Биосинтез 2Н-меченого инозина высокого уровня дейтерированности
Биосинтез 2h-меченого
инозина высокого уровня дейтерированности
О. В. МОСИН*
*Московская
государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова,
117571 Москва, просп. Вернадского, 86.
Осуществлен биосинтез 2Н-меченого пуринового рибонуклеозида
инозина (выход 3.9 г c 1 л ростовой среды) с использованием адаптированного к
дейтерию штамма Bacillus subtilis в тяжеловодородной среде высокого
уровня дейтерированности (89-90 ат.% 2Н) с 2% гидролизатом биомассы
метилотрофной бактерии Brevibacterium methylicum как источника 2Н-меченых
ростовых субстратов (условия синтеза: синтетическая среда М9 с 98% 2Н2О
и 2% [U-2H]метанолом, инкубационный период 5-6 сут при 370С).
Исследование уровня дейтерированности биосинтетического инозина методом
масс-спектрометрии FAB выявило полиморфизм включения дейтерия в молекулу
(изотопный состав инозина: 4 ат. 2Н, 20%; 5 ат. 2Н, 38%;
6 ат. 2Н, 28%; 7 ат. 2Н, 14%) с включением дейтерия в
рибозный и гипоксантиновый фрагменты молекулы.
Ключевые
слова: Bacillus subtillis; 2Н-меченый инозин; биосинтез;
масс-спектрометрия FAB.
ВВЕДЕНИЕ
В
настоящее время во всем мире растет интерес к получению природных биологически
активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами (2Н, 13С,
15N, 18О и др), которые необходимы для многочисленных
биохимических и диагностических целей [1], структурно-функциональных
исследований [2], а также для изучения клеточного метаболизма [3]. Тенденции к
предпочтительному использованию стабильных изотопов по сравнению с
радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и
возможностью определения локализации метки в молекуле спектроскопией 1Н
ЯМР [4, 5], ИК- и лазерной спектроскопией [6], а также масс-спектрометрией [7].
Развитие технической и компъютерной оснащенности аналитических методов
позволило существенно повысить эффективность проведения биологических
исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия БАС
на молекулярном уровне [8]. Большое научно-прикладное значение в этом аспекте
имеют соединения нуклеиновой природы, содержащие дейтериевую метку в углеродном
скелете молекулы [9]. В частности, 2Н-меченые рибонуклеозиды в
ближайшем будущем смогут найти применение в матричных синтезах молекул дейтерированных
РНК для изучения их пространственной структуры и конформационных изменений
[10].
Важным
моментом в исследованиях с применением изотопно меченых БАС является их
доступность. Дейтериймеченые БАС могут быть синтезированы с использованием
химических, ферментативных и биосинтетических методов [11, 12]. Однако
химические синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов ценных
реагентов и меченых субстратов и приводят к конечному продукту, представляющему
собой рацемическую смесь D- и L-форм, для разделения которых
требуются специальные методы [13]. Более тонкие синтезы меченых БАС связаны с
комбинацией химических [14] и ферментативных подходов [15, 16]. Стратегия
синтеза изотопно-меченых БАС более подробно освещена в работе ЛеМастера [17].
Для многих
научно-практических целей биотехнология предлагает альтернативный химическому
синтезу биосинтетический метод получения дейтериймеченых БАС, который приводит
к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению дейтерия в
молекулы и к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений [18].
Традиционным подходом при этом остается предложенный Креспи метод выращивания
штаммов-продуцентов в средах с максимальными концентрациями дейтерия [19].
Однако основным препятствием является недостаток 2Н-меченых ростовых
субстратов с высоким уровнем дейтерированности. Прежде всего это связано с
ограниченной доступностью и дороговизной самого высокоочищенного дейтерия,
выделяемого из природных источников. Природная распространенность дейтерия составляет
лишь 0.015% (относительно общего количества элемента), однако несмотря на
невысокое содержание дейтерия в пробах разработанные в последние годы методы
обогащения и очистки позволяют получать 2Н-меченые субстраты
высокого уровня изотопной чистоты [20].
