Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном

Способность проникать внутрь клетки, минуя клеточную мембрану, - одно из качеств, которое должно присутствовать у эффективного антисмыслового олигонуклеотида. Большинство описанных выше модификаций нуклеотидов в составе ODN не оказывают значительного влияния на транспорт ODN через клеточную мембрану. Существует несколько путей проникновения молекул через плазмалемму, но для ODN важны два: диффузный, или не рецептор-опосредованный, и рецептор-опосредованный. Транспорт по первому варианту затрудняется суммарным отрицательным зарядом ODN и их гидрофильностью. Использование второго пути ограничено недостаточными данными о поверхностных белках мембраны клеток, отвечающих за транспорт нуклеиновых кислот в клетку. Создание конъюгатов ODN с различными химическими группами способствует повышению эффективности транспорта по тому или иному пути в зависимости от типа химической группы и места её присоединения к ODN. На рисунке 9 представлены варианты линкеров, которые используются при получении конъюгатов. Лиганды можно присоединять к азотистым основаниям, концевым фосфатам, фосфодиэфирным (или аналогичным им) связям, а также остаткам сахара. Некоторые типы химических групп позволяют также визуализировать компартментализацию путём детекции флуоресценции.  модификация олигонуклеотид антисмысловый реакция

Рис.9. Примеры линкеров для присоединения лигандов.

Частичная и даже полная нейтрализация отрицательного заряда ODN не оказывает существенного эффекта на способность ODN к самопроизвольному транспорту в клетку. Присоединение различных объёмных гидрофобных лигандов, в частности, тех, что изображены на рисунке 9, облегчает транспорт ODN через мембрану.

Рис.10. Примеры липофильных лигандов.

Хорошо изучены конъюгаты с холестеролом [3,4,24,25]. Механизм, улучшающий проникновение в клетку за счёт присоединения холестерола, ещё не до конца ясен, хотя, предполагается рецептор-опосредованное включение липопротеидов [25]. Холестероловые конъюгаты образуют мицеллы, что облегчает их транспорт внутрь клетки. Присоединяют остаток холестерола обычно по концевым 5’- и 3’-фосфатам, причём 3’-монохолестерилолигонуклеотиды более эффективны по сравнению с 5’-монохолестерилолигонуклеотиды, а самыми действенными являются 5’,3’-бисхолестерилолигонуклеотиды. К примеру, через 6 мин после инъекции в кровь мыши уровень в тканях 3’-мономодифицированных фосфоротиоатиов был в 4 раза, а 5’-моно- и 3’,5’-бисмодифицированных - в 7 раз выше по сравнению с немодифицированными фосфоротиоатами [27].

Используют мономеры с 5’- или/и 3’-холестерилзамещённым фосфатом [2,24], олигонуклеотиды с лигандом, конъюгированным с фосфодиэфирной связью перед 3’-концевым нуклеозидом [25], а также холестериловые дендримеры с остатком лизина в качестве линкера (см. рис. 11) [23].

Рис.11. Неразветвлённые и разветвлённые конъюгаты с холестеролом.

Олигонуклеотиды, конъюгированные с другими гидрофобными молекулами (адамантан, пирен, эйкозановая кислота и др.), были синтезированы и сравнены с холестероловыми. Холестероловые конъюгаты показали оптимальную липофильность, а также хорошую способность к аккумуляции в печени [24].

Конъюгация с производными пирена, кроме улучшения способности к транспорту, представляет интерес по причине их способности к флюоресценции. Бис-пиренильные производные способны образовывать эксимеры - бимолекулярные комплексы, в которых одна молекула находится в основном состоянии, другая - в возбуждённым. Такие комплексы очень чувствительны к пространственному окружению, по уровню флуоресценции можно судить о том, находится ODN в связанном с РНК-мишенью состоянии или нет [29-32]:

Рис.12. Эксимерная флюоресценция биспиренильных конъюгатов..

Для улучшения эффективности транспорта в клетку используются также пептидные конъюганты. К олигонуклеотидам, в т.ч. PNA, присоединяют пептид, способный переносить через мембрану большие полярные заряженные молекулы [3]. Так, пептид Antennapedia имеет сайты связывания ДНК. PNA с присоединённым пептидом Antennapedia не только эффективно проникает в клетку, но и мигрирует в ядро [20].

Рис.13. Пептидный конъюгат.

Присоединение к концам молекул антисмысловых ODN больших плоских интеркалирующих молекул, таких, как акридин (см. рис. 14), представляет интерес в качестве увеличителя эффективности расщепления молекулы РНК-мишени. За счёт интеркаляции локально разрыхляется взаимодействие ODN - РНК. В следствие увеличения расстояния между ДНК и РНК за счёт размеров молекулы интеркалятора образуется «выпетливание» молекулы РНК из двойной спирали гетеродуплекса. Катионы тяжёлых металлов, например Lu³⁺, координированные с атомами азота остатка акридина, катализируют гидролиз РНК без участия РНКазы H, а «выпетливание» как дестабилизирующая структура ускоряет этот процесс [39].

Рис. 14. Конъюгат с интеркалирующим агентом.

1.3 Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени

Эффективность действия антисмысловых олигонуклеотидов количественно характеризуется сродством ODN к мРНК-мишени и эффективной константой расщепления последней.

