Холера
Владивостокский
Государственный Медицинский Университет
Кафедра
микробиологии, вирусологии и иммунологии
Р е ф е р а т
Холера
Выполнил:
Новак А.Л.
301 гр. л/ф
Владивосток,
1998.
Этиология
Возбудитель холеры относится к роду Vibrio.
Это изогнутая, грамотрицательная, не образующая споры палочка, имеющая один
полярно расположенный жгутик. По чувствительности к специфическому фагу (IV тип
по Мукерджи) различают два биотипа холерного вибриона — классический
(возбудитель азиатской холеры) и Эль-Тор. Каждый из них по 0-антигену
подразделяется на 3 серологических типа: Огава (АВ), Инаба (АС) и редко
встречающийся Гикошима (АВС), который некоторые авторы рассматривают как
вариант серотипа Огава. Н-антиген холерных вибрионов — общий для всех
серотипов.
Холерные вибрионы образуют
термолабильный экзотоксин — холероген (относительная молекулярная масса — 82—84
кд). Он состоит из комплекса тяжелой субъединицы А, активирующей
аденилатциклазу, и субъединицы В, представленной 4—6 легкими цепями и
обеспечивающей связывание холеро-гена с рецепторами эпителиальных клеток тонкой
кишки.
Биолого-патогенетические
свойства возбудителя
Миновав желудочный барьер, вибрионы попадают в тонкую кишку с благоприятной
для них средой и заселяют (колонизируют) поверхность кишечного эпителия.
Процесс колонизации включает в себя хемотаксис вибрионов к слою слизи,
покрывающему верхушки ворсинок тонкой кишки, проникновение через эту слизь,
адгезию к рецепторам на исчерченной каемке кишечных эпителиоцитов и
размножение на поверхности эпителия ворсинок и крипт. У больных холерой
возбудитель может быть обнаружен на всем протяжении желудочно-кишечного
тракта. В желудке при рН не менее 5,5 вибрионы не обнаруживаются, в стуле их
концентрация достигает 106—107 (иногда ^—Ю9).
Размножившись до определенной концентрации, возбудитель
вызывает заболевание посредством вырабатываемого им холерогена. Основную роль в
развитии болезни играют вибрионы, которые находятся в тесной связи со слизистой
оболочкой тонкой кишки, так как они выделяют холероген в непосредственной
близости от его рецепторов на эпителиальных клетках — ган-глиозида GM1. После прикрепления холерного токсина
к ганглиозиду субъединица А проходит через мембраны внутрь эпителиальной
клетки, где происходит высвобождение фрагмента А1. Последний энзиматически
расщепляет НАД и передает его АДФ-рибозную половину на регуляторный протеин
аденилатциклазного комплекса, находящегося на внутренней стороне мембраны
эпителиоцита. В результате происходит активация аденилатциклазы, приводящая к
повышению содержания цАМФ — одного из внутриклеточных стимуляторов кишечной
секреции. Связывание холерного токсина с рецепторами на эпителиальных клетках
происходит чрезвычайно быстро (через 1—3 мин); биохимические нзменения в
клетке являются необратимыми.
Возникающее заболевание сопровождается потерей огромных
количеств жидкости с низким содержанием белка и высокой концентрацией ионов натрия,
калия, хлоридов, гидрокарбонатов. Эта жидкость по составу отличается как от
экссудата, так и от транссудата и ближе к составу кишечного секрета.
Восприимчивость
К холерному вибриону восприимчивы люди всех возрастов. Чаще и
тяжелее болеют холерой лица, злоупотребляющие алкоголем или перенесшие резекцию
желудка. Кислотность желудочного сока играет важную роль в определении
минимальной инфицирующей дозы — в опытах на добровольцах при нейтрализации
желудочного сока гидрокарбонатом натрия количество вибрионов, необходимых для
воспроизведения специфического процесса у человека, уменьшается с 10" до
104—10Ь микробных клеток.
Клинические особенности
Инкубационный период при холере длится от 1 до 5 дней.
Клинические проявления холеры весьма варьируют, и тяжесть клинического течения
определяется степенью обезвоживания. Заболевание начинается обычно внезапно.
Первым клинически выраженным признаком холеры является понос. Типичные холерные
испражнения представляют собой водянистую, мутновато-беловатую жидкость с
плавающими хлопьями, напоминают по внешнему виду рисовый отвар и не имеют
запаха. Мышечная слабость и судороги в икроножных мышцах — ранние симптомы
холеры. Вслед за жидким стулом появляется обильная повторная рвота, быстро приводящая
к декомпенсированному эксикозу. Кожные покровы становятся цианотичными,
холодными на ощупь, черты лица заостряются, глаза и щеки западают. Кожа кистей
рук морщинистая («руки прачки»), голос сиплый, вплоть до афонии. У больных с
тяжелой формой холеры отмечается гипо-термия. Из-за ее постоянства терминальная
форма холеры (IV степень дегидратации) получила название «алгидная». Алгид
(декомпенсированное обезвоживание) сопровождается нарушением деятельности
основных систем организма — сердечно-сосудистой, дыхательной,
мочевыделительной.