Начиная с первых
экспериментов Даболла и Кокса по выращиванию природных объектов в тяжелой воде,
разрабатываются подходы с использованием гидролизатов 2Н-меченой
биомассы как ростовых субстратов для синтеза штаммов-продуцентов БАС [21, 22].
Однако эксперименты обнаружили бактериостатический эффект 2Н2О,
заключающийся в ингибировании жизненно-важных функций клетки, оказываемой 40% 2Н2О
на растительные клетки [23] и 80-90% 2Н2О на клетки
простейших и бактерий [24]. Попытки использовать для синтеза в 2Н2О
природных объектов различной таксономической принадлежности, включая бактерии,
микроводоросли [25] и дрожжи [26] предпринимались в течение длительного
времени. Однако широкого распространения в биотехнологии они не получили ввиду
трудности синтеза, использования сложных комплексных ростовых сред, сложности
технологической схемы синтеза и т. п. Поэтому целый ряд практических вопросов
биосинтеза 2Н-меченых БАС в 2Н2О остается не
выясненным.
Более
перспективны схемы синтеза с использованием в качестве 2Н-меченых
ростовых субстратов биомассы метилотрофных бактерий, ассимилирующих метанол по
рибулозо-5-монофосфатному (РМФ) и сериновому пути фиксации углерода, интерес к
которым возрастает благодаря интенсивному развитию технологии химического
синтеза метанола [27, 28]. Уровень ассимиляции биомассы метилотрофов клетками
простейших организмов и эукариот составляет 85-98%, а их производительность,
измеренная по уровню биоконверсии метанола в клеточные компоненты, достигает
50% [29]. Как было показано нами раннее, метилотрофные бактерии очень
неприхотливые объекты, растут на минимальных средах с 2-4% метанолом, в которых
другие контаминантные бактерии не размножаются и достаточно легко адаптируются
к максимальным концентрациям 2Н2О, что существенно для
синтеза 2Н-меченых БАС [30, 31]. Большой научно-практический интерес
к использованию дейтерированной метилотрофной биомассы для синтеза продуцентов
рибонуклеозидов определил цель настоящей работы, связанной с изучением
принципиальной возможности биосинтеза 2Н-меченого инозина штаммом Bacillus
subtilis за счет использования гидролизата факультативных метилотрофных
бактерий Brevibacterium methylicum.
Таблица 1. Изотопный состав ростовых сред и биосинтетические
характеристики B. methylicum
Номер опыта
|
Компоненты среды, об.%
H2O
2H2O Метанол [U-2H]
Метанол
|
Лаг-период,
ч
|
Выход
микробной биомассы, % от контроля
|
Время
генерации, ч
|
1
|
98
|
0
|
2
|
0
|
20
|
100
|
2.2
|
2
|
98
|
0
|
0
|
2
|
30
|
92.3
|
2.4
|
3
|
73.5
|
24.5
|
2
|
0
|
32
|
90.6
|
2.4
|
4
|
73.5
|
24.5
|
0
|
2
|
34
|
85.9
|
2.6
|
5
|
49.0
|
49.0
|
2
|
0
|
40
|
70.1
|
3.0
|
6
|
49.0
|
49.0
|
0
|
2
|
44
|
60.5
|
3.2
|
7
|
24.5
|
2
|
0
|
45
|
56.4
|
3.5
|
8
|
24.5
|
73.5
|
0
|
2
|
49
|
47.2
|
3.8
|
9
|
0
|
98.0
|
2
|
0
|
58
|
32.9
|
4.4
|
10
|
0
|
98.0
|
0
|
2
|
60
|
30.1
|
4.9
|
10’
|
0
|
98.0
|
0
|
2
|
40
|
87.0
|
2.8
|
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Для синтеза 2Н-меченого
инозина использовали мутантный штамм грамположительных бактерий Bacillus
subtilis (предварительно адаптированный к дейтерию скринингом до отдельных
колоний), который из-за нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза
пуриновых рибонуклеозидов синтезирует в стандартных условиях выращивания
(дрожжевая среда, поздний экспоненциальный рост, 32-340С) 17 г
инозина на 1 л культуральной жидкости (КЖ) [32]. Максимальный выход инозина
достигался при использовании природной протонированной среды, содержащей в
качестве в качестве источников ростовых факторов и аминного азота 2% БВК
дрожжей, а в качестве источника углерода и энергии глюкозу (не менее 12 мас.%).