Сродство ODN к адресуемой ему РНК (или свободная энергия образования гетеродуплекса) описывает стабильность гибрида ДНК - РНК. D_rG может быть измерена калориметрически [17], либо рассчитана теоретически [34,35]. При расчете свободной энергии Гиббса образования гетеродуплекса используется закон Гесса (свободная энергия Гиббса сложной реакции не зависит от её пути) и расчеты энергий образования вторичных и третичных структур по правилу «ближайшего соседа» (nearest neighbor rule) с помощью программы mfold, разработанной Цукером и соавторами. Реакцию можно представить следующим образом:

В этой схеме М, O, H - соответственно мРНК-мишень, антисмысловой ODN и гетеродуплекс ODN - РНК с учётом их вторичной и третичной структуры, М_u, O_u, H_u - соответственно мРНК-мишень, антисмысловой ODN и гетеродуплекс ODN - РНК без учёта их вторичной и третичной структуры, D_unG_(M), D_unG_(O), D_unG_(H) - свободные энергии Гиббса укладки их во вторичную и третичную структуру, D_rG, D_rG_(unfolded) - свободные энергии гибридизации ODN и мРНК в свёрнутом и полностью денатурированном состоянии соответственно.

D_unG_(M), D_unG_(O), D_unG_(H) и D_rG_(unfolded) могут быть теоретически рассчитаны. Тогда свободная энергия гибридизации находится по закону Гесса:

Константу равновесия процесса ассощиации гетеродуплекса K₁ можно найти, исходя из рассчитанной свободной энергии Гиббса процесса гибридизации:

Для оценки температуры плавления гетеродуплекса также пользуются правилом «ближайшего соседа» и рассчитывают её с помощью соответствующих программ.

Экспериментально можно найти эффективную константу скорости k_eff брутто-реакции превращения мРНК M в условный продукт X (эта условность не влияет на результат кинетических расчетов, но значительно их упрощает):

Эффективная константа скорости брутто-реакции показывает наблюдаемую скорость расщепления мРНК-мишени.

Механизм реакции можно представить следующей схемой:

В этой схеме E - фермент РНКаза H, HE - промежуточный комплекс её с субстратом H, K₁ - константа ассоциации гетеродуплекса, рассчитываемая по формуле (3).

Для данной кинетической схемы можно составить систему кинетических уравнений:

где С_A - концентрация вещества A, k_i - константа скорости i-й элементарной реакции.

Обычно измеряемым параметром является концентрация мРНК в растворе (исходная C_M0 и текущая C_M), поэтому k_eff считают относительно к матрице:

Использовав квазистационарное приближение по промежуточному продукту HE и упростив выражение для скорости реакции w с помощью уравнения Михаэлиса - Ментен:

где  - константа Михаэиса, можно преобразовать выражение для скорости изменения концентрации гетеродуплекса H:

Найдём выражение для эффективной константы скорости расщепления мРНК-мишени в двух случаях: когда процесс лимитируется связыванием мРНК антисмысловым ODN и лимитируется каталитическим расщеплением мРНК-мишени в составе гетеродуплекса.

Случай 1. Лимитирование гибридизацией.

В этом случае процесс расщепления идёт значительно быстрей, чем гибридизация. Поэтому можно допустить предположение об установлении стационарной концентрации гетеродуплекса H, т.е.:

С другой стороны, легко увидеть (6), что:

поэтому:

То есть, в данном случае выражение для скорости расщепления мРНК совпадает по абсолютному значению с выражением скорости реакции (скорости образования условного продукта Х). Воспользовавшись этим, преобразуем выражение для скорости изменения концентрации олигонуклеотида, мы увидим, что его концентрацию можно считать практически неизменной:

Воспользовавшись выражением (14) и, как следствие, пренебрегая вкладом члена k_-1С_H в находим скорость расщепления мРНК в новом виде и выражаем k_eff.

Случай 2. Лимитирование каталитическим расщеплением субстрата.

В случае, когда расщепление идёт значительно медленнее образования гетеродуплекса, можно считать, что успевает установиться равновесие.

Равновесной концентрацией гетеродуплекса можно пренебречь по сравнению с константой Михаэлиса в выражении скорости:

Записав выражение константы равновесия K₁ и уравнения материального баланса для М и О, получаем достаточно условий для решения уравнения:

где [ A ] - равновесная концентрация, С_{А 0} - исходная концентрация вещества.

С учётом (17) и (18), получаем выражения равновесных концентраций H и O:

Подставляя (21) в уравнение Михаэлиса - Ментен (16), получаем модифицированное уравнение скорости реакции:

Подставляя выражения (20), (21) и (22) в (12) и опуская громоздкие промежуточные расчеты, получаем выражение для скорости каталитического расщепления мРНК:

откуда нетрудно найти формулу эффективной константы скорости брутто-процесса:

На пути создания лекарств на основе антисмысловых ODN лежит множество преград: слабая способность к интернализации, неустойчивость к нуклеазам, токсичность и другие. Химические модификации способны устранить многие из этих проблем, но лишь частично, и трудно найти компромисс между достоинствами и недостатками какой-либо модификации. Несмотря на это, многие препараты на основе ODN прошли испытания. Первое лекарство на основе ODN - Vitravene, направленное на борьбу с цитомегаловирусной инфекции у больных СПИДом [2].

