Производство лечебно-профилактических сывороток и иммуноглобулинов

Производство лечебно-профилактических сывороток и иммуноглобулинов

План

Введение

История развития искусственной пассивной иммунизации

Характеристика сывороток и иммуноглобулинов

Классификация и получение сывороток и иммуноглобулинов

Основные принципы гипериммунизации

Основные принципы грундиммунизации

Методы введения антигена при получении сывороток

Очистка и концентрация сывороток

Характеристика иммунодиагностических препаратов

Виды серологических иммунных реакций

Реакция агглютинации (РА)

Реакция преципитации

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция нейтрализации

Основные принципы производства иммунодиагностикумов

Характеристика моноклональных антител

Заключение

Список использованных источников

Введение

сыворотка антиген иммунодиагностикум антитело

Одним из наиболее важных факторов в возникновении научной медицины в 19-м столетии было все более широкое признание существования возбудителей болезней. Согласно этой теории, возбудители инфекций возникают не путем самопроизвольного зарождения, а воспроизводятся из себе подобных и являются этиологическими факторами конкретных и воспроизводимых нозологических форм. Луи Пастер (Louis Paster), развивая свои великолепные исследования о природе и способах предотвращения болезни шелковичных червей, а также болезней вина и пива, вступил в борьбу, чтобы убедить ученый мир в правильности своей теории возбудителя. Его сообщение в 1880 г. о возможности профилактической иммунизации против куриной холеры знаменует возникновение научной иммунологии.

На сегодняшний день существует всего два способа, применение которых обеспечивает индифферентность организма к заболеванию передающемуся инфекционным путем - это активная и пассивная иммунизация. Пассивная иммунизация обеспечивается путем переноса от одного организма (уже перенесшего данное инфекционное заболевание) к другому антител. Однако, концентрация антител постепенно уменьшается и иммунизированный организм не в состоянии восполнить их начальную концентрацию, а значит постепенно такая защита исчезает. Для такой иммунизации активно используются лечебно-профилактические сыворотки, получаемые, в основном, из крови животных-доноров. Применение гипериммунных сывороток для лечения ряда бактерийных инфекций (дифтерия, скарлатина, столбняк, дизентерия, сибирская язва), проведенное в конце XIX в., обусловлено было исследованиями в области иммунологии и, в частности, учением о специфических антителах. С проведением первых наблюдений, касающихся терапевтической эффективности специфических сывороток, начало формироваться направление прикладной иммунологии, получившее название сывороточного дела. [1]

История развития искусственной пассивной иммунизации

В конце 80-х годов 19 столетия, особенно в последнее десятилетие, открытия новых бактериальных возбудителей болезней следовали одно за другим с нарастающей частотой, и доказательства их этиологической роли обыч но удовлетворяли требованиям коховской триады. Как только удавалось получить культуру возбудителя на искусственной питательной среде, возникала возможность приготовить соответствующую вакцину из ослабленных или убитых микробов для профилактики данной болезни. Но как показал Пастер (Pasteur) в 1885 г. в своих знаменитых работах по бешенству, выделение возбудителя не является абсолютно необходимым. Так и не добившись успеха в выделении возбудителя бешенства, Пастер тем не менее сознавал, что тот должен присутствовать в головном и спинном мозге зараженных животных, поскольку введение такого мозга нормальным животным вызывало у них заболевание. Вслед за этим Пастер предложил метод ослабления (аттенуации) возбудителя бешенства путем хранения его в течение разных сроков и вскоре показал, что курс вакцинации с введением материала все более высокой вирулентности обеспечивает защиту от бешенства, даже если оно вызвано укусом бешеного животного.

Итак, на протяжении 80-90-х годов прошлого столетия осуществимость профилактической иммунизации была доказана для целого ряда инфекционных заболеваний. Однако попытки применить эти новые иммунологические подходы ко всем болезням принесли во многих случаях отрицательный результат. В частности, некоторые возбудители, позднее названные вирусами и риккет- сиями, было невозможно выделить существовавшими тогда методами. В других случаях, как, например, при поражении Treponema pallidum, вызывающей сифилис, хотя возбудитель и мог быть обнаружен при гистопатологическом исследовании, вырастить его на искусственной питательной среде для приготовления вакцины не удавалось. И наконец, были такие заболевания, как дифтерия и туберкулез, при которых сам возбудитель можно было вырастить и использовать для иммунизации, но это не обеспечивало защиты от инфекции, а иммунизация микробами типа холерного вибриона для профилактики холеры у человека оказалась малопригодной.

Значительный успех был достигнут в 1888 г., когда Эмиль Ру и Александр Йерсен (Emile Roux, Alexandre Yersin) сумели выделить растворимый токсин из надосадочной жидкости культур дифтерийной палочки. Этот токсин при введении экспериментальным животным вызывал всю картину дифтерии; стало очевидным, что по крайней мере иногда болезнь вызывает не сам микроб как таковой, а вырабатываемый им экзотоксин. После этого понадобилось немного времени, чтобы Беринг (Behring) и его сотрудник Китасато (Kitasato) развили эти наблюдения, и в 1890 г. они сообщили, что после иммунизации дифтерийным или столбнячным токсином в крови животных появляется нечто, способное нейтрализовать или разрушить токсин и тем самым предотвратить заболевание. Антитоксические сыворотки животных вскоре испытали на больных детях. Эффект был поразительным. Дети быстро выздоравливали, особенно если сыворотка вводилась на ранних сроках заболевания. Вещество, которое вызывало обезвреживание токсина, получило название анти-токсина, а вскоре для обозначения этого нового класса веществ был введен более общий и менее обязывающий термин - анти-тело. То, что вызывает образование этих антител стали называть анти-геном.

