Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
ПОЛУЧЕНИЕ СУПЕРПРОДУЦЕНТОВ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, РНК-ЛИГАЗЫ, ПОЛИНУКЛЕОТИДКИНАЗЫ ФАГА Т4 И ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ИЗ Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа
Содержание
Введение
. Обзор литературы
.1 Бактериофаг Т4
.2 ДНК-полимеразы
.3 Общие свойства ДНК-полимеразы фага Т4
.4 ДНК-полимераза из T. thermophilus HB8
.5 Полинуклеотидкиназа фага Т4
.6 РНК-лигаза фага Т4
. Экспериментальная часть
.1 Материалы
.2 Методы
.2.1 Амплификация последовательностей генов
.2.2 Очистка фрагментов ДНК
.2.3 Подготовка вектора
.2.4 Подготовка фрагментов ДНК
.2.5 Лигирование
.2.6 Трансформация клеток E. Сoli
.2.7 Анализ клонов
.2.8 Клонирование ДНК-полимеразы фага Т4
.2.9. Индукция экспрессии генов
.2.10 Распределение белка по растворенной и нерастворенной фракциям
.2.11 Выделение Т4 ДНК-полимеразы
.2.12 Выделение полинуклеотидкиназы фага Т4
.2.13 Выделение РНК-лигазы фага Т4
.2.14 Выделение Tth ДНК-полимеразы
.2.15 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
. Результаты и их обсуждение
.1 Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4
.2 Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы
.3 Выделение ДНК-полимеразы и полинуклеотидкиназы фага Т4
.4 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
.5 Выделение РНК-лигазы фага Т4
.6 Выделение Tth ДНК-полимеразы
.7 Активности РНК-лигазы и полинуклеотидкиназы фага Т4
Выводыписок использованной литературы
Введение
В связи с бурным развитием генной инженерии все больше возрастает значение и масштабы применения ферментов для необходимых манипуляций в этой области. Ферменты репликации ДНК- ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназа и РНК-лигаза фага Т4 приобрели важное значение как инструменты конструирования и изучения рекомбинантных ДНК.
В настоящее время среди полимераз наиболее широко используются ДНК-полимеразы фагов Т4 и Т7, ДНК-полимераза из термофила T. aquaticus. Все большее значение приобретает ДНК-полимераза из T. thermophilus.
Эти ферменты имеют свои аспекты применения и не могут быть полностью взаимозаменяемы в генноинженерных манипуляциях.
Т4 ДНК-полимераза отличается от остальных подобных ферментов тем, что обладает очень высокой корректирующей активностью т.е. редко ошибается, при этом быстро синтезирует новые цепи ДНК. 3'-5'-экзонуклеазная активность в 200-400 раз превосходит аналогичную способность фрагмента Кленова.
Т4 ДНК-полимеразу очень удобно использовать в системе ALTER для сайт-специфического мутагенеза, по этому возникла необходимость клонирования и получения полимеразы фага Т4.
В связи с бурным развитием и применением техники ПЦР огромное значение приобрели термофильные ДНК-полимеразы. Уже известно несколько таких ферментов, но не один из них не является универсальным. По этому выбор полимеразы делается в зависимости от конкретных практических задач.
На что в первую очередь обращают внимание при выборе этого инструмента генной инженерии?
) Термостабильность. Все полимеразы, используемые в ПЦР устойчивы к повышенным температурам. Для них ввели такую характеристику, как время полужизни фермента при температурах 90-100ο С. Предпочтение отдается тем полимеразам, у которых этот показатель выше, т.к. появляется возможность увеличения количества циклов в реакции.
) Скорость синтеза ДНК. Проблема амплификации длинных фрагментов ДНК решается с использованием полимераз, способных осуществлять синтез ДНК с высокой скоростью. Одними из таких полимераз являются Stoffel-фрагмент и Tth-полимераза.
) Точность синтеза: в случае клонирования каких-либо генов или фрагментов ДНК становится необходимым предотвращение ошибок в нуклеотидной последовательности синтезируемого фрагмента. Таким образом выбираются полимеразы, способные наиболее точно осуществлять синтез новых цепей ДНК. На данный момент примером могут служить Vent- и Pfu-полимеразы.
