Методы анализа гликолипидов (цереброзиды и сульфатиды). Особенности выделения и определения

Методы анализа гликолипидов (цереброзиды и сульфатиды). Особенности выделения и определения

Санкт-Петербургский Государственный Университет,

Биолого-почвенный факультет, кафедра биохимии, 2012.

Доклад для семинара по биохимии липидов

На тему: Методы анализа гликолипидов (цереброзиды и сульфатиды). Особенности выделения и определения.

1. Актуальность темы

Гликолипиды - это сложные липиды, содержащие углеводные остатки. Основой большинства гликолипидов является сфингозин - высший ненасыщенный алифатический аминоспирт с двумя гидроксильными группами.

Основным углеводом является галактоза, но также возможно присутствие глюкозы и др., Гликолипиды могут быть нейтральными: моногексозилцерамиды (цереброзиды) и олигогексозилцерамиды. Среди кислых гликолипидов выделяют: ганглиозиды, содержащие углевод N-ацетилнейраминовую кислоту, и сульфатиды, несущие сульфатную группу.

Речь пойдет о гликолипидах животного происхождения.

Обширные исследования кожных липидов показали, что липиды рогового слоя богаты гликолипидами и сфинголипидами. Структура гликолипидов подвергается значительным изменениям в ходе клеточного роста, дифференцировки клетки, и в частности, при переходе клетки из нормального состояния в опухолевое. В связи с чем проявляется большой интерес к роли и диагностической значимости гликолипидов в различных заболеваниях.

Цереброзиды и сульфатиды являются важнейшими компонентами миелина, выполняющими как структурную, так и функциональную роль. В головном мозгу новорожденных эти гликолипиды присутствуют в незначительном количестве, и накопление их происходит в постэмбриональный период в ходе миелинизации. Метаболизм гликолипидов в ранний период формирования нервной системы ещё мало изучен. Исследование цереброзидов и сульфатидов представляет особый интерес в связи с тем, что нарушение в их метаболизме приводят к серьезным последствиям - к развитию демиелинизирующих заболеваний (рассеянный склероз, фенилкетонурия, энцефаломиелиты и др.). Углубленное изучение данных гликолипидов, как при изменении функционального состояния организма, так и при моделировании демиелинизирующих заболеваний на животных позволит приблизиться к выяснению функциональной роли цереброзидов и сульфатидов.

Говоря о ганглиозидах, надо сказать, что они локализованы в нейрональных мембранах: соматических, аксональных, дендритных, синаптических - в самых возбудимых элементах, принимающих непосредственное участие в передаче нервного импульса. Ганглиозиды являются соединениями исключительной функциональной значимости: несомненна их роль в транспорте ионов через мембраны, в рецепции нейромедиаторов, вирусов, токсинов, и, возможно, гормонов. Являясь обязательными компонентами экстраклеточного матрикса, ганглиозиды во многом определяют клеточные контакты и межклеточные взаимодействия. Доказано, что при изменении числа и структуры поверхностных ганглиозидов происходит нарушение межнейронального узнавания. Вопрос о роли индивидуальных ганглиозидов в функциональной активности мозга ещё далек от разрешения, поэтому уделяется большое внимание методам их изучения.

2. Выделение цереброзидов и сульфатидов головного мозга

Выделение гликолипидов состоит из трёх основных этапов: получение общих липидов из ткани по методу Фолча, извлечение ганглиозидов из общего липидного экстракта и собственно выделение цереброзидов и сульфатидов по методу Азмена.

Метод Фолча:

Принцип метода: общие липиды экстрагируют из тканей смесью хлороформа и метанола, экстракт отмывают от нелипидных примесей водой или слабыми солевыми растворами и высушивают.

Ход выделения:

Берут различные навески ткани, для мозга, как правило, достаточно 200-250мг.

Ткань промывают физиологическим раствором, высушивают на фильтровальной бумаге, удаляют из неё крупные кровеносные сосуды.

Ткань заливают смесью хлороформ - метанол (2:1) и гомогенизируют.

Гомогенат разбавляют смесью хлороформ - метанол (2:1) до получения разведения ткани 1:20. Во избежание окисления липидов в пробы добавляют антиоксидант. Гомогенат перемешивают и фильтруют через обезжиренный фильтр.