Иммунологическая диагностика
Обнаружение антигена. Возбудитель холеры и его специфические
антигены (корпускулярный, растворимый, холероген) выявляют в фекалиях, рвотных
массах, крови, дуоденальном и кишечном содержимом, желчном пузыре, в объектах
окружающей среды (смывы с различных предметов), в воде открытых водоемов, сточных
водах, гидробионтах и др.
Некоторыми авторами при индикации специфических антигенов
холерного вибриона отдается предпочтение РТНГА. Холерные диагностикумы для
этой реакции готовят из бараньих или человеческих О (I) группы эритроцитов,
сенсибилизированных холерными 0-антигенами. Чувствительность метода — 104—106
бактерий в 1 мл при исследовании нативных испражнений и 10'—105 —
после предварительного подращивания. Минимальное количество 0-антигена,
выявляемого с помощью РТНГА, равно 0,04—0,16мкг/мл. РТНГА дает положительные
результаты у 91% больных холерой, у 40% ре-конвалесцентов и 12%
контактировавших с больными, 0-антиген холерного вибриона может быть определен
через 1 мес от начала заболевания в фекалиях у всех переболевших людей, а
спустя 5—6 мес — у половины обследованных, что, по-видимому, свидетельствует о
более длительной экскреции специфического антигена в нежизнеспособной форме.
Совпадение результатов бактериологического метода и РТНГА, по различным
данным, наблюдается в 63—100% случаев. Имеющиеся материалы дают основание
считать целесообразным широкое испытание РТНГА.
Положительную оценку при диагностике холеры получил МФА, позволяющий
выявлять холерные вибрионы при содержании их не менее 10° в 1 мл. Использовать
МФА целесообразно при исследовании нативного материала от больных и трупов. У
больных холерой положительные результаты с помощью МФА были получены в течение
2 ч в 70—90% наблюдений при полном совпадении с результатами
бактериологического анализа. Применение МФА при исследовании воды и смывов
возможно лишь после предварительного подращивания или концентрирования
материала. Представляется перспективным использование иммунотушевой окраски
холерных вибрионов.
Для выявления антигенов холерного вибриона применяют агрегат
гемаг-глютинационную пробу (АГГ). В основе её лежит использование для агрегации
и фиксирования белков иммунной сыворотки на эритроцитах химического вещества
из группы диазосоединений в виде препарата диазоль черного С. Эритроциты,
сенсибилизированные агрегированными белками холерной 0-сыворотки, обладают
высокой специфичностью и чувствительностью. С их помощью удается определить
0,01—0,005 мкг/мл «цельного» растворенного антигена, приготовленного по методу
Буавена, и 4000—480 000 клеток холерного вибриона в микробных взвесях. Это
позволяет считать АГГ одним из наиболее чувствительных иммунологических
методов, который оправдал себя при обследовании людей. С помощью АГГ 0-антиген
холерного вибриона обнаружен в 88,2% больных холерой и 78,3% вибриононосителей,
причем в титрах 1 : 40 и выше 0-антиген определен у 76,1% больных и у 57,1%
вибриононосителей. Серологически активный компонент эндотоксина обнаруживают в
высоких титрах, чаще у тяжелых больных и в первые 3—5 дней болезни. В период
реконвалесценции количество антигена в сыворотке крови снижается, но у 33%
больных он сохраняется до 20—25 дней [Покровский В. И., Малеев В. В., 1978].
Для определения холерогена, помимо биопроб, используют и иммунологические
методы — РНГА и АГГ. В опытах с бесклеточными супернатантами культур холерных
вибрионов порог чувствительности обоих методов составлял 0,01—0,005 мкг/мл.
Антительный ответ. Инфицирование человека холерным вибрионом
ведет к местному и системному ответу. Клинически выраженное заболевание
холерой сопровождается ростом уровня сывороточных антимикробных
(агглютинирующих и вибриоцидных) и токсиннейтрализующих антител, как правило,
уже к концу 1-й недели после появления симптомов болезни. Агглютинины к
холерному вибриону к 4-му дню заболевания выявляют у 35,7% больных, на 8-й
день — практически у всех (98,6%). Уровень агглютининов достигает максимума на
2-й неделе заболевания (на 11—15-й день титры, равные 320 и выше, регистрируют
у 71% больных), а затем резко падает. Титры вибриоцидных антител также
увеличиваются к 8—10-му дню заболевания и после 3 нед (иногда несколько раньше)
начинают снижаться, достигая первоначального уровня через 2—7 мес. У детей до 4
лет падение титра вибриоцидных антител происходит быстрее, чем в старшей
возрастной группе (5—14 лет), достигая исходного уровня уже через 3 мес.
