конструкції термостата повинні дозволяти деконтамінацію водними розчинами спирту ректифікату і стерилізацію УФ опроміненням.

ССБ-інкубатори. Необхідність підтримки постійної величини рН в живильному середовищі і її мінімального випаровування в період інкубації клітин привела до розробки спеціальних приладів, аналогічних описаним вище термостатам. Головною відмінністю є наявність систем створення і підтримки певного складу газового середовища в корисному об'ємі і високої відносної вологості в ньому. Це так звані інкубатори, що випускаються фірмами «Heraues», «Hotpack», «Flow».

Газове середовище в камерах СО2-інкубатора містить підвищену концентрацію кисню і вуглекислого газу, а в більшості випадків тільки вуглекислого газу. Розмір концентрації задається за умовами культивування та підтримується автоматично. У автоматичних СО2-інкубаторах заданий склад газового середовища підтримується дозованим надходженням потрібного газу в потік очищеного від пилу зовнішнього повітря, що подається у внутрішній обсяг приладу. Інший різновидністю інкубаторів є так звані газопроточні інкубатори, де подача потрібних газів проводиться безперервно, а процентний вміст досягається зміною швидкості протоку.

Культивування калустної тканини

Лабораторні ферментери. Це комплекси приладів і апаратів для масового суспензійного або глибинного культивування клітинних. У лабораторній практиці ферментери застосовуються для ведення науково-дослідних робіт або відпрацювання технології масового культивування (пілотні біореактори).

У загальному випадку ферментер складається з культиваційних судини, насосів і сполучних трубопроводів (для подачі живильного середовища, газів, інокуляту та відбору продукту), вимірювальних приладів і регуляторів, керуючих температурою середовища в посудині, її рН, окислювально-відновним потенціалом та іншими параметрами. У лабораторній практиці найбільш часто застосовуються ферментери з ємністю судин від 1 до 20 л, для відпрацювання технологій - від 30 до 400 л. У всіх випадках живильним середовищем заповнюється не більше 75% обсягу судини.

Вирощування проводили в ферментере загальним обсягом 630 л (1Т, ОКБА, Йошкар-Ола) у напівбезперервний режимі. Перемішування і аерацію суспензії здійснювали шляхом барботажа стерильним повітрям при температурі 26 +1 оС. Визначали сиру і суху масу, число клітин і життєздатність культури. Зміст семи тритерпенових глікозидів (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rf, Re, Rg1) визначали методом ВЕРХ.

Було проведено три послідовних циклу вирощування, загальний час кукси-вірування склало 55 діб. Перший цикл вирощування (14 діб) здійснювали з використанням сахарози, виробництва MERK (25г / л); другий і третій (по 21 діб) сахарози марки MERK + цукру-рафінаду (1,25 г. / л +1,25 г. / л).

При аналізі ростових характеристик культури, найбільше накопичення біомаси склало 9,48 г. / л (суха вага) наприкінці першого субкультивування, яке проводили з використанням сахарози високого ступеня очищення. Питома швидкість росту в експоненціальної фазі (м) склала 0,16 сут. - 1. У варіантах з використанням сахарози харчового і хімічного очищення максимальне накопичення біомаси склало приблизно 7 г / л по сухому вазі. Максимальна питома швидкість росту склала 0,10 сут-1. Загальна кількість гінзенозидів в біомасі також мало істотні відмінності: в кінці першого циклу вирощування воно склало 2,17% до сухої маси клітин, при додаванні в живильне середовище сахарози харчової ступеня очищення, вміст гінзенозидів знизилося до 1,18% до кінця другого циклу вирощування і 0,74 \% до кінця третього.

Частини ферментерів, що контактують з живильним середовищем (судини, з'єднувальні трубопроводи, насоси та ін), виготовляються з біологічно пасивних, хімічно стійких матеріалів, що дозволяють виробляти стерилізацію насиченим водяною парою (якісна нержавіюча сталь, фторопласт, боросилікатне скло, силіконова гума).

Більшість перемішувальних і аеруючих культур під час росту утворюють досить багато піни. Утворення на поверхні середовища культивування шару з бульбашок пов'язано з наявністю в середовищі поверхнево-активних речовин (ПАР), до числа яких відносяться продукти розпаду жирів - мила, а також білки. ПАР включають як полярні іонні, так і неполярні угруповання. Заряджені групи мають спорідненість до водній фазі, а нейтральні виштовхуються в повітряну фазу, де, вбудовуючись в стінки газових бульбашок, збільшують час їхнього життя. Помірне піноутворення сприяє зростанню багатьох рослинних клітин (пінний шар - кисневий коктейль). Особлива увага приділяється боротьбі з надлишковою піноутворенням, якщо не преперешкоджати цьому, піна змочує фільтри для стерилізації повітря, що призводить до контамінації культури сторонньої мікрофлорою, зменшення корисного об'єму біореактора, а також виходу піни назовні. Контроль піноутворення здійснюється шляхом введення в судину спеціального датчика. Для боротьби з надмірною піноутворенням використовується механічне та хімічне піногасіння. При механічному піногасіння лопаті піногасника розміщуються на валу мішалки. При хімічному піногасінні в кришці посудини передбачається спеціальний введення для реагенту гасіння. Хімічні піногасники більш дешеві, їх використовують час від часу при необхідності придушення піноутворення. Однак при додаванні цих речовин може змінюватися склад живильного середовища. Піногасячі речовини рослинного (кукурудзяна, рицинова, соєва, соняшникова олія, олія з насіння бавовнику та інші) і тваринного (свинячий, яловичий, баранячий, китовий та інші жири) походження можуть служити мікроорганізмам джерелом вуглецю та енергії і, отже, стимулювати їх активний розвиток. Однак відомі випадки, коли природні піногасники чинили негативний дію на метаболізм клітини. А такі неметаболізовані піногасники, як силікони, у високій концентрації токсичні. Тому піногасники, які є поверхнево-активними речовинами, слід використовувати тільки в дуже низьких концентраціях і лише після ретельної перевірки. Піногасники додають безпосередньо у середу перед стерилізацією або в ферментер через спеціальний введення. На оптимальної живильному середовищі при сприятливих значеннях рН і температури, за умови подачі необхідної кількості повітря в середу клітин швидко починають рости і розмножуватися, забезпечуючи накопичення біомаси продуцента і біологічно цінних метаболітів в культуральній рідині. Для культивування рослинних клітин в промислових масштабах застосовують ферментери (або ферментатори) - реакційні ємності, в яких за певних умов знаходяться клітини. Основне призначення ферментатора - своєчасно забезпечити клітини необхідними поживними речовинами і киснем (при необхідності) і відвести продукти обміну речовин, створити однорідний склад середовища за умови слабкого потоку культуральної рідини (при безперервному культивуванні). Для підтримки кисневого режиму ферментатор забезпечується пристроєм підведення повітря, для кращого перемішування середовища - мішалками різної конструкції. Для підтримки температури середовища передбачені системи охолодження. [10]

Аератори. Для забезпечення аерації культурального середовища - постачання киснем - використовують повітря, а також повітря, збагачене киснем, рідше - чистий кисень. Процеси, що протікають без доступу кисню (анаеробні), залежать від газоподібних субстратів і вимагають відводу газообразних продуктів життєдіяльності. Аератори - основний приклад функціонуючих систем газопостачання та газовідводу.