При проведении синтеза требовалось заменить протонированные ростовые субстраты
их дейтерированными аналогами, а также использовать 2Н2О
высокого уровня изотопной чистоты. Для решения поставленной задачи использовали
адаптированный к дейтерию штамм факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium
methylicum с 50% уровнем биоконверсии метанола (при эффективности конверсии
15.5-17.3 г сух. биомассы на 1 г
потребленного субстрата) [33]. Проведение адаптации для B. methylicum
определялось необходимостью улучшить ростовые характеристики штамма в
максимально дейтерированной среде, поэтому использовали
ступенчато-увеличивающийся градиент концентрации 2Н2О в
ростовых средах в присутствии 2% метанола (табл. 1). Для изучения влияния
уровня дейтерированности источника углерода на ростовые параметры штамма в
опытах (1, 3, 5, 7 и 9) использовали протонированный метанол, а в опытах (2, 4,
6, 8 и 10) [U-2Н]метанол. Согласно полученным данным замена
протонированного метанола его дейтерированным аналогом в условиях одинаковой
концентрации 2Н2О в среде приводила к небольшим
уменьшениям ростовых характеристик штамма (табл. 1, опыты 2, 4, 6, 8 и 10).
Поэтому в дальнейших опытах использовали среды с 2Н2О и
[U-2Н]метанолом. На контрольной протонированной среде (1) с водой и
метанолом продолжительность лаг-периода и времени клеточной генерации B.
methylicum составили 20 и 2.2 ч, а выход микробной биомассы 200 г с 1 л КЖ
(табл. 1, опыт 1). В промежуточных опытах (2-10) биосинтетические параметры
изменялись пропорционально концентрации 2Н2О. Найденная
закономерность заключалась в увеличении продолжительности лаг-периода и времени
клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы с фиксированием
самых низких значений этих параметров в максимально дейтерированной среде с
98% 2Н2О и 2% [U-2H]метанолом (табл. 1, опыт
10). За ходом адаптации, условия которой показаны в опыте 10’ (табл. 1)
наблюдали, снимая динамики роста исходного (б) и адаптированного к
дейтерию (в) штамма в максимально дейтерированной среде М9 (рис. 1,
контроль (а) получен в протонированной среде), а также по изменению
продолжительности лаг-периода, времени генерации и выходов микробной биомассы
(рис. 2). В отличие от адаптированного штамма (в), ростовые динамики
исходного штамма (б) в максимальной дейтерированной среде ингибировались
дейтерием (рис. 1).
Выход микробной биомассы
у адаптированного штамма (в) уменьшался на 13% по сравнению с контрольными
условиями (рис. 2, а) при увеличении времени генерации до 2.8, а
продолжительности лаг-периода до 40 ч (рис. 2, в). Адаптированный штамм
возвращался к нормальному росту при переносе в протонированную среду после
пролонгированного лаг-периода, что доказывает фенотипическую природу феномена
адаптации, хотя теоретически не исключается, что эффект реверсии стабильно
сохраняется при росте в 2Н2О, но маскируется при переносе
клеток в протонированную среду. Улучшенные ростовые характеристики
адаптированного метилотрофа существено упрощают схему синтеза 2Н-меченой
биомассы, оптимальным условиям которой удовлетворяет максимально дейтерированная
среда М9 с 98% 2Н2О и 2% [U-2Н]метанолом с
инкубационным периодом 5-6 сут при 370С.
Схема
синтеза 2Н-меченого инозина разрабатывалась с учетом способности
метилотрофных бактерий синтезировать большое количество белка (выход 50% от
веса сухого вещества), 15-17%
полисахаридов, 10-12%
липидов (в основном, фосфолипиды) и 18% зольных веществ [34]. Гидролиз биомассы
проводили автоклавированием в 0.5 н. 2НCl (в 2Н2O),
чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции
обратного (1Н-2Н) обмена в аминокислотных остатках
молекул белков. Качественный и количественный состав ароматических аминокислот
метилотрофного гидролизата изучали в дейтерированной среде М9 на
катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) с сульфированной смолой UR-30,
а уровни дейтерированности молекул масс-спектрометрией электронного удара
метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных
аминокислот. Гидролизат представлен пятнадцатью идентифицированными
аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при 440 нм) при
выходах аминокислот, сопоставимом с потребностями штамма в источниках углерода
и аминного азота (табл. 2). При этом индикатором, определяющим высокую
эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит высокий уровень
дейтерированности молекул аминокислот, который варьирует от 49% для
лейцина/изолейцина до 97.5% для аланина (табл. 2).