Затем производят промывку экстракта от нелипидных примесей (сахаров, аминокислот, солей), извлекаемых из тканей спиртовым компонентом хлороформно-метаноловой смеси. Промывку можно осуществлять дистиллированной водой, при этом объем воды должен составлять 20% от объема экстракта липидов. В этом случае не образуется промежуточного слоя между хлороформной и водно-метаноловой фазами, что позволяет полностью удалить верхнюю фазу. Однако, при промывке водой происходит потеря липидного материала, главным образов, кислых липидов (0,3 - 0,6% от общего содержания липидов). Поэтому авторы метода вместо воды предложили использовать слабые растворы минеральных солей (KCl, CaCl2, NaCl). Уменьшение потерь липидов при использовании солей связано, видимо, с тем, что кислые липиды экстрагируются из тканей в виде солей калия, кальция, натрия и присутствуют в верхней фазе в диссоциированной форме. Следует отметить, что применение солевых растворов для промывки значительно снижает, но не устраняет потерю липидов полностью.

Промывку осуществляют следующим образом. К отфильтрованному экстракту липидов прибавляют водный раствор соли в объеме равном 0,2 от объема липидного экстракта. Пробы перемешивают и подвергают расслоению либо путем отстаивания, либо путем центрифугирования. Таким образом, система разделяется на две фазы. Верхнюю фазу, содержащую полярные вещества, удаляют, а внутренние стенки пробирки и поверхность нижней фазы ополаскивают смесью хлороформ - метанол - водный раствор соли. Промывке подвергается только поверхность нижней фазы, поэтому во избежание потерь липидов нельзя допускать перемешивания нижней фазы с промывной смесью.

Далее к хлороформной смеси липидов добавляют немного метанола и либо проводят высушивание в термостате, либо удаляют растворитель с помощью вакуумного роторного испарителя.

Выделение цереброзидов и сульфатидов:

Липидный экстракт фильтруют и смесью хлороформа и метанола доводят до необходимого объема. Из общего липидного экстракта проводят извлечение ганглиозидов.

Нижний хлороформный слой, не содержащий ганглиозидов, доводят метанолом до необходимого объема (20мл смеси на 1г ткани) и используют для выделения суммарных цереброзидов и сульфатидов по методу Азмена.

Выделения суммарных цереброзидов и сульфатидов по методу Азмена.

Принцип метода: выделение осадка цереброзидов и сульфатидов по методу Азмена основано на их способности образовывать плотный белый слой на границе хлороформного и водного слоев при обработке хлороформно-метанолового экстракта липидов трихлоруксусной кислотой (ТХУ, CCl3СООН) и водой.

Ход выделения:

Хлороформно-метаноловый экстракт липидов, освобожденный от ганглиозидов и водорастворимых примесей, охлаждают в бане со льдом до 2-3◦С. Затем добавляют 4%-ную ТХУ. Смесь оставляют на 2 часа, периодически встряхивая, после чего проводят её центрифугирование (15-20 мин при 3000 об/мин) до полного разделения жидкости на 2 слоя.

Верхний слой удаляют, а к нижнему добавляют равный объем дист. воды. Смесь встряхивают, выдерживают 1ч в бане со льдом, а затем центрифугируют (30 мин при 3000 об/мин). В результате образуется 3х-фазная система: верхний водный слой, плёнка цереброзидов и сульфатидов и нижний слой.

Не разрушая гликолипидной плёнки, осторожно удаляют верхний и нижний слои. Полученные гликолипиды эмульгируют в 5-6 мл воды, переносят в целлофановый мешочек и подвергают диализу против дист. воды в течение 2х суток при 2-3◦С, неоднократно меняя воду в диализаторе.

После диализа содержимое мешочка переносят в пробирку и центрифугируют в течение 15 мин. Полученный осадок растворяют в 2 мл смеси хлороформ - метанол (1:1).

Затем проводят очистку осадка цереброзидов и сульфатидов от фосфолипидов путем выпаривания при 60◦С. Цереброзиды и сульфатиды образуют на стенках пробирки плёнку, которую соскабливают стеклянной палочкой. Далее проводят 2-кратную экстракцию суммарных цереброзидов и сульфатидов кипящим ацетоном.