) Обратно-транскриптазная активность. В связи с необходимостью получения большого количества кДНК-копий с молекул РНК возникает проблема выбора соответствующей полимеразы. Мезофильные ревертазы иногда "не справляются" со своей задачей, т.к. в РНК могут встречаться устойчивые вторичные структуры. Сравнительно недавно открытая обратно-транскриптазная активность у некоторых термофильных полимераз (Taq, Tth) дает возможность решения данной проблемы.
В нашей лаборатории возникла необходимость амплификации протяженных фрагментов ДНК и получения кДНК-копий с молекул РНК. В связи с этим надо было получить Tth ДНК-полимеразу.
Следующие два инструмента генной инженерии- полинуклеотидкиназа и РНК-лигаза фага Т4. Оба фермента очень широко используются для различных целей. Т4 полинуклеотидкиназа осуществляет фосфорилирование 5/-OH концов ДНК (РНК), что широко применяется при секвенировании ДНК.
РНК-лигаза фага Т4 осуществляет соединение одноцепочечных молекул РНК, ДНК, или РНК с ДНК. Этот фермент широко используется при мечении 3/-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот и синтезе олигонуклеотидов с заданной последовательностью оснований. Нашей лаборатории необходим этот фермент в связи с потребностью проводить "заякоренный ПЦР" (anchored PCR). РНК-лигаза- незаменимый фермент, используемый в этом процессе.
Итак, целью нашей работы явилось получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8.
Для достижения данной цели необходимо было выполнить две задачи:
- Разработать универсальный метод клонирования фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР.
- Получить важнейшие генетические ферменты, необходимые в нашей лаборатории.
1. Обзор литературы
.1 Бактериофаг Т4
Бактериофаг Т4 относится к крупным фагам Т-четного ряда. ДНК фага Т4 линейная, двухцепочечная, имеет молекулярную массу 120*106, длину 165 тыс. пар оснований., которой достаточно для кодирования примерно 200 генов [1,2]. Было определено положение на генетической карте почти 100 генов фага (рис. 1) [1] . Для молекул ДНК фага характерна концевая избыточность (длина этих участков составляет несколько процентов от всей длины ДНК, т.е. несколько тысяч пар оснований). Молекулы ДНК фага одинаковы по величине и генетическому составу, но гетерогенны по нуклеотидной последовательности (в результате циклических перестановок генов).
Т4- очень крупный фаг, который имеет достаточно полный и независимый репликативный аппарат. В течение одной минуты после адсорбции фага Т4 синтез молекул хозяина почти полностью прекращается, начинается транскрипция некоторых фаговых генов и через 4 минуты уже идет репликация фаговой ДНК. Инфекция фагом Т4- прекрасная модель для изучения контроля репликации и экспрессии генов [1].
Репликация ДНК фага Т4 начинается в точке, расположенной между генами 42 и 43 и идет в двух направлениях. Позже возникает много точек репликации, в результате чего образуется до 60 репликативных вилок.
Одно из преимуществ использования фага Т4 как модельной системы для изучения репликации ДНК заключается в том, что все белки, необходимые для элонгации цепи, кодируются фагом. Идентифицированно 11 белков, участвующих в формировании и передвижении репликативной вилки, но только 5 из них необходимы для создания коровой системы [3]. Это продукты генов 43 (Т4 ДНК полимераза), 32 (белок, связывающий одноцепочечную ДНК), 44, 62, 45 (вспомогательные белки). Взаимодействие этих белков определяет точность репликации [1, 3].
В состав ДНК фага Т4 (и других Т-четных фагов) вместо обычного цитозина. входит необычное основание- оксиметилцитозин (ОМЦ). Большинство остатков ОМЦ глюкозилировано [1,4,5]. ДНК с такими модифицированными основаниями не разрезают почти все известные рестриктазы [4]. Ферменты рестрикции E.coli узнают неглюкозилированные остатки ОМЦ в определенных последовательностях, и разрушают такую ДНК. Т-четные фаги не только защищаются от хозяйских рестриктаз, но и кодируют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, которые не действуюют на фаговую ДНК.
Гликозилирование остатков ОМЦ в ДНК фага Т4 генетически детерминировано, оно происходит путем переноса гликозильных остатков на ДНК в течение нескольких минут после полимеризации с помощью специфических ферментов - гликозилтрансфераз. Такой способ борьбы мог возникнуть только у такого крупного фага, как Т4 [1].