Биосинтетические
характеристики штамма B. subtilis снимали в протонированной дрожжевой
среде с обычной водой и синтетической тяжеловодородной среде с 2Н2О
и 2% 2Н-меченым метилотрофным гидролизатом B. methylicum
(рис. 3). Отмечена корреляция в характере изменения ростовых динамик (рис. 3, 1а,
2а), выхода инозина (рис. 3, 1б, 2б) и ассимиляции глюкозы (рис.
3, 1в, 2в). Максимальный выход инозина (17 г/л) зафиксирован в
опыте 1б (рис. 3, 1б) на протонированной среде при уровне
ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 3, 1в). На тяжеловодородной среде
выход инозина снижался в 4.4 (3.9 г/л) (рис. 3, 2б), а уровень
ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л неассимилируемой
глюкозы в КЖ (рис. 3, 2в).
Таблица 2. Аминокислотный состав метилотрофного гидролизата и уровни
дейтерированности молекул
Аминокислота
|
Выход, %
от сухого веса 1 г биомассы
|
Величина
молекулярного иона Мr
|
Количество
включенных атомов дейтерия
в
углеродный скелет молекулы
|
Уровень
дейтерированности молекул, % от общего количества атомов водорода
|
|
Глицин
|
9.69
|
324
|
2
|
90.0
|
|
Аланин
|
13.98
|
340
|
4
|
97.5
|
|
Валин
|
3.74
|
369
|
4
|
50.0
|
|
Лейцин
|
7.33
|
5
|
49.0
|
|
Изолейцин
|
3.64
|
383
|
5
|
49.0
|
|
Фенилаланин
|
3.94
|
420
|
8
|
95.0
|
|
Тирозин
|
1.82
|
669
|
7
|
92.8
|
|
Серин
|
4.90
|
355
|
3
|
86.6
|
|
Треонин
|
5.51
|
не
детектировался
|
-
|
-
|
|
Метионин
|
2.25
|
не
детектировался
|
-
|
-
|
|
Аспарагин
|
9.59
|
396
|
2
|
66.6
|
|
Глутаминовая
кислота
|
10.38
|
411
|
4
|
70.0
|
|
Лизин
|
3.98
|
632
|
5
|
58.9
|
|
Аргинин
|
5.27
|
не
детектировался
|
-
|
-
|
|
Гистидин
|
3.72
|
не
детектировался
|
-
|
-
|
|
Полученный
результат требовал изучение содержания глюкозы в биомассе штамма после
гидролиза, осуществленное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 3). Смесь
гидролизных сахаров в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции
с колонки) составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды
(мальтоза, сахароза), а также четыре других неидентифицированных сахара с
временами удерживания 3.08 (15.63%), 4.26 (7.46%), 7.23 (11.72%) и 9.14 (7.95%)
мин (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21.4%
от сух. веса, то есть выше, чем фруктозы (6.82%), рамнозы (3.47%), арабинозы
(3.69%) и мальтозы (11.62%). Их выхода существенно не отличались от контроля на
Н2О, за исключением сахарозы, не детектируемой в дейтерированном
гидролизате.
Таблица 3. Состав сахаров гидролизата штамма-продуцента
Сахар
Выход, % от сухого веса 1 г биомассы
протонированная среда тяжеловодородная среда
|
Глюкоза
|
20.01
|
21.4
|
Фруктоза
|
6.12
|
6.82
|
Рамноза
|
2.91
|
Арабиноза
|
3.26
|
3.69
|
Мальтоза
|
15.3
|
11.62
|
Сахароза
|
8.62
|
-
|
Применение
сложных физико-химических методов для выделения биосинтетически 2Н-меченого
инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высокой степени
хроматографической чистоты. Поскольку в КЖ наряду с синтезируемым продуктом
присутствуют примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, а также
сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и
непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводили ступенчатое
фракционирование КЖ. Повышенная чувствительность инозина к кислотам и щелочам и
его нестабильность при выделении диктовали использование кислотных и щелочных
растворов низкой концентрации, а также по-возможности проводить выделение при
низких температурах, избегая длительного перегрева реакционной смеси.