Данные фон Беринга об эффективности терапевтического применения антитоксина сразу же убедили медицинский мир, а всеобщий характер этого явления был подтвержден наблюдениями Пауля Эрлиха (Paul Erlich), который показал, что иммунизация животных токсинами растительного происхождения - рицином и абрином - также приводит к образованию нейтрализующих антитоксинов. Аналогичные токсины стали искать при других инфекционных заболеваниях, но вскоре было установлено, что этот новый терапевтический

В 1890г. Е. Behring и Sh. Kitasato, иммунизируя кроликов столбнячным токсином, установили появление антитоксических свойств у сыворотки и показали, что введение этим животным 20 ДLm столбнячного токсина не вызывает заболевания. В том же году этими же авторами было показано наличие дифтерийного антитоксина в крови морских свинок, получавших сублетальные дозы дифтерийного токсина. Через год после этого открытия Е. Behring путем иммунизации лошадей впервые получил лечебную противостолбнячную сыворотку, а уже в 1893 г. С. П. Федоров и Ф. Н. Ремезов провели подобные же наблюдения в России. В 1892 г. Е. Behring и К. Wernieke была получена противодифтерийная сыворотка. В России указанная сыворотка была приготовлена на лошадях одновременно в разных городах - Г. К. Габричевским (1895) в Москве, А. Д. Павловским и А. М. Максутовым (1895) в Киеве, С. К. Дзержговским (1895) в Петербурге, В. В. Родзевичем (1897) в Самаре, П. В. Бутягиным (1897) в Томске. В этот же период были предложены сыворотки против змеиного яда (A. Calmette, 1895), стрептококковой инфекции (А. Marmorek, 1895; Н. Aronson, 1896), противодизентерийная (Н. Shiga, 1898) и сибиреязвенная (Скляво, 1895).

Первые попытки получения специфической сыворотки против газовой инфекции были предприняты в 1910 г. М. Weinberg. Автор проводил иммунизацию морских свинок постепенно возрастающими дозами Cl. perfringens и установил, что хотя сыворотка этих животных и не обладала агглютинирующими и бактерицидными свойствами, но выявляла слабовыраженный превентивный эффект. Более активный препарат был получен этим же исследователем только в 1915 г. вначале на баранах, а затем на лошадях.

В конце XIX в. начали предприниматься первые попытки по изучению возможности изготовления специфической сыворотки против бешенства (Babes, Lepp, 1889), а уже в 1891 г. Babes и Archez применили сыворотку иммунизированных собак для профилактики бешенства у 12 лиц, покусанных больным волком, и сообщили, что введение им 40 - 60 мл сыворотки обеспечило предупреждение заболевания у 11 человек. В дальнейшем достаточно активная сыворотка была получена от кроликов и баранов (A. Marie, 1905).

Позже исследованиями S. Ftexner (1910), S. Flexner, P. Lewis (1910), A. Petit (1918) было показано, что введение вируса полиомиелита козам, овцам и лошадям приводит к выработке специфических антител, способных нейтрализовать вирус в достаточно больших концентрациях. В дальнейшем были получены специфические гипериммунные сыворотки против вирусов оспы (Albreshoff, 1928), желтой лихорадки (G. Bauer, N. Hudson, 1930; A. Petit, G. Stefanopoulo, 1933). гриппа (P. Laidlaw с соавт., 1935), клещевого (Е. Н. Левкович, М. П. Чумаков, 1937) и японского (И. М. Родин, Л. И. Мартьянова, 1956) энцефалитов, чумы, (А. И. Желтенков, 1946) и других опасных для человека вирусных и бактерийных заболеваний.

Также предложен метод изготовления антилимфоцитарной сыворотки на лошадях (R. Реrреr с соавт., 1967), ослах (У. А. Арипов с соавт., 1970), козах (N. Kashiwadi с соавт., 1968) и других животных.

Серьезное внимание уделялось изготовлению различных диагностических сывороточных препаратов и асцитических жидкостей. Так, проводились исследования по отработке условий изготовления агглютинирующих сывороток к холерному вибриону (М. Gruber, N. Durham. 1896) и брюшному тифу, дизентерии (Р. В. Фрадкина, Н. Г. Шейнман, 1937; Д. Штибен, В. Г. Багликова, 1934), ботулинической (С. А. Зелевинская, 1935) и газовой (С. И. Наследышева, 1935) инфекций. [1,2]

Характеристика сывороток и иммуноглобулинов

Мощным средством экстренной профилактики и лечения многих заболеваний, прежде всего инфекционных, являются нормальные и специфические иммуноглобулины, сыворотки, плазма и моноклональные антитела. В практике здравоохранения применяются гомологичные (человеческие) и гетерологичные (лошадиные и др.) иммуноглобулины и сыворотки.