1.2 ДНК-полимеразы
Ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют комплементарное копирование матрицы. Первый фермент этого типа был открыт в1956 году у E.coli. Эти ферменты последовательно наращивают конец затравки, присоединяя к нему поступающие нуклеотиды [4].
Биосинтез ДНК имеет две основные особенности:
- Фосфодиэфирная связь образуется между 3'-гидроксильной группой на конце растущей цепи ДНК, называемой затравкой, и 5'-фосфатной группой очередного дезоксирибонуклеотида. Общее направление роста цепи от 5'-конца к 3'-концу.
- Каждый дезоксинуклеотид отбирается с помощью спаривания с основанием цепи ДНК, называемой матрицей.
Очередной нуклеотид поступает в реакцию в активированной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата. В случае синтеза ДНК присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что делает реакцию в целом энергетически выгодной.
- Для синтеза ДНК необходима затравка, содержащая 3'-гидроксильную группу, инициация новых цепей невозможна.
- Под действием 3'-5'-экзонуклеазной активности полимеразы удаляется основание, которое возникает в результате ошибочного встраивания. Таким образом достигается достаточно высокая точность и надежность репликации.
- Растущая цепь и матрица антипараллельны.
- Копируется любая последовательность оснований матрицы [1].
В качестве праймера может служить не только ДНКовая но и РНКовая затравка. Т.к. ДНК-полимераза не может осуществлять синтез без затравки, то необходимо, чтобы затравка синтезировалась каким-либо другим ферментом, например, РНК-полимеразой [5].
1.3 Общие свойства ДНК-полимеразы фага Т4
Т4 ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, продуктом гена 43 бактериофага Т4. T4 ДНК-полимераза состоит из одного полипептида молекулярной массы 114 кДа [2].
Для своей активности требует ионы Mg2+ . Оптимальный рН 8-9; при рН 7.5 или 9.7 активность составляет только 50%. Фермент не активен при контактировании с двойной цепью как с матрицей. Для полимеразной активности требует одноцепочечную ДНК с затравкой, дуплексную ДНК с разрывами(повреждениями).
Определение единицы активности: Одна единица фермента включает 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимые продукты с денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК тимуса теленка как матрицей, за 30 мин при 37о С.
Для Т4 ДНК-полимеразы известен PDB-код: 1NOY.
Таблица 1. Свойства наиболее изученных полимераз [1, 6, 7,8,9,10,11,12].
ПолимеразаMr5/-3/ exo3/-5/ exoУровень ошибокНик - трансляцияСкорость удлине-нияТ опт.(οC)ПроцессивностьТемпературная инактива-ция 75οCТермостабильностьДНК-полимераза I E. Coli109++9x10-6+3750+-Фрагмент Кленова-+40x10-6-3712+-T4 ДНК-полимераза114-+<1x10-6-3712+-T7 ДНК-полимераза84-+15x10-6-371000+-Taq-полимераза94+-285x10-6+70-7540-9min 97,5οФрагмент Стоффела61---3kb/min70-755-10-21min 97,5οVent-полимераза93-+57x10-6-1kb/min707-8h 95ο 2h 100οPfu-полимераза90+ !1,6x10-60,5kb/min72-1h 95οTth-полимераза94+->Taq-pol72-
1.4 ДНК-полимераза из T. thermophilus HB8
Tth-ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, состоит из одного полипептида молекулярной массы 94 кДа. Длина полипептидной цепи 834 аминокислотных остатка. Полимераза обладает 5/-3/-экзонуклеазной активностью и не имеет 3/-5/-экзонуклеазной (корректирующей) активности [13].
Оптимум рН для ПЦР с Tth-полимеразой находится в пределах от 8,5 до 9,0 [14]. Присутствие 0,01%-ного Твина-20 значительно повышает эффективность ПЦР c участием этой полимеразы, а добавление 0,01%-ного желатина ингибирует ее. Оптимальная концентрация каждого из пары праймеров для данной системы составляет 0,3 мМ. Показана возможность амплифицировать фрагменты ДНК длиной от 500 до 8500 п. н [14].