2. Материалы и методы

.1 Реактивы, используемые в работе

В работе использовались следующие реактивы: дезоксинуклеозидтрифосфаты, минеральное масло производства фирмы «Sigma» (США), N,N'-метиленбисакриламид производства «MP Biomedicals» (Германия), акриламид производства «Sigma» (США) с чистотой не менее 99%, агароза производства «MP Biomedicals» (Германия) (electrophoresis grade), трис производства фирм «MP Biomedicals» (Германия) (техн.) и «ICN Biomedicals» (США) (ultra pure grade), ЭДТА производства фирмы «ICN Biomedicals» (США), борная кислота производства «MP Biomedicals» (Германия), мочевина производства MP Biomedicals» (Германия), TEMED производства «Sigma» (США), DTT производства фирмы «Fluka Chemica» (Швейцария), цитавлон, дипиридилдисульфид производства фирм «Fluka Chemica» (Швейцария) и «Aldrich» (Германия), трифенилфосфин производства фирм «Fluka Chemica» (Швейцария) и «Aldrich» (Германия), 2-(N,N-диметиламино)-пиридин производства фирм «Fluka Chemica» (Швейцария) и «Aldrich» (Германия), триэтиламин производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США), пиренил-1-метиламин, любезно предоставленный …, соли хлорид магния, хлорид натрия, хлорид кальция, ацетат натрия, перхлорат лития персульфат аммония квалификации «ОСЧ», остальные реактивы имели квалификацию не ниже «ХЧ».

В работе использовали ферменты: ДНКаза I, свободная от РНКаз, производства фирмы «Fermentas» (Литва), обратная транскриптаза (ревертаза) MuML-V и термофильная Taq-полимераза (Taq-pol), любезно предоставленные Ходыревой С.Н.

Используемые растворители: DMSO (абс.), ацетон («ОСЧ»), диэтиловый эфир, этанол (перегн., 96 %), метанол (перегн.).

Все буферы, использованные в работе, были профильтрованы через нитроцеллюлозные мембраны фирмы «Millipore» с диаметром пор 0,45 мкм.

2.2 Олигонуклеотиды, использовавшиеся в работе

В работе были использованы олигонуклеотиды, указанные в таблице 2:

Таблица 2. Последовательности используемых в работе олигонуколеотидов.

Олигонуклеотиды были синтезированы в ИХБФМ СО РАН и очищены с помощью ВЭЖХ. Чистоту олигонуклеотидов тестировали с помощью электрофореза в 18% GFFU в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотидов в геле проводили с помощью краски «Stains-All».

2.3 Буферные растворы, использовавшиеся в работе

Таблица 3. Состав буферных растворов, использовавшихся в работе.

2.4 Разделение олигонуклеотидов с помощью ВЭЖХ

ВЭЖХ проводили на хроматографе «Waters 2996», на колонке длиной 150 мм с обращено-фазовым сорбентом Symmetry^® C₁₈ с диаметром микрочастиц 5 мкм, в линейном градиенте ацетонитрила в воде (0 - 30%) в присутствии 50 мМ LiCLO₄; скорость потока 1 мл/мин.

2.5 Электрофорез нуклеиновых кислот

2.5.1 Электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ в денатурирующих условиях

В экспериментах для разденения реакционных смесей и анализа изменении подвижности олигонуклеотида при конъюгации с лигандом использовали электрофорез в 12%, 16% и 18% полиакриламидном геле (GFFU) при массовом соотношении N,N'-метиленбисакриламид / акриламид 20:1 в присутствии 8 М мочевины и 1-кратного буфера TBE при напряжённости электрического поля 15 - 45 В/см. При анализе олигонуклеотидов и их пиренильных производных гель окрашивали в растворе «Stains-All» (0,5 г красителя «Stains-All» в 200 мл 50% водного формамида) в течение 10 минут в темноте. Обесцвечивание геля проводили в воде на ярком свету.

2.5.2 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

Разделение фрагментов ДНК - продуктов ПЦР, проводили с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле в присутствии 1-кратного буфера TBE и 0,002 %(объ.) бромистого этидия при комнатной температуре и напряжённости электрического поля 5 - 10 В/см. Визуализацию ПЦР продуктов проводили на трансиллюминаторе за счёт разгорания флюоресценции молекул бромистого этидия при интеркаляции дцДНК.

2.6 Приготовление цитавлоновых солей олигонуклеотидов

Для получения цитавлоновых солей олигонуклеотида готовили раствор, содержащий 1 - 6,5 о.е. олигодезоксирибонуклеотида в 90 мкл воды. Расчет добавляемого в реакционную смесь 2% водного раствора цитавлона производили с учётом 2,5-кратного избытка цитавлона по отношению к суммарному количеству атомов фосфора в составе 5’-концевого фосфата и фосфодиэфирных связей олигодезоксирибонуклеотида. Раствор цитавлона добавляли порциями, причём после добавления каждой должен выпадать белый осадок, что свидетельствует о протекании реакции.

Добавляли сначала 1/3 рассчитанного объёма раствора цитавлона к раствору олигодезоксинуклеотида, реакционную смесь перемешивали и центрифугировали при комнатной температуре в течение 5 минут с круговой частотой, равной 12500 об/мин.

После этого в реакционную смесь вносили 1/4 рассчитанного объёма раствора цитавлона, повторяли перемешивание и центрифугирование.