Пассивная иммунизация дает быстрый и хороший эффект, особенно в сочетании с антибиотикотерапией. Такой способ иммунопрофилактики используется в качестве превентивной меры при опасности заражения в эпидемические сезоны и в стрессовых ситуациях, а также при сепсисе, токсических состояниях и др. Сывороточные препараты применяются для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций, лечения первичных и вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных, аллергических, дерматологических заболеваний, подавления реакции отторжения пересаженных органов и тканей. В зависимости от вида и тяжести инфекции сывороточные препараты вводят внутримышечно, внутривенно или через рот.

К сожалению, сывороточные препараты создают непродолжительный пассивный иммунитет, он возникает сразу же после внутривенного введения препаратов, при местном их введении антитела в крови достигают защитного уровня через 12-44 ч после инъекции. Гомологичный иммуноглобулин создает иммунитет на 4-5-й нед и не вызывает сильных побочных реакций.

Специфические иммуноглобулины оказывают не только прямое действие на возбудителя инфекции, они обладают выраженным неспецифическим иммуномодулирующим свойством. Оно зависит прежде всего от присутствия в препаратах биологически активных веществ (лизоцим, компоненты системы комплемента, цитокины и др.) Гетерологичные препараты имеют ряд недостатков, они быстро исчезают из циркуляции, иммунитет, созданный ими, сохраняется не более 2 нед. Препараты обладают сильными аллергенными свойствами, перед их введением необходимо ставить кожные пробы для выявления повышенной чувствительности к гетерологичному белку. Российскими производителями осуществляется выпуск широкого спектра сывороточных препаратов и иммуноглобулинов. (табл 1) [3]

Таблица 1 - Отечественные сывороточные препараты, применяемые для профилактики и лечения инфекционных болезней

Классификация и получение сывороток и иммуноглобулинов

Гетерологичные (ксеногенные) антисыворотки получают путем гипериммунизации лошадей, от которых можно забрать достаточно много крови. Существуют антимикробные и антитоксические сыворотки. С целью иммунотерапии антитоксические сыворотки применяются наиболее часто. Их получают путем многократной иммунизации лошадей соответствующим анатоксином. Затем сыворотки концентрируют и очищают от балластных веществ методом ферментирования и диализа. Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (МЕ) по способности нейтрализовать определенную дозу токсина. К антитоксическим      относятся противодифтерийная, противостолбнячная, противогангренозная, противоботулиническая и противостафилококковая сыворотки.

Антитоксические сыворотки необходимо вводить как можно раньше от начала заболевания, так как антитела способны нейтрализовать токсин только до его адсорбции на клетках-мишенях. Вводят сыворотки после обязательного предварительного контроля на чувствительность к лошадиному белку по Безредко, поскольку они могут вызывать аллергические реакции, особенно при повторном введении. Контроль проводят путем постановки внутрикожной пробы с лошадиной сывороткой в разведении 1:100 в объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 20-30 минут. При отсутствии выраженной кожной реакции вводят необходимую дозу сыворотки.

Аллогенные антисыворотки получают из донорской или плацентарной крови. Из них выделяют очищенные и концентрированные иммуноглобулины. Препараты иммуноглобулинов, полученные из нормальной или иммунной сыворотки в настоящее время широко применяются в медицинской практике. Их вводят внутримышечно, а специальные, дезагрегированные иммуноглобулины - внутривенно («октагам» - IgG, «пентаглобин» - IgM). Нормальный донорский или плацентарный иммуноглобулин содержит много антител различной специфичности, направленных против всех инфекций, перенесенных донором, или образовавшихся в результате вакцинации. Как правило, такие иммуноглобулины используются для иммунотерапии затяжных, вялотекущих инфекций.

Из сыворотки крови специально иммунизированных доноров получают гипериммунные иммуноглобулины целенаправленного действия. Другой путь - отбор сывороток крови доноров, имеющих высокий уровень антител. Эти препараты содержат высокий титр антител к соответствующим возбудителям. Такие специфические иммуноглобулины направленного действия используют для экстренной иммунотерапии (ИТ) и иммунопрофилактики (ИП) столбняка, гриппа, клещевого энцефалита, стафилококковой инфекции. Например, противостолбнячный донорский иммуноглобулин используют для экстренной профилактики столбняка у людей с повышенной чувствительностью к лошадиному белку.

Другой путь создания пассивного искусственного иммунитета - это получение препаратов специфических антител на основе использования аллогенных сывороток. Начало этим работам положило применение сыворотки доноров с целью профилактики кори, а также успешное использование их цельной крови, плазмы или сыворотки для лечения ряда заболеваний инфекционной этиологии.

Иммуноглобулиновые фракции сывороток крови человека, содержащие оттитрованные антитела к инфекционным агентам (противостафилококковые, противогриппозные, противооспенные и др.). Их получают несколькими способами - путем сбора сыворотки от реконвалесцентов, специально иммунизированных доноров крови и из препаратов плазмы с высоким содержанием специфических антител, полученных после массовой иммунизации населения по эпидпоказаниям, или после вспышки инфекции (например, гриппозной). Из приготовленных в это время серий иммуноглобулина из плацентарного сырья отбирают препараты с высоким содержанием антител.