Фракционирование КЖ заключалось в низкотемпературном осаждении
высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом,
твердофазной адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля,
экстрактивного извлечения продукта, перекристаллизации и ионообменной
хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемператрным осаждением
ацетоном при -40С, проводя последующую адсорбцию суммы
рибонуклеозидов активированным углем на холоду. Десорбированные рибонуклеозиды
извлекали из прореагировавшей твердой фазы элюцией этанольно-аммиачным
раствором при 600С, а сам инозин экстракцией 0.3 М NH4-формиатным
буфером (рН 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле. Окончательная
стадия очистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на
катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0.3 М NH4-формиатным
буфером с 0.045 М NH4Cl с ТСХ контролем при Rf
0.5. Данные по выделению инозина из КЖ штамма-продуцента представлены в виде
спектров УФ-поглощения на рис. 4, а-в. Наличие в синтетическом образце (в)
основной полосы поглощения I, соответствующей нативному инозину (lmax 249 нм, e249 7100 М-1 см-1)
и отсутствие вторичных метаболитов II и III
неоспоримо доказывает его однородность и тем самым эффективность разработанного
метода выделения со степенью хроматографической чистоты 92%.
Уровень
дейтерированности инозина исследовали методом масс-спектрометрии FAB из за
высокой чувствительности, позволяющей детектировать 10-8-10-10 моль
вещества в пробе, что существенно выше чем при использовании 1Н
ЯМР-спектроскопии [7]. Пути фрагментации молекулы методом FAB приводят к
распаду инозина на фрагмент рибозы А с Мr при массовом
соотношении m/z 133 и гипоксантиновый фрагмент Б c Мr m/z
136 (их распад сопровождался миграцией протона Н+), который в свою
очередь расщепляется на ряд менее низкомолекулярных осколочных фрагментов В,
Г, Д, Е и Ж при m/z 109, 108, 82, 81 и 54 за
счет элиминирования НСN и СО из гипоксантина (схема).
Биосинтетический
2Н-меченый инозин (масс-спектр приведен на рис. 5, б
относительно контроля (а)), представлен смесью изотопнозамещенных форм
молекул с различным количеством атомов водорода, замещенных на дейтерий. Подсчет
уровня дейтерированности молекулы инозина определяли, сравнивая величины пиков
молекулярных ионов Мr инозина дейтерированного и протонированного
образцов (формирование пика молекулярного иона инозина сопровождалось миграцией
протона Н+). Пик (М+Н)+ полиморфно расщеплялся на
отдельные кластеры с примесью молекул со статистическим набором массовых чисел m/z
с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности с включением
четырех (m/z 273, 20%), пяти (m/z 274, 38%), шести (m/z 275,
28%) и семи атомов дейтерия (m/z 276, 14%) (табл. 4).
Суммарный
уровень дейтерированности молекулы (УД), вычесленный по приводимой ниже формуле
составил 61% от общего количества атомов водорода в углеродном скелете
молекулы.
Mr1 C1 + Mr2
C2 + ....... + Mrn Cn
УД =
______________________________
S Cn
(Mr - величины пиков
молекулярных ионов инозина; Сn - вклад в уровень дейтерированности,
мол.%).
Анализ
масс-спектра FAB выявил включение атомов дейтерия в рибозный и гипоксантиновый
фрагменты молекулы, что подтверждено присутствием двух “тяжелых” пиков
фрагментов рибозы А m/z 136, 46% (вместо m/z 133, 41%) и
гипоксантина Б m/z 138, 55% (вместо m/z 136, 48%), а также
пиков низкомолекулярных фрагментов, продуктов распада гипоксантина В m/z
111, 49% (вместо m/z 109, 45%) и Г m/z 84, 43% (вместо m/z
82, 41%) (рис. 5).