Суммарные цереброзиды и сульфатиды, растворенные в горячем ацетоне, фильтруют в пробирки, закрывают пробками и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший за ночь осадок очищенных Ц и С отделяют центрифугированием, растворяют в 1 мл смеси хлороформ - этанол (1:1) и испльзуют для дальнейших исследований.

Описанный метод выделения позволяет выделить из головного мозга одного взрослого животного 1-1,5 мг суммарных цереброзидов и сульфатидов, что достаточно для разделения их методом ТСХ, количественной оценки полученных фракций и определения удельной радиоактивности.

3. Методы определения цереброзидов и сульфатидов.

.1 Разделение цереброзидов и сульфатидов методом ТСХ

Использование методов колоночной и тонкослойной хроматографии позволило установить гетерогенность цереброзидов и сульфатидов - наличие отдельных фракций, отличающихся главным образом по составу ЖК, причем весьма разнообразных. Углеводный состав цереброзидов и сульфатидов представлен, чаще всего, галактозой, однако не всегда. Так, в головном мозгу новорожденных животных наряду галактоцереброзидами присутствуют глюкоцереброзиды, содержание которых у взрослых животных крайне низкое. В других же тканях могут быть как галакто-, так и глюкоцереброзиды, в крови же преобладают глюкоцереброзиды.

ТСХ хроматография имеет ряд преимуществ по сравнению с жидкостной хроматогрфией:

) Проста и удобна, возможно использование готовых пластинок

) Недорогое оборудование, которое может быть установлено в каждой лаборатории

) ТСХ проверена во многих областях, в том числе в фармакологии. Позволяет легко проводить количественное определение

) В ТСХ отсутствует «эффект памяти» в том случае, если каждый раз используется новая неподвижная фаза. В то время как при ЖХ остаточный эффект от прошлого прогона не может быть полностью исключен

) ТСХ нуждается в гораздо меньшем количестве растворителей, чем ВЭЖХ

) После разделения путем ТСХ липиды можно легко визуализировать с помощью красителей, которые специфически связываются с различными функциональными группами. Работать с постколоночными производными сложнее.

Разделенные с помощью ТСХ липиды могут быть визуализированы с помощью различных красителей, которые можно разделить на три группы:

Недеструктивные и неспецифичные. Пары йода, дихлорфлуоресцин, родамин. Однако полностью насыщенные липиды плохо прокрашиваются, в то время как из сильно ненасыщенных йод выводится не до конца. Деструктивные и неспецифичные. Обработка пластинок после ТСХ едкими веществами и прожигание пластинки до проявления липидов. Часто используют 5-%-ную серную кислоту в растворе воды или метанола, а затем в течение часа прогревают при температуре 120◦С. Хотя механизмы и непонятны, известно, что насыщенные и ненасыщенные липиды требуют разного времени для полного обугливания. Интенсивность таких черных пятен может подлежать количественному учету. Деструктивные, специфичные. Селективно реагируют с определенной частью липидов с образованием окрашенных продуктов. Далее приведу некоторые реагенты, используемые для определения гликолипидов:

Гликолипиды:

) орцинол в серной кислоте. Сине-фиолетовые пятна на белом фоне

) 5-гидрокси-1-тетралон в 80% серной кислоте. Гликолипиды дают желтые пятна, легко отличимые от светло-голубых пятен фосфолипидов

Ганглиозиды:

Резорцин, HCl. Только ганглиозиды проявляются сине-фиолетовыми пятнами, в то время как остальные гликолипиды - желтые.

Сфинголипиды:

Гипохлорит натрия NaClO/бензидин. Все липиды, несущие вторичную аминогруппу

Также можно использовать моноклональные антитела к гликолипидам, этот метод значительно упрощает специфическое определение отдельных компонентов на хроматогрфической пластинке и может быть совмещен с масс-спектрометрическим определением.

Основные принципы метода ТСХ. Разделение суммарных цереброзидов и сульфатидов, выделенных из общих липидов, проводят с помощью различных систем растворителей. После хроматографического разделения липидов пластинки вынимают из хроматографической камеры, высушивают и проявляют парами йода. После улетучивания йода отдельные фракции элюируют. Для элюирования используют ту же систему растворителей, что и для хроматографического разделения. Элюаты упаривают и проводят их количественное определение.