Все выпускаемые в настоящее время препараты иммуноглобулинов, изготовленные из крови человека, проверяются на отсутствие антигенов вирусов гепатита и ВИЧ-инфекции.

Среди них различают:

стандартные        (поливалентные) иммуноглобулины, преимущественно класса IgG;

препараты, содержащие IgG и обогащенные IgM или IgA;

гипериммунные препараты иммуноглобулинов, обогащенные IgG-антителами против конкретных инфектов.

Препараты внутривенного иммуноглобулина показаны для заместительной терапии при первичных иммунодефицитах (агаммаглобулинемия, при тяжелых гнойно-септических заболеваниях, аутоиммунных тромбоцитопениях. Они применяются для лечения осложненных гнойно-воспалительных аутоиммунных и аллергических заболеваний.

Существуют препараты иммуноглобулины различного производства (интраглобин, пентаглобин, октагам и др.).

Пентаглобин - обогащен IgM. Среди IgM имеются антитела против грамотрицательных и других бактерий, они эффективны как опсонины и индукторы комплементзависимого лизиса.

Иммуноглобулин человека нормальный выпускается в ампулах в виде 10%-ного раствора иммунологически активной фракции белка. Он применяется для профилактики кори, инфекционного гепатита, коклюша, менингококковой инфекции, полиомиелита потому, что обычно содержит небольшое количество антител против этих инфектов.

Иммуноглобулин человеческий противогриппозный выделяют из донорских сывороток; он предназначен для лечения токсических форм гриппа и предупреждения его осложнений.

Следующую группу иммуноглобулинов составляют препараты специфического целенаправленного действия, полученные из крови человека и предназначенные для лечения стафилококковой инфекции, клещевого энцефалита и гриппа.

Антистафилококковый иммуноглобулин человека выпускается двух видов - донорский и плацентарный. Первый получают из плазмы доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином, второй - путем отбора плацентарного сырья с высоким титром противостафилококкового антитоксина. Оба препарата выпускаются в ампулах по 5,0 мл, содержание стафилококкового антитоксина составляет 100 МЕ. Показанием к применению препарата служит наличие заболевания, вызванного патогенными стафилококками, не поддающегося лечению антибиотиками и химиопрепаратами, а также противопоказания к введению последних.

Противостолбнячный иммуноглобулин из донорской плазмы используют наряду с противостолбнячной сывороткой, изготовляемой из плазмы гипериммунизированных лошадей. С целью его получения предварительно отбирают доноров из числа лиц, иммунизированных столбнячным анатоксином. Доноров иммунизируют повторно столбнячным анатоксином и через 3 недели из их крови выделяют гамма-глобулиновую фракцию.

Специфический противоцитомегаловирусный иммуноглобулин (цитотект) применяют: при острой ЦМВ инфекции у недоношенных новорожденных и грудных детей; по показаниям детям с первичными и вторичными иммунодефицитами; для лечения ЦМВ инфекции у реципиентов после трансплантации костного мозга или органов и тканей. Выпускается по 10, 20, 50 мл. Вводят внутривенно по 2-4 мл/кг/сутки через 1 -3 дня 3-5 инъекций.

Специфический противогепатитный иммуноглобулин (гепатект) используют: для профилактики гепатита В у новорожденных от матерей-носительниц HBs Аг (параллельно применяют HBs вакцину); для экстренной профилактики гепатита В в случаях вероятного инфицирования. Выпускается 10% раствор в ампулах по 2 мл и 10 мл. Вводят внутривенно детям по 0,4 мл/кг (не менее 2 мл).

Разработаны препараты антител третьего поколения на основе моноклональных антител, получаемых из антителообразующих гибридных клеток животных и человека. Внедрение таких препаратов позволит решить многие проблемы лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Основным направлением их применения является подавление возбудителя или модификация иммунного ответа путем связывания некоторых ключевых его факторов моноклональными антителами.

Ниже перечислены некоторые варианты использования таких моноклональных антител:

антитела против респираторно-синцитиального вируса

антитела против Т-хелперов 2 типа могут использоваться в терапии ВИЧ-инфекции;

антитела против СD4+ лимфоцитов или ФНОа - в терапии ревматоидного артрита, других аутоиммунных заболеваний;

антитела против рецепторов к интерлейкину-2 - при угрозе отторжения аллотрансплантанта почки;

антитела против IgЕ - при тяжелых аллергических реакциях.

Отмечаются большие перспективы этого нового метода иммунотерапии.

[3, 4]

Основные принципы гипериммунизации

Под гипериммунизацией понимается процесс длительного введения возрастающих доз антигена с целью накопления в крови животных максимального количества защитных антител и поддержание их на достаточном уровне содержания в сыворотке крови в течение максимального по продолжительности времени. В зависимости от характера применяемого антигена принято различать антибактериальные, антитоксические и антивирусные сыворотки.

Основной целью гипериммунизации является создание таких условий, при которых становится возможным получение от продуцентов высокоактивной специфической сыворотки. Одним из важнейших моментов, обеспечивающих успех сывороточного производства, является подбор продуцентов, так как животные, и, в частности, лошади, с иммунологической точки зрения оказываются далеко не равноценными. Успех иммунизации зависит, с одной стороны, от физиологических особенностей организма продуцента, их возраста, пола, породы, физического состояния, ухода и кормления, с другой, - от условий иммунизации и эксплуатации, при этом важное значение имеют качество и доза применяемого антигена, схема иммунизации, место введения, время кровопускания и ряд других моментов.