Таблица 4. Величины пиков (М+Н)+ в
масс-спектрах FAB и уровни дейтерированности инозина
Величина пика (М+Н)+
|
Вклад в уровень дейтерированности,
мол.%
|
Количество атомов дейтерия
|
Уровень дейтерированности, % от
общего количества атомов водорода
|
273
|
20
|
4
|
20.0
|
274
|
38
|
5
|
62.5
|
275
|
28
|
6
|
72.5
|
276
|
14
|
7
|
87.5
|
Эффект
множественного мечения определяется способом получения дейтерированных молекул
и свидетельствует о недостаточно высокой селективности биосинтетической схемы,
повысить которую возможно контролем изотопного состава синтетической ростовой
среды и исключения источников дополнительных протонов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования
проводили с генетически маркированным штаммом грамположительных бактерий Bacillus
subtilis ВКПМ В-3157, продуцентом инозина, адаптированным к дейтерию
рассевом до отдельных колоний на 2% агаре с 2Н2О и
последующей селекции по признаку устойчивости к 2Н2О.
В работе использовали 2Н2О
(99.9 ат.% 2Н), 2НСl (95.5 ат.% 2Н) и [U-2H]метанол
(97.5 ат.% 2Н) (ЗАО Изотоп, Санкт-Петербург, РФ). Неорганические
соли и D, L- глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно
перекристаллизовывали в 2Н2О, 2H2O
дистиллировали над перманганатом калия с последующим контролем изотопной
чистоты 1Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ)
(Частота 70 МГц). Масс-спектры электронного удара ЭУ получены на приборе МB-80A
(Hitachi, Япония) с двойным фокусированием (энергия ионизирующих электронов 70
эВ, ускоряющее напряжение 8 кВ, температура катодного источника 180-2000С)
после модификации в метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных
производных аминокислот по разработанной раннее методике [7]. Масс-спектры FAB
получены на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical,
США), снабженным цезиевым источником Cs+ на глицериновой матрице с
ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА. УФ-спектры
регистрировали на программируемом спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в
диапазоне длин волн 220-280 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге
Т-24 (ФРГ) с охлаждением при -40С. Аналитическую
обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ),
снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters K-401 (ФРГ) на колонке
Separon С18 (250 x 10
мм), элюция смесью ацетонитрил : вода, 75 : 25, об.%, скорость элюирования 0.6
мл/мин. Ионообменную хроматографию осуществляли на катионообменной колонке
Biotronic LC-5001 (ФРГ) (230 x 3.2) с сульфированной стирольной (7.25% сшивки)
смолой UR-30 (Beckman-Spinco, США); рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи
Na+-цитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570
нм. Уровень биоконверсии углеродного субстрата определяли, используя
глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4) как описано в работе [35].
Биосинтетический
2Н-меченый инозин. Получен с выходом 3.9 г/л на синтетической тяжеловодородной
среде (89-90% ат. 2Н), используя в качестве источника 2Н-меченых
ростовых субстратов гидролизат биомассы метанол-ассимилирующего штамма
факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum ВКПМ
B-5662 (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. 2НСl 30-40
мин при 08 ати), выделенный скринингом в условиях многостадийной адаптации на
твердой среде М9 (2% агар) с 2% [U-2Н]метанолом со ступенчато
увеличивающимся градиентом концентрации тяжелой воды (от 0 до 98% 2Н2О).
Состав синтетической тяжеловодородной среды (мас.%): глюкоза - 12; 2Н-меченый гидролизат
B. methylicum - 2;
NH4NO3 - 2; MgSO4 . 7H2O - 1; Са2СО3 - 2.
Синтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой
100 мл) в течение 5-6 сут при 30-320С в условиях интенсивной аэрации
реакционной смеси на орбитальном шейкере S-380 (Венгрия).
Очистка 2Н-меченого инозина.
Пробы КЖ центрифугировали при 2000 g, 10 мин, концентрировали при 10 мм
рт. ст., добавляли ацетон при 00С (3 x 5 мл). Смесь выдерживали 14-15 ч при
-40С, осадок отделяли центрифугированием при 1200 g, 5 мин. К
супернатанту добавляли 10 г активированного угля, выдерживали 2 сут при 40С.