Одно из замечательных свойств Tth-полимеразы - способность фермента осуществлять синтез ДНК по цепи РНК в качестве матрицы. То есть было обнаружено, что данная полимераза обладает обратно-транскриптазной (ревертазной) активностью. Этот факт послужил стимулом для использования этого фермента в совмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР).
Раньше часто проблематично было синтезировать к-ДНК используя мезофильные вирусные обратные транскриптазы из-за встречающихся в РНК стабильных вторичных структур. Различные методы описывают способы дестабилизации комплементарных районов: использование ДМСО, повышение температуры реакции и некоторые другие. Но добавление в реакционную смесь таких соединений и повышение температуры плохо сказывались на мезофильных ферментах.
Многие проблемы, связанные с большим содержанием вторичной структуры, присутствующей в РНК, минимизировались с использованием термостабильной ДНК полимеразы для обратной транскрипции. Стало возможным получать полноразмерные фрагменты ДНК и сразу амплифицировать их с использованием того же фермента. До Tth-полимеразы для этих целей применяли Taq-полимеразу. Но позже выяснили, что Tth-полимераза в 100 раз более активна в сопряженной реакции ОT/ПЦР [13, 15]. Чувствительность реакции, выполненной с использованием Tth-полимеразы позволяет детектировать (обнаруживать) продукт, полученный со 100 копий синтетической к-РНК [13]. В других работах удалось выявить этим же методом 103 копий РНК интерлейкина 2α (IL-2α) [15] и получить исходя из 400пг суммарной РНК кДНК для мРНКинтерлейкина 1α. Причем слабый сигнал на агарозном гель-электрофорезе наблюдали уже при введении в реакцию 80 пг суммарной мРНК, что эквивалентно 10 клеткам [16].
Эффективность ревертазной стадии ОТ/ПЦР в присутствии различных двухвалентных катионов убывает в ряду: Mn2+ > Cu2+ > Mg2+ > Cd2+ >> Co2+. Показано, что использование Mn2+ вместо Mg2+ на стадии ПЦР приводит к снижению эффективности ОТ/ПЦР. В связи с этим авторы статьи после реакции обратной транскрипции (в присутствии 1 мМ MnCl2) связывали ионы Mn2+ EGTA (так как EGTA имеет более низкое сродство к Mg2+, чем к Mn2+ и другим двухвалентным катионам) и далее проводили ПЦР в присутствии 1,5 мМ Mg2+ [15].
Процесс ОT/ПЦР оказался бесценным для выявления экспрессии генов, для амплификации последовательности РНК, последующего субклонирования и анализа, для диагностики инфекционных агентов или генетических заболеваний [13].
Очень интересна работа Игнатова К.Б с соавторами по рассмотрению различий в свойствах Taq- и Tth-полимераз и их возможная связь с аминокислотной последовательностью субдомена "большой палец" [17].Ранее был проведен сравнительный анализ консервативных областей полимеразного домена различных ДНК-полимераз и показано, что консервативный участок субдомена "большой палец" определяет способность ДНК-полимераз связываться с дуплексом матрица-праймер и влияет на процессивность фермента. Авторы сопоставили аминокислотные последовательности "большого пальца" и прилегающего к нему участка этих полимераз и Tth-полимеразы (рис. 2 ). Был заменен фрагмент Pvu I -BamH I гена Tth-полимеразы, кодирующий 492-595 аминокислотные остатки на соответствующий участок гена ДНК-полимеразы I E. coli, кодирующий 103 аминокислоты (586-688). Удалось получить экспресиию гибридного гена, продукт которого, названный Teco-полимеразой, был активен. В другом случае был заменен фрагмент Pvu I-BamH I гена Tth-полимеразы аналогичным фрагментом гена Taq-полимеразы (рис. 2), что привело к замене всех восьми неидентичных аминокислотных остатков в консервативной области "большого пальца". Новый фермент назвали Ttaq-полимеразой.