Лабораторні струшувачі. Велике значення в оснащенні лабораторії, призначеної для культивування клітин, мають прилади, що забезпечують примусове перемішування поживних середовищ з поміщеними в них клітинними культурами, забезпечуючи кращий газообмін і тим самим підвищуючи ефективність культивування. Більшість моделей струшувачів дозволяє перемішування в одному режимі - обертальному або повернення-но-поступальному. Хоча найбільш сучасні моделі (фірма «1 пгогв») є універсальними, тобто працюють в різних режимах перемішування. Ролерні установки - апарати, що дозволяють успішно застосовувати один із загальноприйнятих методів культивування клітин-вирощування їх в циліндричних судинах з боросилікатного скла з невеликою кількістю живильного середовища, що обертаються в горизонтальному положенні зі швидкістю 8 обертів / хв, забезпечуючи постійне перемішування живильного середовища і інтенсивне зростання клітин. Для підвищення ефективності масового культивування установки забезпечені системою, що дає можливість замінювати живильне середовище і видаляти супернатант без зупинки обертання. Для цього судини забезпечуються спеціальними перфузійним пробками, в яких центральна частина обертається незалежно від периферійної. У цю частину пробки вводяться трубки для зміни живильного середовища, видалення супернатанту і введення інокуляту. До складу даної системи також входять перістальтичні насоси і блок автоматики, регулюючий їх роботу. [10]

Рідинна екстракція

Екстрагенти забезпечують перехід цільових компонентів з вичерпним (важкою) фази, найчастіше представляє собою водний р-р, в витягує (легку) фазу (зазвичай орг. рідина). Дві контактують рідкі фази і розподіляється між ними цільовий компонент утворюють екстракції систему. В якості розріджувачів використовують, як правило, рідини (гас, бензол, хлороформ та ін) або їх суміші, які в вичерпує фазі практично нерозчинні і інертні стосовно вилученими компонентам р-ра. Іноді до розріджувачів додають модифікатори, що підвищують екстрагування компонентів у фазі або полегшують розшаровування фаз (спирти, кетони, трибутилфосфат і т.д.).

До основної стадіями екстракції рідинної відносяться:

) приведення в контакт і диспергування фаз;

) поділ або розшаровування фаз на екстракт (витягується фаза) і рафінат (вичерпний фаза),

) виділення цільових компонентів з екстракту і регенерація екстрагента, для чого поряд з дистиляцією. часто застосовують реекстракції (процес, зворотний екстракції рідинної), обробляючи екстракт водними розчинами в-в, які забезпечують повний переклад цільових компонентів в р-р або осад і їх концентрування;

) промивання екстракту для зменшення вмісту і видалення механічно захопленого вихідного р - ра.

Процес екстракції проводили при температурі 4-9оС при співвідношенні рафінату і екстрагента 1:1. Процес вели при перемішуванні з частотою 60 об / хв. Рівноважна концентрація гінзенозидів в екстракті досягалася через 1,25 ч. Для вилучення залишкової кількості гінзенозидів осад піддавали повторної екстракції чистим етанолом і центрифугуванням. Отримані на першій і на другому ступені екстракти об'єднували. Надлишок етанолу з екстракту видаляли відгонкою під вакуумом.

Виділення сапонінів з рослинної сировини включає в себе отримання сумарного екстракту та очищення його від баластних речовин з подальшим поділом суміші на індивідуальні сполуки. В основному зараз виділяють сапоніни екстракція метанолом, етанолом і ізопропаном.
Для виявлення сапонінів в рослинному сировину використовують реакції засновані не фізичні властивості (реакції піноутворення), кольорові (з Н2SО4
концентрованої жовтий колір переходить у червоно-рожевий; Ванілін + конц Н2SО4. t0C отримують, що тритерпенові забарвлюються в червоний колір, а стероїдні - в жовтий; конц Н2SО4. + Солі міді t0C - отримують сіні-зелене забарвлення) та осадові реакції, а також засновані на біологічних властивостях сапонінів (гемоліз). Для кількісного аналізу застосовують методи визначення гемолітичного, риб'ячого індексу і пінного числа, а також хімічні методи. [21]

Очищення витяжки

Водні і водно-спиртові витяжки з малою кількістю етанолу (20-40%) містять багато високомолекулярних сполук (водорозчинні білки, цукри, ферменти, пектини, слизи, крохмаль), які до випарювання повинні бути обов'язково видалені. В залежності від кількості і властивостей баластних речовин використовують різні методи очищення. У ряді випадків очищення проводять кип'ятінням якщо - ні інактивації БАВ. Коагульовані при цьому білки швидко відшаровуються. Іноді застосовують адсорбенти (каолін, бентоніти, тальк тощо) або поєднання адсорбентів з кип'ятінням. Часто застосовують спосіб видалення баластних речовин шляхом осадження їх спиртом. Спиртоочистка проводиться з попередніми упарінням витяжок до половинного об'єму відносно маси вихідної сировини. Після охолодження до неї додають подвійний об'єм міцного (95-96%) етанолу. Все ретельно перемішують і залишають на 5-6 днів при температурі не вище 10°С. Відстояний шар зливають з осаду і фільтрують. Очищену витяжку, при необхідності, піддають подальшого згущення.