Аналогичные действия выполняли и при добавлении 1/6 рассчитанного объёма раствора цитавлона.

После последнего центрифугирования супернатант отбрасывали, а к осадку добавлялои 100 мкл метанола.

Метанол выпаривали на вакуумном испарителе, полученную соль олигонуклеотида высушивали над P₂O₅ в вакуумированном эксикаторе.

2.7 Получение биспиренилного производного олигонуклеотида

Конъюгаты получали согласно модифицированной методике [30]

Активация. Реакционная смесь содержала 1 - 4 о.е. (5 - 20 нмоль) цитавлоновой соли олигодезоксирибонуклеотда и по 10 мг высушенных DMAP, PPh₃ и (PyS)₂. Активацию 5’-концевого фосфата проводили следующим образом: сначала 4 раза повторяли термостатирование при 50 ºС в течение 1 - 1,5 мин и последующее интенсивное перемешивание в течение 5 - 10 с, затем инкубировали при 37 ºС в течение 15 мин.

Конъюгация. К раствору олигонуклеотида с активированным 5’-концевым фосфатом добавляли пиренилметиламин (2 мг), высушенный в эксикаторе над P₂O₅ под вакуумом. Реакционная смесь непрерывно перемешивали в течение 2 часов при 56 ºС.

Выделение продукта. Продукты осаждали из раствора 1,2 мл диэтилового эфира, растворяли в 50 мкл 3 М водного раствора перхлората лития, переосаждали 1,2 мл смеси диэтилового эфира и 2% раствора перхлората лития в ацетоне (1:1) и растворяли в 50 мкл воды. Смесь продуктов реакции разделяли с помощью обращено-фазовой хроматографии в градиенте ацетонитрила (см. 2.4). Фракции анализировали методом задержки в геле с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях.

2.8 Выделение суммарной РНК из клеток

2.8.1 Выделение суммарной РНК методом хлороформ-фенольной экстракции

Суспензию клеток центрифугировали при 4 ºС с круговой частотой 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, к осадку клеток добавляли 500 мкл буфера PBS, полученную суспензию центрифугировали при 4 ºС с круговой частотой 1000 об/мин в течение 10 мин. К осадку добавляли буфер для лизиса из расчета 200 мкл/10⁶ клеток и инкубировали во льду в течение 13 мин. Затем суспензию центрифугировали при 4 ºС с круговой частотой 13000 об/мин в течение 10 мин, осадок отбрасывали. К полученному раствору добавляли десятую часть его объёма раствора ацетата натрия с pH = 4,2. Дважды проводили фенольную экстракцию и один раз - экстракцию смесью фенола и хлороворма в объёмном отношении 1:1, каждый рас отбрасывая органическую фазу. РНК из смеси осаждали тройным объёмным избытком этанола в присутствии 0,3 М ацетата аммония в течение суток при - 20 ºС. Осаждённую РНК растворяли в 50 мкл воды. Качество выделенной РНК проверяли отношением оптических плотностей на длинах волн 260 и 280 нм и разделением методом электрофореза в агарозном геле.

2.8.2 Выделение суммарной РНК с помощью набора «Gen Elute™ Mammalian Total RNA Kit» фирмы «Sigma»

Выделение РНК проводили согласно методике, прилагаемой разработчиками к набору.

Суспензию клеток центрифугировали при комнатной температуре с круговой частотой 800 об/мин в течение 3 мин, к осадку клеток добавляли 5 мкл меркаптоэтанола и 245 мкл «Lysis Solution». Суспензию фильтровали в колонке для фильтрования (Filtration Column), к фильтрованному лизату добавляли 250 мкл 70 % водного этанола. Лизат в колонке для фильтрации при центрифугировании при максимальной круговой частоте в течение 15 с, маточный раствор отбрасывается. Осадок промывается 500 мкл растворов для промывки при центрифугировании при максимальной круговой частоте в течение 15 с: сначала Wash Solution 1, затем Wash Solution 2; маточный раствор каждый раз отбрасывается. РНК из колонки элюируется 50 мкл воды. Качество выделенной РНК проверяли отношением оптических плотностей на длинах волн 260 и 280 нм (оптимальное отношение 1,8) и разделением методом электрофореза в агарозном геле. Качество выделенной РНК проверяли отношением оптических плотностей на длинах волн 260 и 280 нм и разделением методом электрофореза в агарозном геле.

2.9 Получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции

Образец РНК подвергали гидролизу ДНКазой I для очистки от остатков ДНК в присутствии 1-кратного буфера для ДНКазы I. Реакционную смесь инкубировали при 37 ºС в течение 1 ч. РНК осаждали из реакционной смеси избытком этанола в присутствии ацетата натрия. Осадок растворяли воде. Измеряли оптическую плотность очищенной РНК.

Готовили водный раствор смеси РНК и «гексапраймера» и инкубировали его в течение 3 мин при 70 ºС, затем 1,5 мин во льду. После этого к смеси добавляли остальные компоненты (буфер для ОТ, dNTP, DTT, ревертаза MuMLV). Концентрации компонентов в РС приведены в табл. 4.

Таблица 4. Состав РС для ОТ.