Большая роль в успехе эксплуатации животных-продуцентов принадлежит индивидуальной иммунологической реактивности.

Проблема реактивности в иммунологии, по П. Ф. Здродовокому (1950), делится на 2 раздела. Первый включает закономерности общего порядка (факторы индивидуальности, значение питания, воздействие влияния внешней среды и т. д.), второй освещает закономерности специального характера, связанные с воздействием на организм различных иммунизаторных раздражений.

Важнейшим моментом, обеспечивающим успех производства гипериммунных сывороток, является подбор продуцентов, иммунологическая реактивность которых различна и зависит от ряда физиологических особенностей и, прежде всего, от породы, возраста и пола.

По мнению ряда специалистов сывороточного производства, порода животных-продуцентов имеет немаловажное значение и в значительной мере определяет успех иммунизации. Так, еще в 1895 г. Г. И. Габричевский при производстве противодифтерийной сыворотки подчеркивал, что чем породистее продуцент, тем быстрее и в большем титре он способен вырабатывать антитоксин.

Этой же точки зрения придерживаются ряд других исследователей, проводивших наблюдения в основном по изготовлению антитоксических сывороток (Г. В. Выгодчиков, 1943). Многие авторы при производстве антитоксических и антивирусных сывороток предпочитают использовать в качестве продуцентов лошадей донской, верхово-донской, англо-донской пород независимо от мест их заготовки. Нерентабельными продуцентами оказались лошади казахской (местной), монгольской пород и беспородные (С. Д. Роньжина, 1959; Ю. Б. Лукин, 1956; Р. М. Слободской, 1959, Л. А. Стрельникова, 1970).

Значительный материал в данном отношении накоплен в Томском институте вакцин и сывороток, в котором проводились специальные исследования по выяснению влияния породы лошадей на качество антитоксических и антивирусных сывороток. Определенный вклад в изучение влияния породы лошадей внес Р. М. Слободской (1959), который провел наблюдения над лошадьми улучшенной (помесь с орловским рысаком) - (33 лошади), донской и арабской породами (35 лошадей) и беспородными (14 лошадей), иммунизированными столбнячным анатоксином. Оказалось, что первые 3 группы животных способны вырабатывать антитоксин высокого титра и длительно удерживать его на этом уровне.

Что же касается беспородных лошадей, то у значительной части посла подъема титра до 600-700 АЕ уже после 5-6 циклов иммунизации активность сыворотки резко снижалась и лошади становились непригодными для дальнейшей эксплуатации. Продолжением этих исследований по праву следует считать наблюдения Р. А. Зиняевой (1969), которая провела анализ эффективности эксплуатации 1090 лошадей-продуцентов противостолбнячной сыворотки, находящихся под гипериммунизацией за период 1952-1968 гг. с использованием статистического аппарата теории информации. При этом удалось с большой достоверностью показать, что выход в продуценты у лошадей донской породы колеблется от 59 (Алма-Атинская область) до 89 (Красноярский край) и даже 96% (Ростовская область). Из лошадей казахской улучшенной породы установлено, что 89% животных становятся продуцентами, причем 85% - уже после 1-го цикла иммунизации с титром 300-1200 АЕ. Лошади арабской породы также дают выход в продуценты до 90%. [5]

Сравнительно низкий выход продуцентов отмечался у лошадей, заготовленных в Томской области (72%), и местной казахской породы, приобретенных в Уральской области (71%).

Основные принципы грундиммунизации

Для оценки иммунологического статуса животных проводят их грундиммунизацию. Под грундиммунизацией понимается состояние иммунитета, возникающее после первичной иммунизации соответствующим антигеном и обеспечивающее после повторного введения антигена, произведенного через оптимальный интервал времени, высокоиммунологический эффект, выражающийся в быстрой продукции соответствующих специфических антител (Г. В. Выгодчиков, 1958).

Создание грундиммунитета имеет важное значение для производства высокоактивных специфических сывороток, применяемых для профилактики и лечения ряда инфекций, и, прежде всего, дифтерии, столбняка, газовой инфекции (гангрены), ботулизма и некоторых других заболеваний. Немаловажное значение грундиммунизация имеет и при изготовлении противовирусных сывороток.

Необходимо отметить, что явление повышенной выработки специфических антител при повторном введении антигена давно было подмечено исследователями (Dungern, 1903; Cole, 1904; Dorgenson, 1905), но только в 1915 г. М. Райский установил, что животные, ранее иммунизированные чужеродной сывороткой, отвечают на повторное введение этой же сыворотки усиленной выработкой прецинитинов даже при использовании небольших ее доз.

Важное значение имеет длина интервала между повторным введением антигена, так называемый «закон интервалов», обоснованный в 1937 г. П. Ф. Здродовским. Наблюдения, проведенные в этом отношении Е. Ф. Гогиным, М. И. Игнатовой (1937), М. Вагнер, Н. Каминской (1942), Ф. М. Кац (1946), показали, что грундирование как за 2-3 месяца, так и за 2-3 года до начала иммунизации приводит к одинаковым результатам.