Ферментативные активности сравнивались при 72o С для Tth- и Taq-полимераз и при 52o C для Tth- и Teco-полимераз. Было обнаружено, что внесенные мутации не вызвали существенного изменения их удельной активности. Температурный оптимум Tth-, Taq- и Ttaq-полимераз находится в области 70-72o С, а Teco-полимеразы- в области 50-52o С. Tопт Teco-полимеразы на 15o С выше и на 20o С ниже Топт ДНК-полимеразы I E. coli и Tth-полимеразы соответственно. Более высокую, по сравнению с ДНК-полимеразой I E. coli, температуру функционирования Teco-полимеразы авторы объясняют влиянием термостабильных участков. Teco-полимераза является примером возможности создания функционально активных гибридов термостабильной и мезофильной ДНК-полимераз.
В работе показано, что оптимальной концентрацией Mg2+ для Taq-полимеразы является 2 мМ, а для Tth-, Ttaq- и Teco-полимеразы- 5 мМ. Далее была исследована способность полимераз амплифицировать фрагменты ДНК разной длины. ПЦР проводили при 1,5 мМ MgCl2. При амплификации относительно короткого фрагмента ДНК более эффективной оказалась Taq-полимераза, но при амплификации более протяженных участков (больше 5000 п. о.) выход продукта на единицу активности фермента в случае Tth-полимеразы был значительно выше, чем при использовании Taq- и Ttaq-полимераз. Наличие некомплементарного нуклеотида на 3/-конце синтезируемой цепи не влияет на эффективность синтеза ДНК Ttaq-полимеразой. Это свидетельствует о том, что Ttaq- так же, как и Tth-полимераза нечувствительна к наличию 3/-некомплементарного нуклеотида [17].
1.5 Полинуклеотидкиназа фага Т4
Полинуклеотидкиназа фага Т4 (EC2.7.1.78)- продукт раннего гена pseT фага Т4.
Полинуклеотидкиназа катализирует перенос γ-фосфата от АТФ на 5/-OH конец ДНК, РНК или олигонуклеотида . Минимальным субстратом может служить нуклеотид-3/- фосфат [18,19]. Фосфорилирование 5/-концов ДНК с помощью АТФ можно детектировать в экстрактах E. coli, инфицированных фагом Т4 уже через пять минут после инфекции. Максимальный уровень активности фиксируется через 20 минут после инфекции [19].
Фермент так же имеет 3/-фосфатазную активность (удаление 3/-фосфатной группы), которая предпочитает ДНК в качестве субстрата [18].
Было выявлено, что эти две активности катализируются аминокислотными остатками, локализующимисяся в разных активных сайтах полипептидной цепи [20]. Специфическое расщепление экзопептидазой выявило, что киназная активность находится в N-концевой части, а фосфатазная активность- в С-концевой части полипептидной цепи. С помощью частичного расщепления трипсином был получен фрагмент белка 29 кДа, который не обладал киназной активностью, но имел почти нормальную 3/-фосфатазную активность [20].
Реакцию, катализируемую полинуклеотидкиназой фага Т4 можно представить следующим образом:
АТФ + 5/-OH ДНК (РНК) ↔ АДФ + 5/-Ф ДНК (РНК)
Физико-химические свойства полинуклеотидкиназы.
Фермент является олигомером, состоит из четырех идентичных субъединиц (мономеров), каждая из которых сама по себе не обладает плинуклеотидкиназной активностью. Молекулярная масса мономера 33 кДа, что было определено с помощью аминокислотного анализа и SDS-гель-электрофореза [21]. Гель-фильтрацией была определена молекулярная масса активной полинуклеотидкиназы-140 кДа.
Фенилаланин является N-концевой аминокислотой. Каждый мономер содержит две SH-группы. Высокая ионная сила раствора (0,1М KCl), спермин, АТФ, тимидин-3/-монофосфат являются компонентами, стабилизирующими олигомерную структуру фермента [21].
Оптимальным рН для реакции фосфорилирования является 7,4-8,0 в Трис-буфере. При рН 7,6 в 0,07 М Na- или К-фосфатном буфере наблюдается лишь 5%-ная активность, по сравнению с активностью в Трис-буфере.
Необходимо присутствие катионов двухвалентных металлов. Оптимальная концентрация Mg2+ в реакционной смеси- 10мМ. Mn2+ может лишь частично заменять Mg2+. При использовании Mn2+ в оптимальной концентрации 3,3 мМ сохраняется 50% активности, наблюдаемой в присутствии Mg2+. В отсутствии β-меркаптоэтанола наблюдается активность, соответствующая двум процентам от максимальной активности [21].