Для витяжок застосовують метод заміни екстрагента. При цьому до упаренної до половинного об'єму відносно маси вихідної сировини витяжки додають воду в кількості, рівній масі сировини. Розчинні в хлороформі хлорофіл, смолисті речовини випадають в осад, так як вони не розчиняються у воді. Витяжку відстоюють, фільтрують і піддають подальшій обробці. [15]

Отримання настоянки

Настоянку отримують методом настоювання у перколяторах об'ємом 250 л. Для екстракції суми екстрактивних речовин із клітин кореня женьшеню використовують спирт етиловий 69,96%.Екстракцію ведуть в перколяторах так, щоб екстрагент проходив порційно через перколятор. У перколятор завантажені клітинами попередньо по 20 кг. Екстрагент додають в три прийоми в перколятор: 217,7 кг, 108,8 кг, 108,8 кг, з р2о=0,8856 (69,96%). Час настоювання на кожній операції 24 години. Відповідно отримують три порції 1 зливу самопливом: 165 кг (р20=Про, 8914); 105 кг (р20=ПРО, 895О); 110 кг, які направляють послідовно в перколятор: туди ж спрямовують і віджимання зі шроту з (t) в кількості 41,4 кг, шрот в кількості 77,1 кг (вологість 75,2%), віджимають на гідравлічному пресі (П-1 1), і отримують віджатий шрот в кількості 31,7 кг (вологість 32,4%) і направляють у відвал. З другого перколятора через кожні 24 години самопливом зливають три порції напівфабрикату настоянки: 112 кг р20=0,8940); 90,8 кг (р20=0,8972); 171,4 кг (р20=0,8960), вивантажують шрот 68,5 кг (вологість 72%) і направляють на гідравлічний прес, де отримують 31,9 кг віджиму (р20=0,8950) і додають його до напівфабрикату настоянки, а 34 кг віджатого шроту (вологість 38.2%) направляють у відвал. Всього направляють у відвал 65,7 кг (вологість 35,4%) шроту. Всього на стадії отримують 406,1 кг напівфабрикату настоянки (р20=0,8956). Вихід на стадії становить 84,7%. [5]

.6.12 Відстоювання і фільтрування напівфабрикату настоянки
 Напівфабрикат відстоюють у відстійнику в холодильній камері при температурі +10±2°С протягом 2-3 діб, після чого ПФ фільтрують на фільтр-пресі. В якості фільтра використовують рамний фільтр-прес. На передній частині рами укріплені на болтах упорна плита і траверса, які стягуються двома опорними балками, на них спираються проміжні плити і натискна плита. Фільтруючим елементом є фільтрувальний картон, поміщений між плитами. Пакет плит в стислому стані утворює ряд камер. Кожна камера розділена на дві половини фільтрувальним картоном. З боку нагнітаючої магістралі камери з'єднуються з камерами для підведення настоянки, з боку вихідний магістралі з каналами для відведення фільтрату. Канали утворюються з отворів у припливах плит при стислих плитах. Напівфабрикат настоянки, по трубопроводу з відстійника насосом фільтрувальної установки подається на фільтрувальну установку. Контроль фільтрації ведеться по манометру. РРАБ=0,1-0,15 МПа. фільтрат збирається із фільтруючих елементів у вихідний трубопровід, з якого готова настоянка надходить в чисту ємність. Для фільтрації ПФ настоянки можна використовувати фільтр-установку, де в якості фільтруючого елемента використовується ватно-марлевий (4-х шаровий) фільтр або бельтинг. Фільтруючий матеріал укріплений хомутами на фільтротримачі перфорованому, з нержавіючої сталі. Фільтротримач порожнистий і з'єднаний з вихідним трубопроводом, поміщений в корпус з нержавіючої сталі. З вхідного трубопроводу напівфабрикат настоянки подається насосом фільтр-установки, що надходить в корпус і через фільтруючий матеріал і фільтротримач збирається у вихідний трубопровід поступає в чисту ємність. Процес фільтрації контролюється по манометру, РРАБ=0,1-0,15 МПа. Утворюється осад, в кількості 4,4 кг утилізується через каналізацію. Після фільтрації отримують 400,5 кг настоянки

Вихід на стадії становить 98,6%. [7]

Маркування та упаковка настоянки

На кожен флакон наклеюється етикетка з наступним змістом: підприємство-виробник і його товарний знак, назву препарату латинською та російською мовами, обсяг препарату у мілілітрах, умови зберігання, номер реєстраційного посвідчення, номер серії, термін придатності, штриховий код. Номер серії та термін придатності друкується на машинах На пакувальному столі кожен флакон по 40 мл та 50 мл вручну укладаються в пачку з картону коробкового по ГОСТ 7933-75 типу «Хром-ерзац» або марки «А» разом з інструкцією по застосуванню препарату, з додатком, де зазначено номер пакувальника. Пачки встановлюються вертикально в упаковку з паперу обгорткового, поклавши паперові прокладки (зверху, знизу).
Упаковки е настоянкою по 40 мл та 50 мл - по 20 шт., обв'язують ниткою бавовняної, на кінці якої наклеюють етикетку. Допускається обв'язка пакування стрічкою-скотч. На груповій етикетці затвердженого зразка міститься наступна інформація: підприємство-виробник, товарний знак, назву препарату українською та латинською мовами, обсяг препарату у мілілітрах в одному флаконі, кількість флаконів, умови зберігання, номер реєстраційного посвідчення, номер серії, термін придатності, штриховий код.

Флакони з настойкою по 5 кг, 9 кг і 19 кг упаковуються таким чином: пробку, кришку і горловину бутлі обгортають змоченим пергаментом за ГОСТ 1341-74, обв'язують суворими бавовняними нитками по ГОСТ 6309-80, на кінці яких наклеюють етикетку з паперу етикеткової по ГОСТ 7625-55 або марку з товарним знаком заводу. На етикетці вказують вагу готового продукту в кілограмах.

Флакони з настойкою календули по 5 кг, 9 кг і 19 кг, які пройшли стадію маркування, упаковують у дощаті ящики по ГОСТ 2991-85, заповнені пухким прокладним матеріалом. [16]

3.6 Опис запропонованих змін в технології

У результаті патентного пошуку було оброблено патент РФ №2101934 технічним результатом, на досягнення якого спрямован винахід, є підвищення якості та кількості виходів цільового продукту - гензинозиду. Технічною задачею, є створення способу вирощування біомаси женьшеню, що дозволяє підвищити вихід біомаси женьшеню і вміст у ньому глікозидів. Дане завдання здійснюється тим, що в способі вирощування біомаси женьшеню клітинна культура женьшеню піддається опроміненню вузькосмуговим джерелом оптичного випромінювання, зокрема інжекційном лазером, світлодіодом або гелій-неоновим лазером. Спосіб реалізується наступним чином. Клітини женьшеню опромінюються по одній з наступних методик у рамках запропонованого способу.

. Опромінення проводиться в один сеанс на день висадки клітин в живильне середовище (в тому числі безпосередньо перед висадкою).

. Опромінення проводиться в один сеанс через 7 днів після висадки клітин в живильне середовище.

. Опромінення проводиться в два сеанси (з однаковими дозами) у перший і чотирнадцятий день після висадки в живильне середовище.

. Опромінення проводиться в три сеанси (з однаковими дозами) у перший, сьомий і чотирнадцятий дні після висадки клітин в живильне середовище.