В настоящее время интервал между грундированием и началом цикла иммунизации еще больше укорочен и, по данным большинства авторов (не превышает 1-2 месяца.

На основании многочисленных исследований подготовительная иммунизация животных, используемых для всех видов эксплуатации, включает обязательное введение столбнячного анатоксина, так как он не только предохраняет лошадей от спонтанного заболевания столбняком, но вместе с тем создает резерв подготовленных для соответственной иммунизации животных при постановке их под данный вид иммунизации. Грундирование лошадей столбнячным анатоксином проводится двукратно в дозах 10-20 мл с 1%-ными квасцами с интервалом 15-20 дней.

Вместе с этим нельзя обойти молчанием данные некоторых исследователей, не установивших положительного влияния грундиммунизации на усиление иммунологической реактивности организма. Так, Н. П. Ефимова (1955) провела наблюдения на 2 группах продуцентов противодифтерийной сыворотки. При этом одна - получала анатоксин без предварительной подготовки, а вторая - трехкратно грундировалась соответствующим антигеном. Оказалось, что в контрольной группе лошадей титр антитоксина был от 300 до 1700 АЕ и удерживался на этом уровне длительное время. В группе опытных лошадей титр антител не превышал 900 АЕ и, достигнув максимума к 2-3 циклам, снижался. По мнению этих авторов, грундиммунизация связана с явлением угнетения иммунологической реактивности как следствием изменения чувствительности организма у грундированных животных.

Показана возможность использования для грундирования ассоциированных анатоксинов. Так, описан опыт применения с целью грундирования дифтерийно-столбнячного антигена (Б. Г. Трухманов, Е. Н. Родюкова, 1956; Ю. Б. Лукин, М. В. Евсеев, А. А. Ковшова, Г. А. Рахимов, Л. И. Афанасьев, 1965). При производстве противоботулинических сывороток с успехом применяется двукратное грундирование лошадей смесью анатоксинов, содержащих типы А, В, С и Е, в ланолине или с 1%-ными квасцами. При дальнейшей эксплуатации таких лошадей можно при необходимости свободно переводить их из-под одного типа ботулинической иммунизации под другой.

В настоящее время метод грундирования лошадей рекомендуется использовать и при получении противовирусных сывороток. Так, Ю. К. Петров, 3. Г. Пейсель наблюдали высокую продукцию противогриппозных антител у животных, если им за 2 месяца перед началом эксплуатации вводили по 15 и 20 мл гриппозного антигена. Авторы отмечали не только положительный эффект подготовки в отношении получения высокого титра антител (1:640-1:1600), но и обнаружили, что при этом затрачивается меньшее количество антигена (в 2 раза), а продолжительность цикла сокращается с 60 до 35 дней.

Предварительное введение свежим лошадям за 14-21 день до начала основного цикла иммунизации небольших доз антигена, содержащего вирус клещевого энцефалита, значительно усиливает иммунологическую реактивность животных и обеспечивает получение высокоактивной сыворотки. Такой же эффект обнаружен и при использовании лошадей и других животных, полученных из мест, где имеются природные очаги клещевого энцефалита и в крови которых содержатся специфические антитела к данной инфекции. Широко применяется метод грундирования лошадей и при производстве антирабической сыворотки (Л. А. Стрельникова, 1970) и ряда других видов противовирусных сывороток.

Таким образом, использование предварительного грундирования у лошадей-продуцентов лечебно-профилактических сывороток является оправданным и способствует наиболее эффективному получению в короткий срок высококачественных антитоксических и антивирусных сывороточных препаратов. [6]

Методы введения антигена при получении сывороток

Очень большое значение для получения высококачественной специфической сыворотки имеет схема иммунизации. Схемы, применяемые в производственных институтах, различны, но несмотря на то, что в каждом отдельном иммунизационном отделе принята определенная схема, все специалисты сходятся в одном мнении, что не может быть единой схемы для всех продуцентов, а для каждого животного должна применяться своя, с учетом особенностей иммунологической реактивности организма. Индивидуальный подход к каждой лошади, поставленной под эксплуатацию, - мысль, которая проходит красной нитью через все работы, выполненные в данной области знаний. Разнообразие схем иммунизации определяется различием методов введения антигена, его дозировкой, количеством и временем цикловых кровопусканий. Немаловажное влияние на степень антителообразования оказывают количество инъекций и интервалы между ними.

В практике производства специфических сывороток используют различные методы введения антигенов. Наиболее эффективным способом иммунизации является внутривенное вливание, позволяющее в сравнительно короткий срок получить высокотитражную сыворотку. Однако при использовании этого способа, особенно при повторных циклах эксплуатации, можно столкнуться с явлениями анафилактического шока, приводящее животное к гибели. В связи с этим при изготовлении сывороток на крупных животных чаще всего предпочитают использовать другие парэнтеральные методы введения антигенов. Наибольшее внимание при этом отдается подкожному и внутримышечному способам инъецирования, получившим широкое распространение при изготовлении антитоксических и антибактериальных сывороток.

