Скрининг микроделеций AZF локуса y хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза

Скрининг микроделеций AZF локуса y хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза

СКРИНИНГ МИКРОДЕЛЕЦИЙ AZF ЛОКУСА Y ХРОМОСОМЫ У МУЖЧИН С НАРУШЕНИЕМ СПЕРМАТОГЕНЕЗА

А.А. Исламова, Р.И. Хусаинова, Р.Ф. Ахметов, О.С. Шитков, Э.К. Хуснутдинова

Проблема бесплодия встречается примерно у 15% супружеских пар, причем примерно половина случаев обусловлена нарушением сперматогенеза у мужчин. Генетические факторы в этиологии бесплодия занимают ведущее место в структуре нарушений репродуктивной функции, как у мужчин, так и женщин. Причиной генетически обусловленного мужского бесплодия, связанного с нарушением сперматогенеза, в10-15% случаев являются структурные нарушения Y-хромосомы.

Ранее полагали, что функция Y-хромосомы у млекопитающих ограничивается контролем за дифференцировкой пола, но в 1976 г. были представлены доказательства значения Y-хромосомы человека для сперматогенеза. Y-хромосома- одна из самых маленьких хромосом в геноме человека- имеет размер около 60Mb, 30 из которых приходится на эухроматиновые домены, а остальное- на гетерохроматиновый блок в дистальном участке длинного плеча, который может сильно варьировать по размеру у разных индивидов. В целом, хромосома делится на три участка: эухроматиновое короткое плечо (Yp11), эухроматиновая проксимальная часть длинного плеча (Yq11) и гетерохроматиновый дистальный участок (Yq12). Эухроматиновые районы невариабельны в размерах [1].

Анализируя терминальную делецию Y-хромосомы у 6 стерильных мужчин с нормальным фенотипом и азооспермией, Tiepolo и Zuffardi в 1976 году предположили существование генного комплекса мужской фертильности в дистальном участке эухроматиновой части длинного плеча Y-хромосомы (Yq11). Этот локус назвали фактором азооспермии (AZF) [13]. Дальнейшие цитогенетические и молекулярно-генетические исследования позволили построить детальную карту Y-хромосомы, включающую 43 делеционных интервала.

В настоящее время цитогенетическими и молекулярно-генетическими методами можно диагностировать макро- и микроделеции Y-хромосомы, захватывающие локус AZF, которые удается обнаружить у 10-15% больных с азооспермией и у 5-10% с олигозооспермией тяжелой степени [3, 6, 9, 11, 16].

В 1996 г Vogt и соавторы на основании полученных данных о локализации и размере делеций предложили выделить в локусе Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся субрегиона, получившие названия AZFa, AZFb и AZFc [16]. AZFа субрегион располагается в дистальной части Yq11, AZFb и AZFc картированы проксимальнее первого. У пациентов с микроделециями этих субрегионов выявлено нарушение сперматогенеза на различных стадиях, в зависимости от потери определенного участка AZF.

Впоследствии для каждого субрегиона были выделены кандидатные гены, ответственные за нарушение сперматогенеза: для AZFa - USP9Y(DFFRY) и DBY, для AZFb - RBMY, для AZFc-региона - DAZ. Определены нуклеотидная последовательность и размер каждого субрегиона: AZFa около 800 тыс. п. н., AZFb - 3,2 млн. п. н. и AZFc-3,5 млн. пар нуклеотидов.

В отличие от генов-кандидатов субрегионов AZFb и AZFc, гены AZFa-субрегиона представлены на хромосоме единственной копией, поэтому, даже точковые мутации могут вызвать нарушение сперматогенеза и приводить к бесплодию у мужчин. Вероятно, делеции или мутации гена DBY, кодирующего тестис-специфичную РНК-геликазу, нарушают процесс метаболизма мРНК в дифференцирующихся мужских половых клетках, приводя к усилению его апоптической активности.

Гены RBMY и DAZ, являющиеся «кандидатными» генами для субрегионов AZFb и AZFc, представлены на Y-хромосоме в нескольких копиях, кодируют белки с РНК-связывающей активностью, которые участвуют в метаболизме новосинтезированных РНК-транскриптов. Вероятно, гены семейства RBMY играют важную роль на стадиях пролиферации сперматогониев и при прохождении сперматоцитов через стадии профазы I мейоза, а их отсутствие или нарушение функции может привести к блоку сперматогенеза на стадии сперматоцитов и, как следствие, к азооспермии. Продукты, кодируемые генами DAZ, участвуют в метаболизме мРНК тестис-специфичных генов, регулируя их экспрессию в дифференцирующихся половых клетках после мейоза на этапах сплайсинга, транспорта, хранения и селективной трансляции мРНК вплоть до образования зрелых сперматозоидов. Делеции генов DAZ могут приводить к различной степени нарушения сперматогенеза - от снижения числа сперматозоидов вплоть до СКС (синдром клеток Сертоли) - либо блокированию сперматогенеза на уровне сперматид (делений созревания) [4]. Вследствие многокопийности генов RBMY и DAZ поиск мутационных нарушений в них значительно затруднен. Ряд генов локуса AZF имеет гомологи, расположенные как на X-хромосоме, так и на аутосомах. Механизмы их межгенного взаимодействия, возможности функциональной компенсации еще не известны и требуют дальнейшего изучения.