Динамика титров токсиннейтрализующих антител имеет сходный характер — появляясь
в конце 1-й недели, они достигают максимума между 2-й и 3-й неделями, а с
21-го дня снижаются.
Содержание сывороточных IgM и I gG на протяжении болезни сопоставимо
с аналогичными показателями в контрольной группе, хотя есть данные об
увеличении уровня IgM в острой стадии и снижении его в период реконвалесценции.
Некоторые исследователи не установили разницы в содержании IgA при поступлении больных в стационар и
в стадии реконвалесценции; другие отмечают повышение его уровня у переболевших
[Покровский В. И., Малеев В. В., 1978; Адамов А. К., 1981]. Сказанное не дает
достаточных оснований утверждать, что изменение уровня сывороточных
иммуно-глобулинов при холере носит специфический характер.
Специфическая активность иммуноглобулинов различных классов
зависит от формы и длительности инфекционного процесса при холере. Антитела в
сыворотке крови переболевших относятся, преимущественно к IgM. У вибриононосителей
продуцируются, наоборот, высокоактивные IgG-антитела. Активность IgA-антител в
сыворотке крови вибриононосителей незначительно выше по сравнению с больными.
Чем тяжелее протекает заболевание, тем выше активность продуцируемых антител,
относящихся к иммуноглобули-нам класса М, и ниже активность IgG-антител.
Самым простым и легко воспроизводимым методом определения антимикробных
антител является РА с живыми культурами холерного вибриона, но чувствительность
этой реакции ограничена. Диагностические титры (1 :
: 40 и выше) появляются, как правило,
к концу 1-й недели заболевания, но лишь у 19,7% больных холерой. Исследование
парных сывороток, полученных с интервалом 7—10 дней при наличии 4-кратного и
более нарастания титров антител увеличивает частоту положительных результатов
до 89,6%
Гораздо большее значение придается в
настоящее время выявлению виб-риоцидных антител. Вибриоцидный тест (ВТ)
является более чувствительным в сравнении с РА, давая высокие титры, особенно
у реконвалесцентов холеры (до 1 : 100 000). Нужно, однако, иметь в виду, что
вибриоцидные антитела (титры до 1 : 1000) могут обнаруживаться и в сыворотках
невакцинированных здоровых людей, никогда не болевших холерой, и у лиц, инфицированных
бруцеллами, Yersinia
enterocolitica
09, цитробактером. Агглютинины относительно меньше чувствительны к такой
неспецифической стимуляции. Как и РА, ВТ позволяет регистрировать
подъем специфических антител (4-кратный и более) у 90—95% больных с
бактериологически подтвержденным диагнозом холеры [Watanabe Y., 1974].
В качестве антигена в РА и ВТ
используют холерные вибрионы обоих серотипов. При необходимости пользоваться
одним предпочтение отдают серотипу Огава, который чаще, чем Инаба, вступает в
перекрестные реакции с гетерологичным серотипом холерного вибриона и реже дает
неспецифические реакции с микробами других семейств.
Хотя эти серологические реакции
являются наиболее чувствительными, необходимость применения в них живых
вибрионов создает определенные трудности при массовых обследованиях. Поэтому
наибольшего внимания заслуживают антигенные эритроцитарные диагностикумы,
которые позволили внедрить в практику РНГА и РТНГА. Эти реакции обладают
достаточной чувствительностью и специфичностью, позволяя обнаруживать антитела
у больных и переболевших холерой в титрах 1 : 640—1 : 1280. Наблюдаемые
различия в титрах при параллельном использовании РНГА и ВТ обусловлены главным
образом различиями в физико-химической природе выявляемых антител:
IgG-антитела более эффективно обнаруживают бактерицидным методом (ВТ),
IgM-антитела — в РНГА.
Для выявления антитоксинов в
сыворотках применяют РН, результаты которой учитывают по отсутствию
холерогенного эффекта в перевязанной петле тонкой кишки взрослых кроликов, в
кишечнике крольчат-сосунков, на коже морских свинок (кроликов) в опытах in vivo и по отсутствию цитото-нического
действия в культуре клеток СНО и Y-1 — в опытах in
vitro. Наиболее
стандартизованы кожная проба и модель перевязанной кишечной петли. У 73%
больных в эндемичном по холере районе с помощью кожной пробы выявлено
диагностически значимое 9-кратное и большее увеличение титров токсиннейтрализующих
антител. Частота сероконверсии вибриоцидных антител и агглютининов в этой же
группе больных была выше и составила 98 и 88% соответственно [Watanabe Y., 1974].