Эффективность подкожного и внутримышечного методов иммунизации значительно повышается при условии применения дробного метода введения антигена одновременно небольшими дозами в различные участки тела животного с охватом возможно большего количества лимфоузлов. Указанное положение достаточно четко и на высоком научном уровне обосновано исследованиями, выполненными в лаборатории П. Ф. Здродовского (1961), где показано, что иммунные антитела образуются в клетках плазмоцитарного типа, находящихся в лимфатических узлах и селезенке, поэтому большее вовлечение их в иммунизаторный процесс способно интенсифицировать антителообразование. Дробный метод введения антигена с одинаковым успехом был применен при изготовлении противостолбнячной и противодифтерийной сывороток (3. Г. Пейсель, 1959; И. М. Моргунов, Е. Г. Дреслер, E. С. Тюрина, 1961), сыворотки против клещевого энцефалита (Ю. В. Федоров, 1963) и ряда других видов иммунизации.

В последнее время рекомендуется производить гипериммунизацию лошадей-продуцентов антитоксических сывороток путем постепенного вовлечения в процесс антителообразования определенных групп лимфатических узлов различной локализации и, в первую очередь, регионарных в отношении места введения антигена. Особо благоприятные условия для нарастания антитоксина в крови продуцентов создаются при поочередном вовлечении в иммунизаторный процесс различных групп лимфатических узлов при двукратном введении антигена в течение цикла. При этом первую инъекцию анатоксина рекомендуется производить в затылочную область, краниальную и каудальную части середины боковой грудной стенки одной и той же стороны лошади. Антиген из первых двух точек поступает прежде всего в пакеты поверхностных шейных, подмышечных, заглоточных лимфатических узлов, а также в глубокие нижнешейные, расположенные у входа в грудную полость и средостенные краниальные узлы. Из третьей точки антиген проникает в надколенные, латеральные, повздошные, поверхностные и глубокие паховые лимфатические узлы.

Второе введение анатоксина осуществляется в 7-8 мест с учетом поступления его в те же лимфатические узлы. В последующем цикле антиген применяют по той же схеме, но на противоположном боку лошади.

В Томском институте вакцин и сывороток на протяжении многих лет при производстве ряда гипериммунных сывороток (противостолбнячная, противодифтерийная, противоботулиническая, против газовой инфекции, против клещевого энцефалита, антирабическая) с успехом используется иммунизация животных подкожно и внутримышечно. Последние не вызывают резких отклонений в состоянии здоровья лошадей и редко сопровождаются местными и общими реакциями.

Методы эксплуатации, применяемые в различных производственных институтах, часто весьма заметно отличаются один; от другого. Однако все они преследуют общую цель - получить от одного животного-продуцента наибольшее количество сыворотки с максимальным титром антител при наименьшей ее себестоимости.

В практике сывороточного производства различают несколько основных методов эксплуатации. К ним относятся прерывистая и непрерывная, в некоторых случаях используется кратковременная или ударная (экспресс-метод) иммунизация.

Прерывистая иммунизация

Наиболее распространенным является прерывистый метод эксплуатации, когда курс иммунизации (цикл) завершается кровопусканиями с последующим предоставлением животным отдыха от 12 до 30 дней. В этот период продуценты не подвергаются никаким манипуляциям. Во время отдыха происходит полное восстановление иммунологической реактивности организма, гематологических и биохимических показателей крови, но вместе с тем наблюдается снижение титра антител чаще всего на 50-60%. Для повышения специфической активности сыворотки проводят новый, укороченный цикл гипериммунизации, состоящий, как правило, из 2-3 инъекций антигена, и вновь производят крововзятие.

При таком методе лошадь служит значительно дольше, чем при других способах эксплуатации. Этот метод является наиболее принятым в сывороточном производстве, так как позволяет длительное время эксплуатировать продуцента. Были испытаны схемы с 1, 2, 3 и 4-недельными интервалами. Оказалось, что наиболее эффективные результаты получаются при интервалах между циклами в 15-20 дней. Этого же мнения придерживаются и многие другие исследователи, проводившие наблюдения как при антитоксической , так и противовирусной иммунизациях. Используя указанный метод эксплуатации продуцентов, можно в течение года получить от одной лошади от 160 до 200 литров крови.

Непрерывная иммунизация

Широкое распространение в практике сывороточного производства получил непрерывный метод эксплуатации животных. Сущность его заключается в том, что регулярных перерывов для отдыха между циклами не делается, и кровь берется между очередными инъекциями антигена.

Указанный метод впервые был использован в Нью-Йоркском институте Wadsworth и в разных модификациях описан в отечественной литературе. Различают две разновидности непрерывной эксплуатации животных-продуцентов. Первая заключается в том, что после цикловых кровопусканий предоставляется отдых на несколько дней, вторая - когда совершенно не делается перерывов, и на следующий день, вслед за цикловыми кровопусканиями, начинается новый цикл гипериммунизации. Можно привести достаточно большое число примеров эксплуатации животных-продуцентов разных видов сыворотки указанным методом. Он был с одинаковым успехом испытан при производстве противостолбнячной и других сывороток. Подобные же результаты описаны и в области изготовления диагностических сывороток. Так, М. И. Федорович (1950), применив метод непрерывной иммунизации при эксплуатации лошадей, коз, баранов и кроликов, приготовила в короткий срок значительное количество сыворотки, не отличающейся по своим качествам от подобной, получаемой при применении прерывистого метода.