РС инкубировали 10 минут при комнатной температуре, затем 1 час при 42 ºС, затем, для гидролиза остатков РНК, 10 минут при 70 ºС. Качество полученной кДНК оценивали методом ПЦР с использованием специфических пар праймеров.

2.10 Проведение полимеразной цепной реакции

Амплификацию производили с использованием кДНК-матрицы и специфической к ней пары праймеров. Готовили реакционную смесь, содержащую dNTP, прямой и обратный праймеры, Taq-полимеразу и ДНК-матрицу в присутствии 1-кратного буфера для ПЦР. Реакционную смесь помещали в термоциклер «Терцик» фирмы «ДНК-Технология» (Россия) с установленной программой изменения температуры: 1 цикл: 94ºС, 3 мин, затем 27 циклов: 94 ºС, 45 с, Т_отжига (варьируется в разных экспериментах), 30 с, 72ºС, 30 с, и последний цикл: 72 ºС, 2 мин. Визуализацию проводили методом электрофореза в агарозном геле.

2.11 Подбор условий проведения ПЦР с парами праймеров EGFP-1,2, EGFP-3,2 и EGFP-5,6

2.11.1 Сравнение эффективности амплификации при использовании пар праймеров EGFP-1,2, EGFP-3,2 и EGFP-5,6

Праймеры EGFP-1,2,3,5,6 были подобраны с помощью программы Primer 3.

При сравнении эффективности амплификации при использовании пар праймеров EGFP-1,2, EGFP-3,2 и EGFP-5,6 в качестве ДНК-матрицы использовали кДНК BHK, полученная путём обратной транскрипции суммарной РНК, выделенной из клеток линии BHK и очищенная от ДНК ДНКазой I. Как отрицательный контроль бралась вода. Амплификацию проводили при температуре отжига 57 ºС и концентрацией компонентов:

Таблица 5. Состав РС для ПЦР.

Визуализацию продуктов ПЦР проводили с помощью метода электрофореза в агарозном геле. По относительной интенсивности бендов судили об относительной эффективности амплификации.

2.11.2 Подбор оптимальных температуры отжига и концентрации хлорида магния

Готовили 24 реакционные смеси, каждой из которых для удобства и наглядности было присвоено условное название. Названия реакционных смесей приведены в таблице 6.

Таблица 6. Обозначения реакционных смесей.

Для каждой реакционной смеси проводили ПЦР. Визуализацию продуктов ПЦР проводили с помощью метода электрофореза в агарозном геле. По относительной интенсивности бендов судили об относительной эффективности амплификации.

2.11.3 Подбор оптимальных концентраций дезоксинуклеозидтрифосфатов и праймеров

Готовили 10 реакционных смесей с разными условиями проведения реакции. Для удобства и наглядности каждой реакционной смеси присваивали условное название. Контрольный эксперимент (реакционная смесь «0») проводили при максимальной концентрации праймеров (0,5 мкМ) и dNTP (1 мМ) в отсутствие ДНК-матрицы. Названия реакционных смесей, содержащих матрицу приведены в таблице 7.

Таблица 7. Обозначения реакционных смесей.

Для каждой реакционной смеси проводили ПЦР. Визуализацию продуктов ПЦР проводили с помощью метода электрофореза в агарозном геле. По относительной интенсивности бендов судили об относительной эффективности амплификации.

3. Результаты и обсуждения

Метод подавления экспрессии гена, используя антисмысловые олигонуклеотиды, предложен более 15 лет назад [], однако работы над его оптимизацией остаются актуальными и в настоящее время. Антисмысловые олигонуклеотиды являются потенциальными терапевтическими агентами, подавляющими экспрессию патогенных белков. За последние 15 лет развитие биоорганической химии позволило получить ряд химически модифицированных олигонуклеотидов, обладающих улучшенными биологическими свойствами по сравнению с немодифицированными антисмысловыми ODN: большей устойчивостью к действию нуклеаз, образованием стабильных гетеродуплексов, способностью проникать в клетку.

Эксперимент по «выключению» гена антисмысловыми олигонуклеотидами включает в себя несколько этапов:

1.  Выбор и проведение необходимых для эффективного антисмыслового действия химических модификаций олигонуклеотида.

2.      Оптимизация условий проведения ОТ ПЦР реального как метода, количественно измеряющего количество молекул РНК, содержащих ген-мишень.

.        Доставка антисмыловых олигонуклеотидов в клетки.

.        Количественная характеристика антисмыслового действия: сравнение количества мРНК-мишени в клетках, обработанных модифицированным и немодифицированным олигонуклеотидами, и в интактных клетках.

Если количество мРНК-мишени в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, мало по сравнению с количеством мРНК-мишени в интактных клетках, то антисмысловой олигонуклеотид эффективно подавляет экспрессию гена-мишени. Адекватно подобранный ряд химических модификаций должен усиливать антисмысловой эффект.

Антисмыловой агент, эффективно ингибирующий продукцию патогенного белка, должен пройти ещё ряд доклинических и клинических испытаний, прежде чем стать продажным медикаментом.

В настоящей работе в качестве модели исследования был выбран ген EGFP, продуцирующий флюоресцирующий белок. Преимуществом выбранной модели является возможность измерения экспрессии гена-мишени двумя методами: ОТ ПЦР и измерение интенсивности флюоресценции, производимой белком, кодируемым геном-мишенью.