Водную фракцию отделяли фильтрованием, к твердой фазе добавляли 20 мл 50%
этанола в 25% аммиаке (1 : 1, об.%), кипятили при 600С с обратным
водяным холодильником. Через 2-3 ч смесь фильтровали и упаривали при 10 мм рт.
ст. Продукт экстрагировали 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9),
промывали ацетоном (2 x 10 мл), сушили над безводным СaCl2. Инозин
перекристаллизовывали из 80% этанола, очищали методом ионообменной
хроматографии на откалиброванной колонке Biorad (150 x 10 мм) с катионообменной смолой АG50WX
4 (Pharmacia, США), уравновешенной 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН
8.9) c 0.045 М NH4Cl в условиях изократической элюции
(хроматографическая чистота 92%). Контроль чистоты проводили методом ТСХ с
использованием стандартного набора рибонуклеозидов фирмы Beckman-Spinco (США)
на хроматографических пластинках (150 x 150 мм) с закрепленным слоем
флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Чехословакия) в системе растворителей:
H-бутанол : уксусная кислота : вода, 2
: 1 : 1, об.%. Выход 2.5 г/л (64%). Т. пл. 68-700С. [a]D20 1.610
(с 1.5 этанол). Rf 0.5. рКa 1.2
(фосфатный буфер, рН 6.87). УФ-спектр (0.1 н. НСl) (lmax 249 нм, e249 7100 М-1 см-1);
FAB-спектр (глицериновая матрица Cs+, ускоряющее напряжение 5 кВ,
ионный ток 0.6-0.8 мА): (M+H)+ m/z (I,%): 273, 20% (4
ат. 2Н); 274, 38% (5 ат. 2Н); 275, 28% (6 ат. 2Н);
276, 14% (7 ат. 2Н), (А + H)+ 136, 46%; (Б
+ Н)+ 138, 55%; (Б - НCN)+ 111, 49%; (В -
HCN)+ 84, 43%.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Young V.R., Yu Y.M.,
Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes 15N,
13C, and 2H as probes. in: New techniques in nutritional
research // Whitehead R. G. (ed). Acad. Press. N. Y. 1990. V. 9. Р. 17-72.
2. Hruby V.J. //
Synth. and Appl. Isot. Label. Compounds. 1985. V. 4. ¹1. Р. 287-292.
3. Nelson J.E., Ruo
T.I. // Clinica Chemica Acta. 1988. V. 175. ¹ 3. Р. 59-65.
4. Stockman B.J., Reily
M.D., Westler W.M., Ulrich E.L., Markley J.L. // Biochemistry. 1989. V. 28.
¹ 7. Р. 230-236.
5. McIntosh L.P.,
Dahlquist F.W. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. ¹ 1. Р. 1-38.
6. Argade P.V., Rothschild
K.J., Kawamoto A.H., Herzfeld J., Herlihy W. C. // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1981. V. 78. №
3. P. 1643-1646.
7. Мосин О.В., Складнев Д.А.,
Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. ¹ 10-11. С. 856-869.
8. Darmaun D., Robert
J. J., Bier D.M., Mathews D.E., Young V.R. // Annales-d’ Endocrinologie.
1985. V. 46. ¹ 4. Р. 355-356.
9. Shvets V.I.,
Yurkevich A.M., Mosin O.V., Skladnev D.A. // Karadeniz Journal of Medical
Sciences, 1995. V. 8. ¹ 4. P. 231.
10. Fesik S.W.,
Zuderweg E.R.P. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. № 2. Р. 97-131.
11. Мосин О. В., Складнев Д. А.,
Егорова Т. А., Швец В. И. //Биотехнология. 1996. № 10. С. 24-40.
12. Пшеничникова А.Б., Карнаухова
Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. ¹ 3. С. 163-178.
13. Daub G. H.
Syntheses with stable isotopes. in: Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern.
Conference // Klein E. R. (ed). Academic Press. N. Y. 1979. Р. 3-10.
14. van der Berg
E.M.M., van Liemt, Willem B.S // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108.
¹ 9. Р. 304-313.
15. Walker T. E.,
Matheny C. // J. Org. Chem. 1986. V. 51. Р. 1175-1179.
16. Фалеев Н.Г., Рувинов С. В.,
Сапоровская Н. В., Беликов В. М., Закомырдина Л.Н. // Изв. Ан. СССР. Сер.