За пропонованим способом для кожної з чотирьох розглянутих методик загальна доза опромінення становить 3000 Дж/м2. В якості культури женьшеню використовувався штам «R-1». Штам інкубували агарізірованной живильному середовищі в затемненому приміщенні. Джерелом вузькосмугового оптичного випромінювання був один з наступних типів джерел: інжекційний лазер з довжиною хвилі випромінювання 820 нм, інжекційний лазер з довжиною хвилі випромінювання 1300 нм, гелій-неоновий лазер з довжиною хвилі випромінювання 632,8 нм, світлодіод з довжиною хвилі випромінювання 850 нм, світлодіод з довжиною хвилі випромінювання 850 нм, випромінювання якого пропускалося через поляризатор, встановлений між світлодіодом і опромінювати клітинами. Необхідно відзначити, що зазначені джерела вузькосмугового оптичного випромінювання володіють різними параметрами, істотними для практичного застосування, такими як потужність, надійність, габарити, наявність високої напруги в приладі і т.д. Тому залежно від конкретних умов представляється доцільним використання одного із зазначених типів випромінювачів. У разі коли загальна доза опромінення клітин приймала значення в діапазоні (жовтень 3000) Дж/м2, відбувалося збільшення одержуваного врожаю сухої біомаси клітин женьшеню в 1,8 рази. При цьому зміст глікозидів, що контролювалися методом хромотографии, збільшилося в біомасі в 1,6 рази. Необхідно відзначити, що зазначений результат і значення доз опромінення, при яких він досягається, не залежав від того, який з типів вузькосмугових джерел оптичного випромінювання був застосований, і не залежав від того, набиралася зазначена доза опромінення за один або кілька сеансів в зазначені моменти часу. Відсутність цих залежностей, а також досить широкий діапазон ефективних доз опромінення пояснюється універсальним дією вузькосмугового оптичного випромінювання на біологічні системи. У разі, коли доза опромінення становила менше 10 Дж/м2, збільшення біомаси та вміст біологічно активних речовин було незначним і при дозі меншій 5 Дж/м2 це збільшення не відбувалося. У разі коли доза опромінення приймала значення більше 3ООО Дж/м2, зазначена зміна був також незначним, а при істотно великих дозах спостерігалося деяке (близько 10-20%) зменшення біомаси. Таким чином опромінення клітинної культури женьшеню вузькосмуговим оптичним джерелом випромінювання в один або кілька сеансів опромінення при сумарній дозі Дж/м2 дозволяє збільшити вихід сухої біомаси і збільшити вміст глікозидів в біомасі. Промислова апробація способу вирощування біомаси женьшеню проводилася на державному підприємстві «Фарматекс» в м. Павлодар. Цикл виробництва від моменту висадки клітин в живильне середовище до знімання врожаю займав 35 днів. При цьому відбулося збільшення одержуваного врожаю сухої біомаси клітин женьшеню в 1,8 рази; зміст глікозидів збільшилося в біомасі в 1,6 рази. Отримані результати дозволяють говорити про цілком реальних можливостях промислового виробництва женьшеню.

3.7 Контроль виробництва, стандартизації та сертифікації

Система сертифікації продукції і товарів в Україні. Сертифікація продукції, сертифікація товарів і послуг, сертифікат, сертифікат відповідності, обов'язкова сертифікація продукції, знак відповідності, система сертифікації УкрСЕПРО, продукції, яка підлягає обов'язковій сертифікації регламентована законодавчо.

Сьогодні значення сертифікації постійно збільшується. З боку держави це відчувається в розширенні переліку продукції, яка підлягає обов'язковій сертифікації. Для виробників продукції сертифікат є потужним фактором у боротьбі з конкурентами за ринок збуту.

Сертифікація - це процедура, за допомогою якої третя сторона дає письмову гарантію того, що продукція (товар, процес, послуга) відповідає певним умовам. Третьою називають сторону, яка не залежить від першої сторони (постачальника) і другої сторони (покупця). Головним завданням сертифікації є запобігання реалізації продукції, небезпечної і шкідливої ​​для життя і здоров'я людей, і навколишнього середовища.

Система сертифікації - це система виконання процедури сертифікації та управління нею за певними правилами. Системи сертифікації можуть діяти на національному, регіональному або міжнародному рівні. Сертифікацію проводять акредитовані в системі сертифікації органи сертифікації продукції, які визначають схему сертифікації і видають за результатами випробування продукції сертифікат відповідності.

Для проведення випробувань продукції залучають акредитовані випробувальні лабораторії (центри), а для перевірки системи якості - органи сертифікації систем якості, акредитовані в системі сертифікації.

Продукція, яка відповідно до законодавства підлягає обов'язковій сертифікації в Україні, повинна вироблятися, ввозитися і реалізовуватися в Україну тільки при наявності сертифіката відповідності.

Сертифікат відповідності - це документ, який підтверджує те, що продукція, система якості та управління якістю, система управління навколишнім середовищем, персонал відповідають вимогам конкретного стандарту чи іншого нормативного документа, визначеного законодавством.

Для контролю якості деяких видів виробленої або ввезеної продукції, крім сертифікації, використовується ще й державна реєстрація. Так, реєстрації підлягають лікарські засоби, вироби медичного призначення, спеціальні харчові продукти, харчові добавки, засоби захисту рослин тощо.

Під час проведення сертифікації здійснюють: випробування продукції, атестацію виробництва чи послуг, перевірку і оцінку системи якості, технічний нагляд. У кожному конкретному випадку склад і послідовність дій при проведенні сертифікації визначаються прийнятою схемою сертифікації.

Відповідно до Декрету Кабінету Міністрів України «Про стандартизацію і сертифікацію» сертифікація продукції може бути обов'язковою і добровільною. Обов'язковій сертифікації підлягає тільки та продукція, на яку поширюються обов'язкові вимоги стандартів або інших нормативних документів, зокрема вимоги, які гарантують безпеку продукції для життя, здоров'я та майна громадян, її суміщення і взаємозамінність, охорону навколишнього середовища. Обов'язкова сертифікація проводиться виключно в Державній системі сертифікації.

За результатами проведення сертифікації заявнику видають сертифікат відповідності, який має затверджену форму, специфічним елементом якої є знак відповідності.

Знак відповідності - це захищений в установленому порядку знак, який свідчить, що маркована їм продукція відповідає конкретному стандарту або іншому нормативному документу.

В Україні функціонує Українська державна система сертифікації продукції (УкрСЕПРО). Система сертифікації УкрСЕПРО проводить обов'язкову і добровільну сертифікацію продукції виробничої сірки, послуг тощо. Загальні вимоги щодо порядку проведення сертифікації продукції в системі УкрСЕПРО, а також технічного нагляду за сертифікованою продукцією визначені в ДСТУ 3413-96 «Порядок проведення сертифікації продукції».

Методи аналізу сировини, що містить сапоніни.