Е. Ф. Гогин и И. Е. Корчемкина (1934) указывают на целесообразность использования под непрерывный метод эксплуатации только свежих лошадей, подчеркивая рентабельность указанного метода эксплуатации. Однако учитывая, что из 17 свежих животных, находящихся под эксплуатацией, уже в течение первых 6 месяцев отошло 12 продуцентов, едва ли можно окупить их стоимость количеством взятой крови. Поэтому подавляющее число авторов приходят к выводу о необходимости использования указанного метода только у лошадей, прошедших достаточное количество циклов эксплуатации и легко переносящих процесс гипериммунизации.

Таким образом, на основании приведенного материала видно, что применение непрерывного метода эксплуатации весьма рентабельно, так как позволяет за небольшой промежуток времени получить значительное количество специфической сыворотки, обладающей достаточно высокой активностью. Однако применение его оправдано у животных-продуцентов, прошедших уже ряд циклов эксплуатации.

Очистка и концентрация сывороток

Технологическую схему очистки и концентрации антитоксических сывороток с помощью ферментолиза создал авторский коллектив во главе с А. В. Бейлинсон. Были предложены последовательно 3 схемы очистки антитоксических сывороток, включающих ферментолиз, термоденатурацию балластных белков и диализ - Диаферм. Последняя модификация метода Диаферм-3 ИЭМ АМН СССР широко применяется во всех сывороточных производствах нашей страны. При очистке этим методом ферментация белков сыворотки ведется 2 часа при температуре 23° и pH среды 3,2 и 4,2 высокоактивным ферментом.

Балластные вещества удаляются с осадком при pH 4,3 прогреванием ферментированных сывороток 45 минут при 58° в присутствии 14%-сернокислого аммония.

Ферментированный иммунный глобулин выделяется из фильтрата при pH 7,0-7,1 дополнительным высаливанием сернокислым аммонием из расчета 200 г на 1 л фильтрата. Выпавший при этих условиях осадок иммунного глобулина отфильтровывается, прессуется и подвергается диализу проточной водопроводной водой.

Для последующей очистки ферментированных белков в сыворотку добавляют хлороформ и соляную кислоту до pH 5,0-5,3.

Еще в 1945 г. А. В. Бейлинсон с соавт. отметила, что сыворотки, полученные после обработки пепсином, отличаются значительной вязкостью. Для освобождения от последней авторы применили изоэлектрическое осаждение денатурированных продуктов протеолиза при наличии в среде тонко эмульгированного хлороформа. Добавление в сыворотку после диализа 30% по объему хлороформа и энергичное встряхивание приводит в процессе осторожного и медленного подкисления к получению стабильной эмульсии хлороформа с желатинированными частицами белка, загрязняющего концентрированную сыворотку и сообщающего ей повышенную вязкость. После стояния на холоде эмульсия хлороформа в сыворотке разрушается, а желатинированные белки продолжают прочно удерживать хлороформ, погружаясь вместе с ним на дно, где образуют плотный осадок. Дополнительная очистка демонстративно видна на фореграммах. В сыворотке после диализа содержится 3 фракции белков, находящихся в зоне гамма-, бета-, и альфа-глобулинов. Дополнительная обработка ее хлороформом с последующим изоосаждением при вышеуказанном pH ведет к исчезновению фракции, лежащей в зоне альфа-глобулина, при этом оседает до 65% из противостолбнячной, до 50% - из противодифтерийной сывороток липопротеидов.

Балластный осадок удаляют центрифугированием или сепарированием, а прозрачную жидкость подщелачивают до pH 7,0, добавляют 0,8% хлористого натрия и подвергают стерилизующей фильтрации. (см табл 2)

Характеристика иммунодиагностических препаратов

Как правило, серологические реакции, обеспечивающие развитие иммунных реакций организма могут быть поставлены в двух вариантах:

с известными иммунными или гипериммунными сыворотками (диагностические сыворотки) для определения (идентификации и типизации) вирусов, выделенных из исследуемого патологического материала;

с известными антигенами (диагностикумами) для обнаружения антител и определения их количества в присылаемых для исследования сыворотках крови, взятых от больных и переболевших животных.

С помощью серологических реакций можно установить сроки появления в крови антител у вакцинированных животных и выявить динамику антителообразования. Диагностикумы - взвеси убитых микробов, которые служат в качестве антигенов при серологических исследованиях и аллергенов для аллергических диагностических проб.
Диагностикумы нашли широкое применение при диагностике брюшного тифа <#"580049.files/image001.gif">

Рисунок 1 - Классификация и цели использования реакции агглютинации (РА)

В качестве антигена в РА используют суточную взвесь живых или убитых формалином, спиртом, нагреванием бактерий (диагностикумы). Обычно для приготовления бактериальных антигенов используют S-формы культур, которые в 0,5 % растворе натрия хлорида образуют равномерную взвесь. R-формы бактерий как антигены не пригодны, так как агглютинируются спонтанно. 

Для получения агглютинирующих сывороток иммунизируют кроликов. При этом им 5-7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2-7 суток в возрастающих дозах вводят убитые бактерии. Заканчивают курс иммунизации животных 2-3 инъекциями живых бактерий. Через неделю определяют титр сыворотки - максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточен, иммунизацию продолжают.

Полученные таким путем агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения вида бактерий надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микробу в том случае, если агглютинирует его как минимум до половины титра.