У пациентов с делециями локуса AZF, помимо снижения количества сперматозоидов, отмечено ухудшение их подвижности и морфологических характеристик - олигоастенотератозооспермия. Специфичных форм нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с делециями локуса AZF не описано. Помимо генов DAZ субрегион AZFc содержит копии гена CDY I (хромодомен хромосомы Y), функция которого связана с модификацией хроматина в дифференцирующихся мужских половых клетках. Поэтому нельзя исключить, что потеря или дефекты функции генов CDY I могут быть в определенной степени ответственны за нарушение сперматогенеза.

Строгой зависимости степени и стадии нарушения сперматогенеза от локализации и размера делеции локуса AZF не получено, однако был выявлен ряд общих гено-фенотипических корреляций. В настоящее время установлено, что более крупные делеции, захватывающие два или три субрегиона, а также AZFa-микроделеции ассоциированы с более тяжелым нарушением сперматогенеза (синдром клеток Сертоли). Наиболее частые делеции субрегионов AZFc и AZFb+с приводят к снижению сперматогенной активности или блокированию сперматогенеза до СКС [2,7].

Определение зависимости степени нарушения сперматогенеза от размера и локализации делеций имеет прогностическое значение в плане получения сперматозоидов, пригодных для проведения ИКСИ (Introcitoplasmic Sperm Injection).Так, наличие делеций, захватывающих субрегионы AZFa и/или AZFb, указывает на невозможность получения зрелых половых клеток, а у пациентов с делециями AZFc примерно в 50-70% случаев удается получить зрелые сперматозоиды [7].

Материалы и методы

С февраля 2005 года лабораторией молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН совместно с Центром планирования семьи и репродукции с медико-генетическим консультированием при Республиканском перинатальном центре было обследовано 45 пациентов с первичным бесплодием. Возраст инфертильных мужчин варьировал от 24 до 48 лет (в среднем 33±4.8 года).

Обследование включало следующие исследования: клиническое, андрологическое (общее и специальное), спермиологическое и молекулярно-генетическое (анализ микроделеций Y-хромосомы). На основании результатов спермиологического исследования все мужчины с нарушением сперматогенеза были разделены на 3 группы. В первую группу отобрали 32 пациента с азооспермией, во вторую - 13 мужчин с олигозооспермией тяжелой степени (менее 5 млн/мл эякулята), в третью - 4 пациента с астенотератозооспермией (количество сперматозоидов превышало 5 млн/мл эякулята). Контрольная группа состояла из 50 здоровых (фертильных) мужчин, имеющих потомство. Спермиологический анализ эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1992; 1999) [15]. ДНК была выделена из лимфоцитов периферической крови последовательным методом фенольно-хлороформной экстракции по Mathew [11].

Полимеразную цепную реакцию приводили на программируемом термоциклере «Терцик » производства фирмы « ДНК-технология » (Россия).

Для обнаружения делеций применяли мультиплексную амплификацию согласно руководству, предложенному Simoni и соавт. [12] с использованием диагностического набора «AZF» («Центр Молекулярной Генетики Лаборатория ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН»).

В ходе анализа выполняли детектирование делеций в трех субрегионах AZF. Набор праймеров, использованных в данной работе, позволял исследовать 9 STS-маркеров, специфичных для AZF-локуса:

для субрегиона AZFa: sY 86, sY 84, sY 615.

для субрегиона AZFc: sY 254 (DAZ), sY 255 (DAZ).

Кроме того, в качестве “внутреннего” контроля на присутствие в геномной ДНК фрагментов короткого плеча Y -хромосомы использовали два маркера SRY и ZFY - что позволяло выявить наличие даных локусов и определить сответствие фенотипического пола генотипическому. В качестве “внешнего положительного” контроля использовали ДНК фертильного мужчины. Результаты амплификации оценивали методом электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия.

Результаты и обсуждение.

Среди 45 обследованных мужчин с бесплодием делеции локуса AZF были обнаружены у 4 (в 8,9 % случаев). Микроделеции были выявлены в двух случаях у пациентов с азооспермией, что составляет 6,25% случаев для данной группы. В группе больных с олигозооспермией тяжелой степени микроделеции были обнаружены у двух больных, частота встречаемости оказалась равной 22,2%. В контрольной группе фертильных мужчин микроделеции Y - хромосомы не были определены. Во всех случаях выявлены микроделеции AZFc-локуса, что доказано дублирующими независимыми исследованиями (рис. 1).