Был проведён синтез 5’-монопиренильных конъюгатов двух антисмыловых ODN, адресованных к мРНК-мишени (EGFP-A, EGFP-B), и одного «смешанного» (scrambled) олигонуклеотида (Scr-1), содержащего разбросанные и перемешанные участки антисмысловой последовательности. Также были оптимизированы условия проведения ОТ ПЦР как метода диагностики наличия генов EGFP в образцах РНК, выделенных из клеток.

3.1 Синтез пиренильных производных олигодезоксинуклеотидов

Синтез проводили по методике, описанной в п. 2.7. Процедуру конъюгации можно разделить на 2 этапа: активация 5’-концевого фосфата (рис. 15, а,б) и присоединение производного пирена (рис 15, в). Механизм реакции можно представить следующей схемой:

Рис. 15. Механизм присоединения пиренил-1-метиламина к 5’-концевому фосфату олигонуклеотида.

Рис. 16. а - хроматограмма монопиренильного производного ODN EGFP-B; б - УФ спектры поглощения продуктов, содержащихся в пиках (1) и (2).

Были получены и охарактеризованы методом задержки в геле и УФ-спектрометрией конъюгаты ODN и пиренил-1-метиламина. Задержка в геле, УФ спектры и спектры флюоресценции свидетельствуют о получении монопиренильных производных.

Анализ продуктов методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях показал зелёное флюоресцентное свечение бенда в геле, характерное для пиреновых конъюгатов, и небольшую задержку конъюгатов в геле по сравнению с исходными олигонуклеотидами, что характерно для монопроизводных.

3.2 Сравнение эффективности выделения РНК из клеток методом хлороформ-фенольной экстракции и с помощью набора Gen Elute™ Mammalian Total RNA Kit» фирмы «Sigma»

Были получены суспензии клеток линии R1198, содержащие по 3,6•10⁶ клеток. Из каждой суспензии клеток выделяли «суммарная» РНК обоими методами и сравнивали эффективность выделения. Критериями эффективности выделения служили поглощение на длине волны 260 нм (количественная характеристика) и отношение оптических плотностей на длинах волн 260 нм и 280 нм (для чистой РНК оно должно быть близко к 1,8).

В обоих случаях на агарозном геле после проведения в нём электрофореза была получена качественная картина, характерная для «суммарной» РНК:

Спектрофотометрические данные показали более эффективное выделение РНК набором Gen Elute™ Mammalian Total RNA Kit» фирмы «Sigma» по сравнению с классическим методом хлороформ-фенольной экстракции:

Таблица 8. Сравнение эффективности методов выделения РНК из клеток.

Таким образом, выделение методом хлороформ-фенольной экстракции проигрывает набору для выделения РНК фирмы «Sigma» в плане более значительного количества примесей ДНК, в 4,5 раза меньшего количества выделенной РНК и больших затрат времени на процесс выделения.

3.3 Постановка метода ПЦР для определения мРНК гена EGFP

Была проведена ПЦР с использованием пар праймеров EGFP-1,2, EGFP-3,2 и EGFP-5,6, адресованных к гену EGFP. Положительным контролем (при использовании которого достоверно идёт амплификация) являлась пара праймеров AE-7,6, адресованных к гену AML-ETO. В качестве ДНК-матрицы использовали кДНК, полученную из клеток линии R1198 и содержащую ампликоны обоих генов. На рис. 20 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после разделеня в нём продуктов ПЦР.

EGFP-1,2 (дорожки 1,2), EGFP-3,2 (дорожки 3,4),

EGFP-5,6 (дорожки 5,6) и AE-7,6 (дорожки 7,8).

В качестве матрицы в 2,4,6,8 использовалась кДНК клеток линии R1198,

,3,5,7 - контрольные эксперименты (без добавлен7ия матрицы в РС).

При использовании ODN EGDP-1,2 в качестве пары праймеров амплификация практически не идёт, имеет место лишь такой артефакт, как «димеры праймеров» (см. рис…). Пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 сравнимы по эффективности амплификации.

Затем для каждой пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 подбирали оптимальную температуру отжига и концентрацию хлорида магния в реакционной смеси. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.2 настоящей работы. На рис. 21 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после разделения в нём продуктов ПЦР.

Наиболее интенсивно флюоресцируют бенды на дорожках 44 для EGFP-3,2 и на дорожках 36,37 для пары праймеров EGFP-5,6, что соответствует оптимальным условиям проведения ПЦР с использованием данных пар праймеров.

Таблица 9. Подбор оптимальной температуры отжига и концентрации катионов мангия в РС.

Наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд для пары праймеров EGFP-3,2 соответствует максимальной концентрации катионов магния в реакционной смеси и, как следствие, большому количеству неспецифических продуктов («шмер», см. рис…). В то же время, сравнимые с этим бендом по интенсивности флюоресценции бенды дорожек 36 и 37, соответсвтующие продуктам ПЦР с использованием пары праймеров EGFP-5,6, характеризуются меньшим количеством неспецифических продуктов. Условия реакции, в которых получен продукт ПЦР, обнаруженный на дорожке 36, являются наиболее подходящими для выявления EGFP в образцах. Эту пару праймеров в дальнейшем мы и использовали для дальнейшей оптимизации условий проведения ПЦР.