хим. 1989. Т. 10. Вып. 3. С. 2341-2343.
18. Mosin O.V.,
Skladnev D.A., Shvets V.I. // Bioscience, biotechnology, and biochemistry.
V. 62. ¹ 2. P. 225-229.
19. Crespi H.L., Marmur
J., Katz J.J. // Nature. 1962. V. 84. ¹ 1. Р. 3489-3491.
20. Crespy H.L.
Stable Isotopes in the Life Sciences. International atomic energy agency Press.
Vienna. 1977. Р. 111-121.
21. Daboll H.F., Crespi
H.L., Katz J.J. // Biotechnol. Bioengineer. 1962. V. 4. ¹ 5. Р. 281-297.
22. Cox J., Kyli D.,
Radmer R. // Trends Biotechnol. 1988. V. 6. № 12. Р. 279-282.
23. Мосин О.В., Складнев Д.А.,
Швец В.И. // Изв. РАН. Сер. биол. ¹ 3. С. 1-10.
24. Thomson J. F. Biological
effects of deuterium. Pergamon Press. N. Y. 1963. P. 1-133.
25. Еремин В.А., Чекулаева Л.Н., Харатьян
Е.Ф., Островский Д.Н. // Микробиология. 1978. Т. 32. Вып. 4. С. 629-636.
26. Busujima U.K.,
Shimiba S., Narita K., Okada S. // Chem. Pharm. Bull. 1988. V. 36. ¹
4. P. 1828-1832.
27. Colby J, Dalton H. //
Ann. Rev. Microbiol. 1979. V.33. ¹ 6. P.481-517.
28. Karnaukhova E.N.,
Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids.
1994. V.6. ¹ 2. P.165-176.
29. Skladnev D.A.,
Tsygankov Y.D. Convertion of stable isotope labeled methanol to components
of bacterial biomass, in: 6 th Eur. Conf. of Biomass for Energy. Athens.
Greece, 1991. P. 234.
30. Мосин О.В., Складнев Д.А.,
Егорова Т.А., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.
31. Складнев Д.А., Мосин О.В.,
Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.
32. Мосин О.В., Казаринова Л.А.,
Преображенская К.А., Складнев Д.А., Чеботаев Д.В., Юркевич А.М., Швец В.И. //
Биотехнология. 1996 г. № 4. C. 19-27.
33. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н.,
Пшеничникова А.Б.,Складнев Д.А., Акимова О.Л. // Биотехнология. 1993. № 9.
С. 16-20.
34. Зорина А.В, Бабусенко Е.С.
Химический состав биомассы метилотрофных бактерий. Современные проблемы
биотехнологии микроорганизмов. // Тезисы докл. молодых ученых. Рига. 1987. Т.
1. № 2. С.35-40.
35. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т.
Органический анализ. Руководство по анализу органических соединений. Л.: Химия,
1981. 514 c.
THE BIOSYNTHESIS OF 2H-LABLED
INOSINE WITH HIGH LEVEL OF DEUTERIUM ENRICHMENT
О. V. MOSIN
Мoscow State Academy of Fine Chemical Technology named after М.V. Lomonosov, 117571 Moscow,
Vernadskogo Pr., 86;
The
biosynthesis of 2Н-labeled purine ribonucleoside inosine (yeald 3/9 g/l) with
using an adapted to deuterium strain of Bacillus subtilis on heavy water
medium with highly level of deuteration (89-90 at.% 2H2O),
containing 2% hydrolyzate of biomass of methylotrophic bacterium Brevibacterium
methylicum as a source of 2H-labeled growth substrates (the
biosynthetic conditions: synthetic medim M9 with 98% 2Н2O and 2% [U-2Н]methanol, the incubation period 5-6
days at 370C) was carried out. The studyng of the level of deuterium
enrichment of inosine by a method of FAB mass-spectrometry found out the
polymorhysm of isotopic introduction into the molecule (isotopic composition of
inosine: 4 at. 2H, 20%, 5 at. 2H, 38%, 6 at. 2H,
28%, 7 at. 2H, 14%) with deuterium introduction to ribose and
hypoxantine fragments of the molecule.