Оптимальную смесь растворителей выбираем в зависимости от конкретной группы гликолипидов, которую мы хотим исследовать. Слабополярные гликосфинголипиды лучше растворять в слабополярных растворителях, сильнополярные гликосфинголипиды - в сильнополярных. Полярность смеси растворителей варьируется за счет изменения соотношения полярных и неполярных веществ в ней (так, уменьшая долю хлороформа в смеси, мы увеличиваем её полярность).

Так, например, в результате хроматографии с использованием системы хлороформ - метанол - вода (60:35:8) происходит разделение на 5 фракций, где первые две фракции являются сульфатидами, а 3,4 и 5-я фракции представляют цереброзиды.

Для выделения именно сульфатидов хорошо подходят системы хлороформ- метанол - ацетон -уксусная кислота - вода (46:15: :1714:8) и хлороформ - метанол - уксусная кислота (65:25:10) и др.

Совсем недавно были получены потрясающие результаты высоко эффективной ТСХ с разделением 9ти различных сульфатидов, при этом использовались пластинки из силикагеля и 2 системы растворителей: хлороформ - метанол - 0,2% CaCl2 (55:45:10) на первой стадии и хлороформ - метанол - ацетон - уксусная кислота - вода (5:2:4:2:1) на второй стадии.

Хроматографическое разделение общей фракции липидов, выделенной методом Фолча и освобожденной от ганглиозидов, проводят в системе растворителей хлороформ - метанол - конц.NH3 (80:20:0,4). В результате так же происходит отделение сульфатидов от цереброзидов.

Разделение цереброзидов на галакто- и глюкоцереброзиды методом ТСХ

Разделение цереброзидов на галакто- и глюкоцереброзиды основано на различной способности галактозы и глюкозы образовывать боратные комплексы, обладающие различной хроматографической подвижностью. Исползуется 1%-ный раствор Na2B4O7 и систему растворителей хлороформ - метанол - вода - 15М NH4OH. Так, общие цереброзиды, выделенные из головного мозга новорожденных и 10-дневных крыс, разделяются на 2 фракции галактоцереброзидов и одну фракцию глюкоцереброзидов.

3.2 ТСХ, совмещенная с масс-спектрометрометрией

Конечно, можно было бы совместить с масс-спектрометром следующим образом: после проведенной ТСХ элюировать с пластинки силикагеля пятно интереса и затем подвергнуть масс-спектрометрии. Выполнять такую работу слишком утомительно и времязатратно. Методы электро-спрея и MALDI позволили решить эту проблему. На MALDI остановимся чуть более подробно. Этот метод имеет ряд преимуществ.

Во-первых, нет необходимости элюировать образцы с хроматографической пластинки перед МС-анализом. Это очень удобно и позволяет избежать потери липидов в процессе выделения.

Во-вторых, такая методика позволяет проводить определение очень быстро, а значит минимизировать такие модификации исследуемого материала, как окисление.

В-третьих, этот метод обладает гораздо большей разрешающей способностью в сравнении с визуализацией на хроматографической пластинке, потому что разрешающая способность определяется размером лазерного пятна, которое обычно порядка 50нм. Это означает, что с одного пятна на хроматографической пластинке размером 1мм мы можем получить 20 различных масс-спектров. Это позволяет разделить такие компоненты, которые никогда не могли бы быть разделены методом общего окрашивания.вызывает ионизацию и перевод образца из конденсированной фазы в газовую посредством лазерного возбуждения и индивидуализации молекул образца из матрицы (рис. 1.14). В MALDI анализе аналит сначала сокристаллизуется с большим молярным избытком матричного соединения, обычно УФ-поглощающей слабой органической кислотой. Облучение такой смеси аналита с матрицей лазером приводит к испарению матрицы, которая несёт аналит в себе. Матрица играет ключевую роль в этом методе. Сокристаллизованные молекулы образца также испаряются, но без прямого поглощения энергии лазера.