Далее были подобраны оптимальные концертрации праймеров EGFP-5 и EGFP-6 и дезоксинуклеозидтрифосфатов в указанных выше условиях: температура отжига 59,5 ºС, а концентрация катионов магния в реакционной смеси 1,5 мМ. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.3 настоящей работы. На рис. 22 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после проведения в нём разделения продуктов ПЦР.

При максимальной концентрации (1 мМ) dNTP наблюдалось большое количество образующихся неспецифических продуктов при почти полном отсутствии основного. Интерес представляют условия «8» (наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд) и «4» (второй по интенсивности), т.е.:

Таблица 9. Подбор оптимальной концентрации праймеров и dNTP в РС.

Условия «4» более предпочтительны ввиду меньшего количества неспецифических продуктов, а также меньшего расхода реагентов.

Таким образом, оптимальные условия для обнаружения EGFP методом ОТ-ПЦР можно просуммировать в табл. 9.

Таблица 9. Оптимальные условия проведения ПЦР.

Выводы

2.      Проведено сравнение двух методов выделения суммарной РНК из клеток. Показано, что выделение суммарной РНК из клеток с использованием фирменного набора осуществляется проще, быстрее и с большим выходом, однако содержит примеси ДНК и требует стадии обработки ДНКазой. Выделение РНК с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ больше времени, затрат турда и имеет меньший выход, однако приводит к получению чистого продукта.

.        Для оценки биологического действия антисмысловых олиогуклеотидов выбран метод основанный на ПЦР. Был проведен выбор праймеров к кДНК гена EGFP исходя из оценки термодинамических параметров возможных структур, формируемых ими в растворе и условий взаимодействия с мишенью с последующим тестированием их в условиях эксперимента. Для наиболее эффективной пары праймеров проведена оптимизация условий ПЦР и определены оптимальные параметры.

Список литературы

1.  A.D. Branch (1996). A Hitchhiker’s Guide to Antisense and Nonantisense Biochemical Pathways. Hepatology, 24: 1517-1529.

2.      U. Galderisi, A. Cascino, A. Giordano (1999). Antisense Oligonucleotides as Therapeutic Agents. J. Cell. Physiol, 181: 251-257

.        M. Manoharan (2002). Oligonucleotide Conjugates as Potential Antisense Drugs with Improved Uptake, Biodistribution, Targeted Delivery, and Mechanism of Action. Antisense & nucleic acid drug development, 12:103-128

.        I.M. Lagoja, P. Hedrdewijn (2007). Use of RNA in drug design. Expert Opin. Drug Discov. 2(6): 889 - 903.

.        C.M. Roth, M.L. Yarmush (1999). Nuclear acid biotechnology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 01:265-297

.        Byong Hoon Yoo, Elena Bochkareva, Alexey Bochkarev, Tung-Chung Mou, Donald M. Gray (2004). 2’-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research, 32(6): 2008 - 2016.

.        Chrissy E. Prater, Paul S. Miller (2004). 3′-Methylphosphonate-Modified Oligo-2′-O-methylribonucleotides and Their Tat Peptide Conjugates: Uptake and Stability in Mouse Fibroblasts in Culture. Bioconjugate Chem., 15: 498−507.

8.      P.A. Morcos (2003). Morpholino oligos can block translation or nuclear processing of mRNA. Gene Tools, LLC.

.        F. E. Cotter (1997). Antisense therapy for lymphomas. Hematological Oncology, 15: 3-11

.        C.A. Stein, R. Narayanan (1996). Antisense oligodeoxynucleotides: Internalization, compartmentalization and non-sequence specificity. Perspectives in Drug Discovery and Design, 4: 41 - 50.

.        B.R. Shaw, J. Madison, A. Sood, B.E. Spielvogel (1993). Oligonucleoside Boranophosphate (Borane Phosphonate). Methods in Molecular Biology, 20: 225 - 243.

.        J. Summerton (1999). Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independent structural type. Biochimica et Biophysica Acta, 1489: 141 - 158.

.        H. Inoue, M. Shimizu, T. Furukawa, T. Tamura, M. Matsui, E. Ohtsuka (1999). Site-Specific RNA Cleavage Using Terpyridine·Cu(II)-Linked 2’-O-Methyloligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 18(6&7): 1503 - 1505.

.        V.Vlassov, T. Abramova, T. Godovikova, R. Giege, V. Silnikov. Sequence-Specific Cleavage of Yeast tRNA^Phe with Oligonucleotides Conjugated to a Diimidazole Construct (1997). Antisense & Nucleic Acid Drug, 7: 39 - 42.

.        M.A. Reynolds, T.A. Beck, P.B. Say, D.A. Schwartz, B.P. Dwyer, W.J. Daily, M.D. Metzler, R.E. Klem, L.J. Arnold Jr (1996). Antisense oligonucleotides containing an internal, non-nucleotide-baced linker promote site-specific cleavage of RNA. Nucleic Acids Research, 24(4): 760 - 765.

.        M. Prhavc, T.P. Prakash, G. Minasov, P. Dan Cook, M. Egli, M. Manoharan (2002). 2′-O-[2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethyl] Modified Oligonucleotides: Symbiosis of Charge Interaction Factors and Stereoelectronic Effects. Organic Letters, Vol. 5, No. 12, pp. 2017 - 2020.