Наявність сапонінів в лікарській рослинній сировині можна встановити за допомогою якісних реакцій, які проводять безпосередньо з сировиною або з витягом з нього.

Якісні реакції на сапоніни засновані на їх фізичних, хімічних і біологічних властивостях. Для проведення якісних реакцій готують водний настій 1:10 при нагріванні на водяній бані. Після охолодження настій фільтрують.

Реакції, засновані на фізичних властивостях. Для проведення реакції на піноутворення беруть дві пробірки, в одну додають 5 мл 0,1 моль / л HCl, в іншу додають 5 мл 0,1 моль / л NaOH і сильно струшують. Якщо утворюється стійка піна в обох пробірках або в пробірці з кислотою - це говорить про кислих тритерпенових сапонінів. Стероїдні сапоніни дають дають багату, стійку піну в лужному середовищі.

Хімічні методи. Відносяться реакції осадження сапонінів і кольорові реакції.

.Із водних розчинів сапоніни осідають гідроксидами барію і магнію, солями міді, ацетатом свинцю. Причому тритерпенові - осідають середнім ацетатом свинцю, а стероїдні - основним.

. З спиртових витягів (або розчинів) стероїдні сапоніни і тритерпенові сапоніни випадають в осад при додаванні 1% спиртового розчину холестерину у вигляді холестерідов.

. Стероїдні сапоніни, так само як і серцеві глікозиди, дають реакцію Лібермана-Бухарда з оцтовим ангідридом і кислотою концентрованої сірчаної - утворюється швидко переходить забарвлення від рожевого до зеленого і синього.

На біологічних властивості сапонінів заснована реакція гемолізу з 2% суспензією еритроцитів у фізіологічному розчині. Кров стає прозорою, яскраво-червоною. Для проведення цієї реакції з рослинної сировини готують настій на фізіологічному розчині.

Державна фармакопея XI видання (вип. 2) рекомендує виконувати якісні реакції для підтвердження автентичності сировини:

Коріння женьшеню.

а) Реакція з порошком кореня женьшеню (на глікозиди). При нанесенні конц. H2SO4 на порошок кореня женьшеню через 1-2 хвилини з'являється цегляно-червоне забарвлення, що переходить у червоно-фіолетове, а потім - у фіолетове.

б) Наявність панаксозидов доводять за допомогою поділу вилучення з кореня женьшеню в тонкому шарі силікагелю і подальшим проявом хроматограми розчином фосфорно-вольфрамової кислоти при нагріванні. Панаксозиди проявляються у вигляді рожевих плям.

Єдиного методу кількісного визначення сапонінів в лікарській рослинній сировині немає.

Найчастіше використовують фізико-хімічні методи:

. Потенціометріческій метод. Метод заснований на визначенні зміни електрорушійної сили (ЕРС) в результаті титрування. Метод використовується для визначення суми гінзенозиів в корінні.

Етапи визначення: - підготовчий; екстракція гінзенозидів метиловим спиртом і їх кислотний гідроліз:

Рисунок 3.8-R1, R2 цукру олеаноловая кислота

- Очищення від супутніх речовин - осадження олеанолової кислоти в результаті зміни розчинника (розбавлення спиртового витягу водою та охолодження);

Розчинення олеанолової кислоти в гарячій суміші метилового та изобутилового спиртів (1:1,5);

Кількісне визначення - титрування розчином їдкого натру (0,1 моль / л) в суміші метилового спирту і бензолу.

Точку еквівалентності визначають потенціометрично.

. Спектрофотометричний метод. Метод заснований на здатності сапонінів і їх забарвлених комплексів поглинати монохроматичне світло при певній довжині хвилі. Метод запропонований для визначення вмісту сапонінів в наступних видах сировини:

а) кореневища з корінням Діоскора ніпонської. Проводять кислотний гідроліз сапонінів з подальшим проведенням реакції вільного агликона (диосгенина) з реактивом (п-диметиламінобензальдегідом). Утворюється забарвлений комплекс,

б) коріння солодки. Проводять осадження глициризинової кислоти концентрованим розчином аміаку. Осад розчиняють і визначають оптичну щільність отриманого розчину.

. Гравіметричний метод - визначення екстрактивних речовин. Метод заснований на визначенні сухого залишку після висушування суми речовин, витягнутих з сировини відповідним екстрагентом. Метод запропонований для оцінки якості сировини женьшеню.

. Раніше для кількісної оцінки сировини використовували визначення гемолітичного індексу і пінного числа.

3.8 Матеріальний баланс

При виробництві гінзенозиду основним технологічним етапом, від якого залежать усі наступні стадії та результат процесу в цілому є ферментація. Саме тому є доцільним розрахувати матеріальний баланс біосинтезу. Співвідношення речовин, затрачених та отриманих у процесі основної ферментації подано у вигляді таблиці (3.3). Розрахунок проводився на 1 кг готової продукції.

Таблиця 3.3 Ї Матеріальний баланс ферментації

Тепловий баланс біореактору

У біореакторі під час процесу життєдіяльности виділяється тепло, при підвищенні температури зростаючої культури її зріст сповільнюється, а потім можлива й загибель. Для запобігання цього біореактори повинні бути обладнані теплознімним пристроями (сорочки, змієвики та ін.). Кількість тепла, відводи мого від зростаючої культури, та витрати охолодженої води визначають з теплового балансу.

Теплові потоки працюючого біореактору показані на рисунку 3.10

Рисунок 3.10. Теплові потоки біореактору

Загальний тепловий баланс процесу ферментації у реакторі можна надати у наступному вигляді:

 (3.1)

Де -тепло біосинтезу;

-тепло від мішалки;

- сумарне тепло, яке приноситься керуючим повітрям та живильним середовищем;

- тепло, яке підводиться (відводиться) через сорочку та ін. пристрої

- акумульоване тепло в системі;

- тепло, яке втрачається під час випарювання;

- тепло, яке відводиться технологічними потоками;

- теплові втрати.

Значеннями ,  та  можна знехтити в порівнянні . Тому, рівняння теплового балансу можна спростити.