Оптимальный рН для дефосфорилирования 3/-концов равен 6,0. Фосфатазная активность не требует присутствия АТФ, более эффективна при взаимодействии фермента с дезоксирибонуклеотидами, чем с рибонуклеотидами. Максимальная фосфатазная активность проявляется при концентрации Mg2+ от 3 до 10 мМ. Ионы Mg2+ могут быть заменены ионами Co2+ без заметных изменений в скорости реакции. Но Mn2+, Zn2+ илиCa2+ не способны заменить Mg2+. Не смотря на то, что сравнительно низкая фосфатазная активность наблюдается уже при рН 8,0, перенос 3/-фосфатов с концов олигорибонуклеотидов зафиксирован даже при рН 10,0 [22].
Было установлено, что реакция фосфорилирования обратима. Это можно определить по появлению [γ-32P]АТФ из [5/-32P]-меченного олигонуклеотида в присутствии АДФ. Акцептором фосфата может быть не только АДФ, но и АТФ, в результате чего образуется [δ-32P]аденозинтетрафосфат [23]. Отимальный рН для этой реакции 6,0.
Сравнение свойств полинуклеотидкиназы фага Т4 и полинуклеотидкиназы из ядер печени крысы.
Полинуклеотидкиназа из ядер печени крысы значительно отличается по своим физико-химическим свойствам от соответствующего фермента фага Т4. Молекулярная масса фермента 80 кДа. Это односубъединичный белок. Оптимальный рН для функционирования 5,5, хотя заметная активность проявляется до рН 8,0. По результатам проведенных опытов можно сделать вывод, что фермент в основном локализован в ядрах клеток [24]. Киназа из ядер печени крысы неактивна на 5/-OH-концах молекул РНК или олигодезоксирибонуклеотидах короче 10-12 оснований. Для этого фермента можно более точно написать уравнение катализируемой реакции:
/-OH конец ДНК + АТФ ↔ 5/-фосфат конец ДНК + АДФ
Этот фермент способен фосфорилировать 5/-OH концы как одноцепочечных молекул ДНК, так и концы или ники в двухцепочечных молекулах [25]. Ионы Mg2+, Mn2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+ поддерживают высокую активность фермента , в то время как ионы Cu2+ являются ингибиторами. Обычным субстратом для измерения активности этой киназы является одноцепочечная ДНК длиной 100-200 п. о.[25].
Функция полинуклеотидкиназы в клетках млекопитающих остается неясной. Возможно, она играет особенную роль в репарации поврежденной ДНК в кооперации с полинуклеотид лигазой [24].
Использование полинуклеотидкиназы фага Т4
1) Киназная и фосфатазная активности фермента при желании могут быть использованы независимо. При инкубации в отсутствии АТФ 3/-фосфат можно убрать с ДНК или РНК без разрушения 5/-фосфата. Если олигонуклеотид с 3/-фосфатом инкубировать в присутствии фермента и АТФ при рН 9,0 (или выше) ограниченное время, то 5/-фосфат может быть введен не затрагивая основной массы 3/-фосфатов [22].
) 5/-концевой гидроксил полинуклеотида может быть мечен как с помощью прямой реакции, так и с помощью реакции обмена, которую фермент катализирует в присутствии [γ-32P]АТФ и АДФ [26]:
5/-ОН-конец + АТФ ↔ 5/-Фосфат-конец + АДФ
Таким образом можно использовать обратную реакцию для прямого мечения 5/-фосфорилированных концов двухцепочечных нуклеиновых кислот избегая предварительного дефосфорилирования [27].
Киназную реакцию можно ускорить (улучшить) добавлением ПЭГ, что может обеспечить более эффективную реакцию при очень низких концентрациях субстрата [26].
) Разработан быстрый и количественный метод измерения активности эндонуклеаз рестрикции второго класса. Он позволяет количественно определить число сайтов разрезания эндонуклеазой на молекуле ДНК. Число образуемых фрагментов в молях может быть определено по количеству включенной в нуклеотидную цепь радиоактивности, т. к. величина введенной метки 32Р пропорциональна числу образующихся концов ДНК и не зависит от количества нуклеотидов в ней [28, 29].