В большинстве случаев при изучении гликолипидов используют УФ-лазеры, хотя есть примеры, когда использовались и ИК-лазеры. Ик-лазеры имеют 2 преимущества. Во-первых, в качестве матрицы можно использовать глицерол, а т.к. это жидкость, то не возникает проблем с необднородной ко-кристаллизацией матрицы и анализируемого вещества. Во-вторых, ИК-излучение глубже проникает в образец

Вместе с MALDI можно применять антитела, как прямой метод идентификации гликолипидов. Используя антитела вместе с техникой ТСХ - ИК-MALDI-MS можно достигнуть предела чувствительности менее 1нг. Это позволяет напрямую использовать неочищенные липидные экстракты, без сложной процедуры предварительного выделения гликолипидов.

3.3 Количественное определение отдельных фракций цереброзидов и сульфатидов по углеводному компоненту

Для количественного определения выделенных, очищенных цереброзидов может быть использован метод Радина. Этот метод основан на реакции растворенных в H3PO4 цереброзидов и сульфатидов с антроном - полициклическим соединением.

При этом развивается сине-зеленая окраска, интенсивность которой пропорциональна количеству галактозы в цереброзидах. Однако антроновая реакция чувствительна к загрязнениям и не может применяться для количественного анализа гликолипидов, полученных в результате ТСХ.

Более подходящий вариант количественной оценки отдельных фракций цереброзидов и сульфатидов по углеводному компоненту оказалось сочетание двух методов: Радина и Свеннерхольма. По методу Радина осадок гликолипидов расвторяют в 85%-ной H3PO4, далее по методу Свеннерхольма пробы охлаждают и добавляют орциновый реактив. После перемешивания и выдерживания проб на водяной бане при 80◦С в течение 20мин в пробах развивается красная окраска, интенсивность которой пропорциональна количеству углеводов. Потом пробы фотометрируют. Для определения галактоцереброзидов калибровочную кривую строят по стандартному раствору галактозы, а для определения глюкоцереброзидов соответственно по раствору глюкозы.

Метод удобен тем, что не требует предварительного гидролиза

3.4 Количественное определение сульфатидов по сульфатной группе

Метод Кина - быстрый и чувствительный метод, не требующий предварительного отщепления сульфатной группировки. Основе метода лежит способность сульфатидов образовывать окрашенные комплексы с некоторыми красителями. Раньше применяли метиленовую синь, позже перешли на азур и др. Поглощение окрашенной смеси липидов измеряют на спектрофотометре при длине волны характерной для данного красителя.

3.5 Определение количества сульфатидов в составе общей фракции цереброзидов по сульфатной группе

Количественное определение сульфатидов возможно и без их предварительного выделения, прямо из суммарной цереброзидной фракции или даже общих липидов. Такое определение основано на предварительном гидролизе липидного экстракта. Гидролиз проводят в соляной кислоте (22,7%). Принцип метода заключается в том, что высвобождающийся при гидролизе ион SO42- взаимодействует с BaCl2 c образованием осадка BaSO4. На спектрофотометре измеряют поглощение в УФ области, калибровочную кривую строят по стандартному раствору K2SO4

3.6 Определение удельной радиоактивности отдельных фракций цереброзидов и сульфатидов головного мозга

С помощью метода радиоактивной индикации можно изучать метаболизм пластических и энергетических веществ. Животному в кровь вводят меченные радиоактивные 14С-соединения. Регистрацию изотопов проводят сцинтилляционным методом, который основан на преобразовании энергии первичных заряженных частиц в энергию электромагнитного излучения. Преобразование энергии осуществляется с помощью сцинтиллятора: жидкого для β-частиц и кристаллического для γ-излучения. Поглощая энергию заряженных частиц, сцинтиллятор излучает фотоны, регистрируемые с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Фотоны попадают на фотокатод ФЭУ, где происходит выбивание фотоэлектронов, энергия которых преобразуется в электрические импульсы. Электрические импульсы характеризуются числом импульсов, пропорциональным радиоактивности, а также амплитудой, пропорциональной энергии заряженной частицы. Таким образом, число импульсов пропорционально радиоактивности образца, а их амплитуда - энергии β-частиц.