 (3.2)

Прихід тепла за 1 годину

. З поживним середовищем

 (3.3)

де - маса живильного середовища, =165 кг;

- питома теплоємність живильного середовища, =4,6кДж/кг∙К;

- температура живильного середовища, =37°С;

=165×4,6×37 = 28083 (кДж)

2. тепло, яке виділяється під час біосинтезу

Де - середня кількість тепла під час зростання культури,

=63×10³ кДж/кг∙год

- приріст біомаси, =0,055 кг/год

=63×10³×0,055 = 3465 (кДж)

3. тепло, яке приноситься разом з охолоджуваною водою

 (3.3)

де - маса охолоджуваної води, =13,1 кг;

- питома теплоємність охолоджуваної води, =4,49 кДж/кг∙К;

- температура води спочатку, = 35°С;

=13,1×4,49×35 = 2058,67 (кДж)

4. тепло, яке приноситься з повітрям

,

де  - витрати повітря;

- ентальпія свіжого повітря

=0,15×1,293×71×4,19×13,2×10^-3 = 0,76 кДж

Витрати тепла за 1 годину

. З готовою культурою

 (3.4)

Де - маса готової продукції =4,3 кг;

- питома теплоємність готової культури, =0,92 кДж/кг∙К;

- температура готової культури, =37°С;

=4,3×0,92×37 = 146,36

. з охолодженою водою

 (3.5)

 =13,1×4,49× (35 - 30) = 294 (кДж)

. з повітрям, яке продувається

,

 =0,15×71×1,293×24×4,19×10^-3 = 1,39 кДж

4. витрати тепла у навколишнє середовище

, (3.6)

Де - коефіцієнт тепловіддачи від ферментера у навколишнє середовище,

- площа ферментера

- різниця температур, ферментер-повітря;

Рівняння теплового балансу ферментеру має вигляд:

 (3.7)

Позначимо праву частину рівняння через Q, тоді витрати охолоджуваної води складає:

Площа поверхні теплопередачі ферментеру

,

= 0,29 м²

3.10 Розрахунок та вибір технологічного обладнання

Для виробництва внутрішній діаметр апаратів приймають 2-3 м. Приймаємо D_вн = 3 м, висоту еліптичної частини h_ел = 0,75, висоту відбортування h=6 мм

Розрахуємо висоту циліндричної частини Н_ц

Повний об'єм ферментера V_п=V_ц + 2V_дн. (3.1)

Об'єм циліндричної частини V_ц=V_п - 2V_дн. (3.2)

Висота циліндричної частини ферментера,

Н_ц = (V_п - 2V_дн)/F,                          (3.3)

де F - площа перетину ферментера за внутрішнім діаметром, м²:

= 0,785 D²_вн

Загальна висота ферментера, м:

Н_заг = Н_ц + 2 (h_ел + h). (3.4)

Об'єм еліптичної частини:

_ел =, (3.5)

де Р₁ - внутрішній тиск в апараті, що не перевищує 0,25 МПа;

з - коефіцієнт міцності шва, з = 0,75-1,0.

До розрахованої висоти апарата додають розміри електродвигуна муфти та редуктора. Висоту культуральної рідини в апараті розраховують за рівнянням:

_роб = Н_к.р×0,785× D²_вн + V_дн, (3.6)

якщо коефіцієнт заповнення 0,6, то V_роб = 5×0,6= 3м³

Н_к.р=

Розрахунок механічної мішалки

При вирощуванні мікроорганізмів на рідких поживних середовища; глибинним способом рекомендується застосовувати турбінні мішалки Діаметр турбінної мішалки розраховують за формулою

_м =(0,3-0,33) D_вн

_м = 0,3×3=0,9

Частота обертання мішалки, хв^-1,

 (3.7)

За одержаною величиною частоти обертання мішалки приймають фактичну швидкість. За прийнятою величиною частоти обертання мішалки за каталогом вибирають редуктор.

Знаючи d_м, за каталогом вибирають мішалку з ефективною системою перемішування. Типи пристроїв для перемішування рідин з різною в'язкістю наведені в табл. 3.4.

Таблиця 3.4 - Оптимальні швидкості обертання пристроїв для перемішування залежно від в'язкості середовища

Розрахунок потужності, що споживається, Вт:

_м = K_Nс_cn³⁵, (3.8)

де K_N - критерій потужності, що залежить від інтенсивності перемішування і характеризується критерієм Рейнольдса (Re_ц);

с_c - густина середовища, кг/м³(1060);

п - число обертів мішалки, хв^-1;

 - діаметр мішалки, м;

Приймаємо K_N =10_м=10×1060×1,07×0,9⁵=6697 Вт

Розрахункова потужність на валу мішалки, кВт:

 (3.9)

де К₁ - коефіцієнт заповнення апарата культурою, що росте;

К₂ - коефіцієнт, який враховує збільшення потужності, що споживається, через підвищення опору культури в процесі її росту (К₂ = 1,1);

 - коефіцієнт, який враховує збільшення потужності, що споживається, на подолання опору від допоміжних пристроїв,

 м

де - висота шару рідини, що перемішується, м.

Якщо в період росту культури утворюється піна, то приймають =0,65 Н_ап,

 (3.10)

де К_п - коефіцієнт опору перегородок, що відбивають рідину (1,5);

К_м - коефіцієнт опору додаткової мішалки (0,3);

К_тр - коефіцієнт опору труби для підведення повітря (0,1);

К_г - коефіцієнт опору гільзи для термометра(1).

Значення К_п, К_м, К_тр К_г, залежно від типу мішалки наведені

Визначення діаметра вала мішалки проводять за формулою, виходячи з міцності його на кручення

, (3.11)

де М_об - момент обертання на валу мішалки, Н × м;

 - коефіцієнт допустимого напруження для матеріалу вала на кручення 7×10⁴ мН/м³;

С_м - поправка на корозію та зношення матеріалу вала.

М_об = 0,163 N_p / n_м,

де N_p - розрахункова потужність на валу;_м - запас міцності вала.

М_об =0,163×3,0297/2,6=0,2 кВт

, (3.12)

Таблиця 3.5 - Значення коефіцієнта  для різних типів мішалок

Кінцеву встановлену потужність N_вст (кВт) привідного електродвигуна мішалки розраховують за формулою

_вст = 1,15 (N_р + N_с)/з

де з - ККД редуктора приводу (0,95)._вст = 1,2×3,0297/0,95=3,83 кВт

За величиною N_вст потужність 5,5 кВт та частота обертання 31 об/хв.

Розрахунок барботера

Робочий об'єм ферментера при коефіцієнті заповнення 0,6 складає 5×0,6=3м³

Кількість повітря для аерації, якщо питомий об'єм витрат повітря 0,017 м³_пов = 0,017×3=0,051 м³

Площа всіх отворів на барботері при швидкості витікання повітря 30 м/с_отв = 0,051/30=0,0017 м²

Якщо діаметр отворів прийняти 5 мм, то його площа складатиме 1,96×10^-5 та кількість отворів на барботері складатиме_отв = 0,0017/1,96×10^-5 = 86,73

При D_вн = 3 м, d_м = 0,9 м діаметр кільця барботера приймаємо 0,9 м, тоді довжина кільця складатиме= 0,9×3,14 =2,83 м, так як l=2рr

Відстань між отворами складатиме

Д l' = 2,83×86,73 = 33 мм

Через складність процесів, що відбуваються в апараті з механічною мішалкою та барботером, розрахунок та проектування промислових ферментаторів мають емпіричний характер.