.        Kaur H, Arora A, Wengel J, Maiti S. (2008). Thermodynamic, counterion and hydration effects for the incorporation of locked nucleic acid (LNA) nucleotides in duplex. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 52: 425 - 426.

.        B. Vester, J. Wengel (2004). LNA (Locked Nucleic Acid): High-Affinity Targeting of Complementary RNA and DNA. Biochemistry, 43(42): 13233 - 13240.

19.    J. Kurrek, E. Wyszko, C. Gillen, V.A. Erdmann (2002). Design Of Antisense Nucleotides Stablized By Locked Nucleic Acids. Nucl. Acids Res., 30(9): 1911 - 1918.

20.    Lidia C Boffa, Elisabetta M.Carpaneto, Benedetta Granelli, Maria R. Mariani (2000). PNA (peptide nucleic acid) anti-gene/antisense can access intact viable cells and downregulate target genes. Gene Ther Mol Biol, 5: 47-53.

.        Bianca L. Gebski, Chrisopher J. Mann, Susan Fletcher and Stephen D. Wilton (2003). Morpholino antisense oligonucleotide induced dystrophin exon 23 skipping in mdx mouse muscle. Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811

.        W. Michael Flanagan, John J. Wolf, Peter Olson, Debbie Grant, Kuei-Ying Lin, Richard W. Wagner, Mark D. Matteucci (1999). A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 3513-3518.

23.    K.-H. Hung, A. Marx (2005). Nucleotide analogues as probes for DNA polymerases. Cellular and Molecular Life Sciences, 62: 2080 - 2091.

24.    P. Chaltin, A. Margineanu, D. Marchand, A. Van Aerschot, J. Rozenski, F. De Schryver, A. Herrmann, K. Müllen, R. Juliano, M. H. Fisher, Hyunmin Kang, S. De Feyter, P. Herdewijn (2005). Delivery of Antisense Oligonucleotides Using Cholesterol-Modified Sense Dendrimers and Cationic Lipids. Bioconjugate Chem , 16: 827−836.

.        Martin K. Bijsterbosch, Muthiah Manoharan, Rick Dorland, Richard Van Veghel, Erik A. L. Biessen, Theo J. C. Van Berkel (2002). bis-Cholesteryl-Conjugated Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides Are Highly Selectively Taken Up by the Liver. The Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics, 302(2): 619 - 626.

26.    C. Beltinger, H.Un Saragovi, R.M. Smith, L. LeSauteur, N. Shah, L. DeDionisio, L. Christensen, A. Raible, L. Jarett, A.M. Gewirtz (1995). Binding, Uptake, and Intracellular Trafficking of Phosphorothioate-modified Oligodeoxynucleotides. J. Clin. Invest., 95: 1814 - 1823.

.        M. Dizik, P. Nero, M. Metzler, D. Bubonovich, S. Sher-Rill, T. Beck, L. Borozdina, R.Hogrefe, M.M Vaghefi, M. Woodle, (1995). Pharmacokinetics of cholesterol-conjugated oligonucleotide phosphorothioates in mice. Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater. 22: 578-579.

28.    Robert L. Letsinger, Guangrong Zhang, Daisy K. Sun, Tohru Ikeuchi, And Prem S. Sarin (1989). Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: Synthesis, properties, and activity as inhibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556.

29.    P. Clivio, A. Boutorine (2004). Synthèse et études de sondes oligonucléotidiques dont le signal fluorescent est modifié au cours de l'hybridation.

30.    D. S. Novopashina, O. S. Totskaya, S. A. Kholodar’, M. I. Meshchaninova, A. G. Ven’yaminova (2008). Oligo(2'-O-methylribonucleotides) and Their Derivatives: III. 5'-Mono- and 5'-Bispyrenyl Derivatives of Oligo(2'-O-methylribonucleotides) and Their 3'-Modified Analogues: Synthesis and Properties. Russian Journal Of Bioorganic Chemistry, 34(5): 602 - 612.

.        Kostenko, E., Dobrikov, M., Komarova, N., Pyshniy, D., Vlassov, V., Zenkova, M.(2001). 5'-Bis-Pyrenylated Oligonucleotides Display Enhanced Excimer Fluorescence Upon Hybridization With Dna And Rna. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20(10): 1859 - 1870

.        E. Kostenko, M. Dobrikov, D. Pyshnyi, V. Petyuk, N. Komarova, V. Vlassov, M. Zenkova (2001). 5’-bis-pyrenylated oligonucleotides displaying eximer fluorescence provide sensetive probes of RNA sequence and structure. Nucleic Acids Res., 29(17): 3611 - 3620.

.        Akinori Kuzuya and Makoto Komiyama (2000). Non-covalent ternary systems (DNA-acridine hybrid/DNA/ lanthanide(III) for efficient and site-selective RNA scission. Chem. Commun. (Cambridge), 20: 2019-2020.

.        S. Patrick Walton, Gregory N. Stephanopoulos, Martin L. Yarmush, and Charles M. Roth (2002). Thermodynamic and Kinetic Characterization of Antisense Oligodeoxynucleotide Binding to a Structured mRNA. Biophysical Journal, 82: 366-377

.        S.P. Walton, G.N. Stephanopoulos, M.L. Yarmush, C.M. Roth (1999). Prediction of Antisense Oligonucleotide Binding Affinity to a Structured RNA Target. Biotechnol Bioeng 65: 1-9, 1999.