Частота микроделеций Y-хромосомы среди мужчин с бесплодием значительно варьирует в исследованиях разных авторов (от 1% до 35%) [9, 10, 12, 14]. Столь широкий разброс частот делеций обусловлен влиянием ряда факторов, среди которых наибольшее значение имеют критерии отбора пациентов для проведения микроделеционного анализа и количество исследуемых локусов STS [6, 8, 10, 12]. По литературным данным, у мужчин с бесплодием частота микроделеций в AZF-локусе Y хросомы составляет в среднем 7,5% в различных популяциях мира. У пациентов с идиопатической азооспермией микроделеции обнаружены в 18% случаев, с тяжелой олигозооспермией неясного генеза - в 14,3% случаев [9]. Результаты, полученные в ходе нашего исследования, не противоречат этим данным, хотя оказались несколько выше среднемирового уровня.

бесплодие генотипирование делеция хромосома

Рис. 1- Генотипирование делеций в Y хромосоме (1 дорожка - делеция sY255 и sY254, 2-10 дорожки - норма, 11 - маркер молекулярного веса λ/PstI)

Специфичного лечения нарушения сперматогенеза у мужчин с делециями локуса AZF в настоящее время не разработано. Обнаружение у пациента делеции позволяет избежать необоснованного гормонального или хирургического лечения. Но в то же время, у мужчин с микроделециями субрегиона AZFc Y-хромосомы не стоит отказываться от проведения сперматогенезстимулирующей терапии и лечения сопутствующей патологии репродуктивной системы, так как велика вероятность получения от них сперматозоидов, которые могли бы быть успешно использованы при ИКСИ [7].

Полученные результаты еще раз подтверждают необходимость генетического обследования, включая цитогенетическое исследование и микроделеционный анализ локусов AZF у пациентов с необструктивной азооспермией и тяжелой олигозооспермией неясного генеза, с целью установления причины бесплодия и оптимальной тактики лечения.

Учитывая высокую частоту микроделеций в AZF локусе Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза из Республики Башкортостан, молекулярно-генетический скрининг локусов AZF должен быть проведен всем пациентам с бесплодием неясного генеза, которым рекомендовано экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или ИКСИ.

ЛИТЕРАТУРА

1.      В.Л. Быков Сперматогенез у мужчин в конце XX века (обзор литературы).// Проблемы репродукции.- 2000.- № 1.

2.      Гоголевский П.А., Гоголевская И.К. Y-хромосома и мужское бесплодие (обзор литературы) //Пробл. репродукции 1999.-№ 5, Т.5.- с.26-34.

.        П.А. Гоголевский, А.С. Калугина, Д.А. Бондарев и др. AZF- микроделеции и мужское бесплодие // Андрология и генитальная хирургия. - 2001.- №4. - с.73-77.

1.      В.М. Здановский, П.А. Гоголевский, И.К. Гоголевская Тестирование микроделеций на Y - микроделеций у пациентов с различными нарушениями сперматогенеза.// Проблемы репродукции.- 2000. - Т.6, № 6.- с.56-59.

2.      Ю.А.Логинова, И.И. Нагорная, С.А. Шлыкова Цитогенетическое исследование и микроделеционный анализ локусов AZF. //Проблемы репродукции. - 2000. - №5.

.        В.Б. Черных, Л.Ф. Курило, В.А. Поляков Y-хромосома, AZF-делеции и идиопатическое бесплодие у мужчин (обзор литературы). //Проблемы репродукции.- 2001. - Т.7.- №5.- с.47-58.

.        В.Б.Черных, Л.Ф.Курило, Л.В Шилейко и др. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований. //Мед. Генетика.- 2003.- №8.- с.367-379.

.        Calogero A.E., Garofalo M.R., D. Agata R. Factors imfluencing the variable incidence of Y- chromosome microdeletions in infertile patients // Hum Reprod.- 1999. - Vol. 14, №2. - P. 275.

.        Krausz C., McElreavey K. Y chromosome and male infertility // Frontiers in Biosunce - 1999. Vol.2 - P. 943-949.

.        Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M.N.Y.; Haman Press. - 1984. - P. 31-34.

.        Simoni M…, Bakker E., Eurling M. et al. Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y- chromosomal microdeletion // Int. J. Androl. - 1999. - Vol. 22.- P. 292-299.

10.    Tiepolo L., Zuffardi O. Localisation of factors controlling spermatogenesis in the non fluorescent portion of the human Y- chromosome long arm // Hum. Genet. - 1976.- Vol.34. - P.119-124.

11.    Van der Ven K., Montag M., Peschka B. et al. Combined cytogenetic and Y-chromosome microdeletion screening in males undergoing intracytoplazmic sperm injection. Mol Hum Reprod 1997; 3: 699-704.

.        WHO (1999). Руководство ВОЗ по лабораторному иследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. Четвертое издание. Cambridge University Press,1999. Пер. с англ. Р.А. Нерсесяна. Научн. ред. перевода проф. Курило Л.Ф.-М.- 2001.-143с.

13.    Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S. et al. Human Y- chromosome azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yq11 // Hum. Mol. Genet. - 1996. - Vol.- 5, №7. - P.933-943.