Приклад ферментера, який використаний в виробництві гензинозиду з механічною мішалкою і барботером (рис. 3.11)       

Рисунок 3.11-Ферментер для культивування рослинних клітин

. Корпус реактора;

. Сорочка;

. Вал мішалки;

.Мішалка;

. Привід мішалки;

. Штуцер для вивантаження продукту. 

4. Економічна ефективність проекту

В даному розділі приведене економічне обґрунтування доцільного використання запропонованої зміни в технології. Проведені всі необхідні розрахунки, які наведені в таблиці 4.1

Таблиця 4.1 - Техніко-економічні показники виробництва

4.1 Розрахунок виробничої потужності проектованого виробництва

Виробнича потужність проектованого цеху (М) визначається по ведучому обладнанню по формулі:

 (4.1)

де А - кількість однотипового обладнання, шт.;

П - максимальна продуктивність одиниці обладнання кг/год

Ф_д - дійсний фонд роботи одиниці обладнання, год/рік

Перевіремо відповідність заданої виробничої програми (В) розрахунковій величині (М). Обов’язкова умова при цьому: М > В. Оптимальне співвідношення цих величин повинно бути наступним:

4.2 Розрахунок поточних витрат

Собівартість одиниці продукції і річні поточні витрати визначаємо укрупнено. Розрахунок потреби в матеріальних ресурсах на запланований обсяг продукції визначається по кожному виду матеріалів у рецептурі і визначається по формулі:

 (4.2)

де P_j - витрати j^го компоненту сировини на 1 кг i^го продукту;_ji - питома норма j^го сировини чи матеріалу на 1 кг i^го продукту;_i - виробництво i^го продукту по проекту, кг/рік.

Розрахунок потреби сировини, матеріалів можна здійснити у виді таблиці 4.2.

Таблиця 4.2 - Потреба в сировині і матеріалах

На підставі розрахованої потреби в матеріальних ресурсах визначається їх вартість, що надалі використаємо для розрахунку собівартості продукції. Вартість сировини і матеріалів наведена у таблиці 4.3

Таблиця 4.3 - Вартість сировини і матеріалів

На підставі отриманих даних, складаємо калькуляцію собівартості продукції, яка наведена у таблиці 4.4

Таблиця 4.4 - Собівартість продукції

4.3 Визначення ціни і обсягу реалізації продукції

) Ціна виробництва розраховується по формулі:

 (4.3)

де  - собівартість одиниці продукції, грн/од;

П_р - прибуток, одержуваний від реалізації одиниці продукції, грн/од;- рівень рентабельності, що задається, визначається розміром прибутку.

) Відпускна ціна продукції включає ціну виробництва і податок на додаткову вартість (20%):

(4.4)

) Обсяг реалізації продукції розраховується по формулі:

(4.5)

де Ц - відпускна ціна одиниці продукції, грн/од;

В - річний випуск продукції, кг.

3926160

4.4 Розрахунок інвестиційних (капітальних) витрат

Під інвестиційними витратами розуміють первісні інвестиції (капітальні вкладення), що забезпечують реалізацію продукту.

При визначенні суми інвестиційних витрат, у першу чергу, необхідно визничити вартість основних фондів проектованого виробництва, що включають вартість обладнання і виробничих будинків і споруджень.

) Розрахунок вартості обладнання

Розрахунок первісної вартості устаткування здійснено у таблиці 4.5

Таблиця 4.5 - Первісна вартість устаткування

Вартість обладнання з урахуванням ПДВ:

(4.6)

2) Розрахунок вартості будинків і споруджень

Вартість будинків і споруджень визначається виходячи зі структури капітальних вкладень хімічної промисловості, у якій вартість устаткування складає 60%, а витрати на будинки і спорудження відповідно - 40% від сумарних капітальних вкладень.

Розрахунок здійснюється по формулі:

 (4.7)

де S_об - вартість устаткування, грн.

У вартість будинку додатково включаються:

) опалення і вентиляція - 7% - 2235,8 грн.

) водопровід і сигналізація -12% - 3832,8 грн

) внутрішнє висвітлення - 5% - 1597 грн

) внутрішні водостоки - 1% - 319,4 грн

) зовнішній благоустрій - 14% - 4471,6 грн

= 12488,5 грн.

) Визначення інвестиційних витрат проводять враховуючи передінвестиційні витрати, витрати на будівельно-монтажні роботи, витрати на обладнання, накладні витрати і витрати на закупівлю пускової партії сировини і матеріалів. Сума витрат наведена у таблиці 4.6

Таблиця 4.6 - Інвестиційні витрати

4.5 Показники ефективності проектованого виробництва

) Розрахунок фондовіддачі виконується по формулі:

 (4.8)

де Ф_від - фондовіддача основних виробничих фондів, грн/грн;

Р` - чистий обсяг продаж, тобто вартість реалізованої продукції без ПДВ, грн;

ОФ - вартість основних фондів, грн.

Чистий обсяг продаж розраховується по формулі:

 (4.9)

де В - річний обсяг випуску продукції, нат. од;

Ц_вир-ва - ціна виробництва одиниці продукції, грн/од.

) Рентабельність продукції розраховується по формулі:

 (4.10)

де Ц_вир-ва, С_од - відповідно ціна виробництва і собівартість виготовлення одиниці продукції, грн/од.

) Строк окупності інвестицій визначається по формулі:

 (4.11)

де К - сума інвестицій витрат, грн;

П_р - прибуток від реалізації річного обсягу продукції, грн/рік

Прибуток від реалізації розраховується по формулі:

 (4.12)

де В - річний обсяг виробництва, нат. од.

Оскільки термін окупності менше 6 років, то інвестиції використовуються ефективно.

) Рентабельність основних фондів розраховується по формулі:

 (4.13)

Таким чином, можна зробити висновок, що запропоновані у дипломній роботі технічні рішення є економічно вигідними. Строк окупності виробництва складає 2 року, що є дуже добрим показником.

Висновок

Для збереження біоценозу женьшеню і задоволення потреби в гінзенозидів необхідно розробляти високоефективні біотехнологічні підходи культивування як самого женьшеню, так і отримання панаксозидів з культури клітин рослин. Підходи, що розроблюються повинні забезпечити високу якість продукту, значний об'єм виробництва, низьку собівартість і доступність за ціною. Актуальність обумовлена ​​прагненням старіючого населення планети використовувати для профілактики хвороб та зміцнення життєвих сил органів нативних, натуральних рослинних компонентів.

В Україні немає власної сировини женьшеня. Спроби культивувати цілу рослину не мали широкого поширення у виробництві. Україна щорічно закуповує різних продуктів з екстрактом женьшеню на 2, 8 млн долларів. Необхідно знайти можливість для забезпечення населення вітчизняною продукцією та збереження золотовалютного резерву.