При исследовании интенсивности обмена фракций цереброзидов и сульфатидов сцинтилляционным методом в качестве радиоактивного предшественника используют 14С-ацетат при экспозиции 1ч или 14С-глюкозу с радиоактивной экспозицией 2ч. К осадку выделенных фракций добавляют сцинтилляционный раствор и измеряют радиоактивность на сцинтилляционной установке. Удельную Радиоактивность гликолипидов (имп/мин на 1мг) рассчитывают по формуле

УР = (А1-А2)/m,

где А1 - радиоактивность осадка цереброзидов или сульфатидов, А2 - радиоактивность фона, имп/мин; m - количество гликолипидов в осадке, мг.

3.7 Определение содержания и удельной радиоактивности сфингозиновых оснований цереброзидов и ганглиозидов мозга

Сфингозиновые основания являются обязательными структурными компонентами церамидной части молекулы гликосфинголипидов: ганглиозидов, цереброзидов и сульфатидов. В настоящее время идентифицированы различные сфингозиновые основания, отличающиеся друг от друга числом углеродных атомов и гидроксильных групп, положение двойной связи, наличием или отсутствием боковых разветвлений в цепи. Церамидной части молекулы сфинголипидов отводится структурно-каркасная роль в функционировании мембран. В пользу этого свидетельствуют данные о низкой метаболической активности сфингозиновых оснований в молекуле сфинголипидов, полученные методом радиоактивной индикации. Так, на долю сфингозиновых оснований и жирных кислот ганглиозидов мозга при введении радиоактивного ацетата приходится лишь незначительная часть общей радиоактивности всей молекулы независимо от возраста животного, что служит показателем стабильности церамида сфинголипидов.

Принцип метода, реактивы и ход определения удельной радиоактивности(УР) сфингозиновых оснований такие же, как и для отдельных фракций цереброзидов и сульфатидов. Удельную Радиоактивность (имп/мин на 1мг) рассчитывают по формуле

УР = (А1-А2)/m,

где А1 - радиоактивность осадка сфингозина, А2 - радиоактивность контроля, имп/мин; m - количество сфингозина в осадке, мг.

Количественное определение сфингозиновых оснований также может быть рекомендовано для идентификации отдельных типов ганглиозидов. Так, например, отношение N-ацетилнейраминовая кислота(мкмоль)/сфингозин (мкмоль) может быть использовано при отнесении индивидуальных ганглиозидов к моно-, ди- или трисиалоганглиозидам.

Необходимым условием количественного определения сфингозиновых оснований является предварительный гидролиз сфинголипидов.

Количественное определение гомологов сфингозина, получаемых после гидролиза сфинголипидов проводят колориметрическим методом. Сфингозин реагирует с метилоренжем с образованием окрашенного комплекса, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации сфингозина.

Ход определения: осадок сфингозиновых оснований растворяют в в 1мл этанола, к раствору добавляют 5мл этилацетата, 5 мл 0,01М ацетатного буфера (pH=3,65), 0,1мл метилоранжа. Смесь встряхивают, при этом образуется два слоя: верхний, этилацетатный, содержащий окрашенный комплекс сфингозина и метиолранжа, желтого цвета, и нижний, водный, ярко-красный. Этилацетатный слой собирают и фотометрируют. Количество сфингозина определяют по калибровочной кривой, которую строят по стандартному раствору сфингозина, полученного методом периодатного окисления из цереброзидов мозга.

мозг цереброзид сульфатид сфингозин

3.8 Препаративное получение сфингозина методом периодатного окисления

При построении калибровочной кривой для количественного определения сфингозиновых оснований колориметрическим методом необходимо иметь стандартный препарат сфингозина. Для получения сфингозина используют кристаллические цереброзиды, выделенные из липидного экстракта головного мозга по методу Азмена. Из цереброзидов сфингозин выделяют методом периодатного окисления.

Так, цереброзиды мозга подвергают периодатному окислению (HIO4), при котором происходит расщепление глюкозидного кольца с образованием промежуточного диальдегида, который далее восстанавливается боргидратом натрия(NaBH4) до полиола.

Потом с помощью кислотного гидролиза (HCl) получаем церамид, а из него путем щелочного гидролиза(KOH) - сфингозиsн.

Полученный сфингозин подвергают хроматографическому разделению в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ - метанол - аммиак (40:10:1), в этой системе разделяются стереоизомеры сфингозина, сфинганин и 3-О-метиловый эфир сфингозина. Хроматограмму проявляют раствором нингидрина в бутаноле.