За базову взята технологія з використанням штам клітин женьшеню R1, з високою продуктивністю гінзенозиду, який вирощують на жидкому середовищі, що забезпечено оптимальні умови культивування, що підтверджено економічними розрахунками.

Контроль виробництва гінзенозиду охоплює всі стадії виробництва і включає наступні етапи:

. Контроль вхідної сировини, матеріалів і напівфабрикатів.

. Контроль процесу основної ферментації.

. Контроль напівпродуктів при виділенні гінзенозиду.

4. Випробування кінцевого продукту виробництва.

Список літератури

1. Надлежащая производственная практика лекарственных средст. Под ред. Н.А. Ляпунова, В.А. Загория, В.П. Георгиевского, Е.П. Безуглой. - К.: Морион, 2011. - 896 с.

2.      Биотехнология. Книга 3: Клеточная инженерия. Под ред. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф., Корженевская Т.Г., Маркарова Е.Н.-К.: «Наука», 2009. - 528 с.

.        Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Бутенко Р.Г-М.: «Мир», 2005. - 225 с.

.        Клеточная инженерия растений. Под ред.: Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Киев, 1984. - 167 с.

.        Тузова Р.В. Молекулярно-генетические механизмы эволюции органического мира. Генетическая и клеточная инженерия / Р.В. Тузова, Н.А. Ковалев; НАН Беларуси, Ин-т экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. - Минск: Беларуская навука, 2010. - 395 с.

.        Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия. науч. ред. Кильчевский А.В., Хотылева Л.В., Генетические основы селекции растений. В 4 т. Т. 3.

.        Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология. Кулаев И.В. Научный мир. 2010.112 с.

.        Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. - Москва: Мир, 1987.

.        Билай В.И. Основы общей микробиологии. - Киев: Высшая школа, 1989.

.        Чуешов В.И., Мандрыка Л.А., Сичкарь А.А. и др. Основы пректирования производств в химико-фармацевтической и биотехнологической промышленности. Учеб. для вузов. - Харьков, 2009. - 460 с.

.        Сидоров Ю.І., Вязло Р.Й., Новіков В.П. Процеси і апарати мікробіологічної промисловості. Технологічні розрахунки. Приклади і задачі. Частина ІІІ. Основи проектування мікробіологічних виробництв. - Львів: Видавництво НУ «Львівська політехніка», 2004. - 252 с.

.        Промышленная микробиология. Учебное пособие для вузов /Под ред. Н.С. Егорова. - М.: Высшая школа, 2009.

.        Биотехнология. Учебное пособие для вузов. В 8 кн. /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. - М.: Высшая школа, 2007.

.        Бекер М.Е. Введение в биотехнологию: Пер. с латыш. (Рига, 1974). - М.: 2002.

.        Биотехнология. Принципы и применение /Под ред. И. Хиггинса. - М.: Мир, 2000.

.        ГНД-09-001-98. Продукція медичної та мікробіологічної промисловості. Регламенти виробництва лікарських засобів. Зміст, порядок розробки, узгодження та затвердження.

.        Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция / АН УССР. Отделение клеточной биологии и генетической инженерии Ин-та ботаники им. Н.Г. Холодного. - Киев: - Наук. думка, 1990. - 280 с. - ISBN 5-12-001807-6

.        Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник. - Изд. 2-е. СПб.: Изд-во

.        Федорова Т.А., Аппалуп М.В. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2006. - №1 (3). - С. 39 - 41

.        Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. // Вестник РАМН. - 2004. - №9. - С. 44-47.

.        Арцимович Н.Г., Корнев А.В., Иванова Т.М., Чугунов А.В. и др. Подходы к иммунодиагностике и лечению синдрома хронической усталости и нейроиммунных расстройств // Иммунология. -1994. - №7. - С. 42-45.

.        Брехман И.И, Грушвицкий И.В. Женьшень как лекарственное растение, - М: Наука, 2007. - 16 с

.        Лупанова И.А. (Николаева И.А.), Минеева М.Ф., Колхир В.К. Подходы к разработке фитопрепаратов на основе тритерпеновых гликозидов как перспективного класса природных соединений // Сборник материалов конгресса - XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 11-15 апреля 2011 г. - М.: ЗАО РИЦ «Человек и лекарство». - 2011. - С. 508.

.        Лупанова И.А. (Николаева И.А.), Минеева М.Ф., Колхир В.К., Мартынов А.М. Тритерпеновые гликозиды - перспективный класс природных соединений для создания новых фитопрепаратов // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - №6. - С. 244-246.

25.    Закон України «Про охорону праці», листопад 2002 р.

26.    ГОСТ 12.0.003 - 74* ССБТ. Опасные и вредные производственные факторы. Классификация. - Введ. 01.01.76.

.        Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности / Н.В. Лазарев - М.: Химия, 1976. - Ч. І. - 336 с.

.        Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности / Н.В. Лазарев - М.: Химия, 1976. - Ч. ІІ. - 400 с.

.        Макаров Г.В. и др. Охрана труда в химической промышленности. - М.: Химия, 1980. - 568 с.

30.    ГОСТ 12.1.005-88 ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны. - Введ. 01.01.89.

31.    Долин П.А. Справочник по технике безопасности / П.А. Долин - М.: Энергоатомиздат, 1984-824 с.

32.    СНиП 2.04.05-91 Нормы проектирования. Отопление, вентиляция и кондиционирование воздуха. - М.: Стройиздат, 1991.

33.    ДБН В.2.5-28-2006. Інженерне обладнання будівель та споруд. Природне і штучне освітлення. - К.: МінбудУкр., 2010.

34.    ГОСТ 12.1.003-83* ССБТ. Шум. Общие требования безопасности. - Введ. 01.01.1989.

.        ПУЭ -87. Правила устройства электроустановок. М.: Энергоатомиздат, 1987.

36.    НАПБ Б.03-002-2007 Норми визначення категорій приміщень, будинків та зовнішніх установок за вибухопожежною та пожежною набезпекою. Наказ МНС №633 від 03.12.2007.

37.    ГОСТ 12.1.004-91 ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования. - Введ. 01. 07. 92.

.        Родионов А.И. Техника защиты окружающей среды / А.И. Родионов, В.Н. Клушин, Н.С. Торочешников - М.: Химия, 1989. - 512 с.

.        Закон України «Про охорону навколишнього середовища» від 25.06.1991

40.    Основи охорони праці: навчальний посібник / За ред. В.В. Березуцького. - Х.: Факт, 2009. - 480 с.

41.    СНиП II-4-79. Естественное и искусственное освещение. Нормы проектирования. - М.: Стройиздат, 1980. - 110 с.