Анализ титров антитоксических антител
при диареях нехолерной этиологии показал, что в пробах сывороток, взятых в
острой стадии болезни, они колебались от << 10 до 270, но значимое
нарастание титров в период рекон-валесценции было отмечено лишь у 2,5% больных.
Обладая высокой специфичностью, метод определения токсиннейтрализующих антител
несколько уступает по чувствительности методам определения вибриоцидных и агглютинирующих
антител. Высокой разрешающей способностью обладают ИФМ и РИМ, использующие
меченный энзимом или радиоактивным веществом антиген и позволяющие определять
связывание 0,001—1 нг иммунного белка исследуемой сыворотки.
Титры антитоксических антител, регистрируемые ИФМ, выше
титров, которые определяются с помощью внутрикожного теста, что обусловлено
различиями в выявляемых классах иммуноглобулинов: кожный тест документирует
нейтрализующую активность только IgG-антител, вероятно, в силу их большей
авидности, в то время как ИФМ регистрирует и уровень IgM-антител.
Таким образом, изучение титров и динамики нарастания
циркулирующих антител в сыворотках крови больных при холере расширяет возможности
ее лабораторной диагностики. Ретроспективный диагноз холеры с большей степенью
вероятности может быть установлен в РА и ВТ, но лишь на основании изучения
парных сывороток больных. Определение уровня антитоксина полезно в тех случаях,
когда необходимо исключить предшествующую специфическую вакцинацию, так как
антитела этого типа не индуцируются существующими холерными вакцинами и очень
редко встречаются у здоровых людей. Однако подъем антитоксических титров у
больных на фоне диагностически значимой сероконверсии вибриоцидных и
агглютинирующих антител повышает достоверность серологической диагностики
холеры.
Возникновение патологического процесса, вызванного холерными
вибрионами, ведет к появлению антител к этим микроорганизмам и во внешних
секретах пищеварительного тракта — интестинальной жидкости (ко-проантитела) и
слюне. Отличительной чертой динамики копроантител является их раннее появление
(у 72% — на 2—3-й день болезни, у 100% — на 4-й день) и быстрое исчезновение из
кишечного содержимого. В интестинальной жидкости выздоравливающих от холеры
людей антитела против вибрионов относятся к иммуноглобулинам A, G и М, но преобладающими являются
SIgA-антитела, количество которых у больных холерой возрастает примерно в 30
раз, но составляет около '/4 того, что наблюдается у больных диарейными
заболеваниями нехолерной этиологии. Последнее связано с адсорбцией SIgA на холерных вибрионах, что приводит к
стойкому снижению количества вибрионов в стуле больных и сокращает продолжительность
их выделения из кишечника. Концентрация этого иммуноглобулина и время его
появления в кишечном содержимом не связаны с сывороточным IgA. Количество IgG- и IgM-антител в кишечном содержимом
реконвалесцентов холеры также увеличивается (в 5—7 раз), но в фекалиях антитела
класса IgM не обнаруживают.
Для обнаружения антител в интестинальной жидкости и фекалиях
больных могут быть использованы ВТ, РИМ с холерными антигенами, меченными
радиоактивным йодом, непрямой флюоресцентно-серологический метод. Нарастание
специфических антител указывает на наличие заболевания холерой. Однако
кишечно-копрологическая диагностика холеры еще недостаточно разработана.
В слюне больных и вибриононосителей повышен уровень IgA и IgG.
Одновременно появляются и специфические антитела (агглютинины), содержание
которых у больных холерой выше, чем у виброноносителей (30 АЕ и 14 АЕ
соответственно). Диагностический титр специфических агглютининов слюны может
оказаться значительно ниже сывороточного.
Определению состояния повышенной чувствительности при холере в
реакции ГЗТ посвящены единичные работы. Описаны положительные аллергические
реакции у 89% переболевших холерой и вибриононосителей (при отсутствии их в
контрольной группе) в ответ на внутрикожное введение аллергена из убитых
холерных вибрионов. Однако имеющихся данных недостаточно, чтобы высказать
суждение об аллергической перестройке организма при холере или о
диагностической значимости применяемых тестов.
Иммунитет
заболеваний холерой крайне редки.
Опыты на добровольцах показали, что в течение 3 лет (срок наблюдения) люди,
переболевшие холерой в результате экспериментального заражения, оставались
устойчивыми к повторному заражению холерными вибрионами [Levine M. et al., 1981].
Основная роль в иммунитете к холере
принадлежит антителам, продуцируемым местно (в кишке), хотя определенный вклад
в защиту вносят циркулирующие антитела при высоких их концентрациях, когда они
проникают в просвет кишки из крови, что подтверждено экспериментами на
животных. Более высокий уровень защиты наблюдается при синергическом действии
антибактериальных и антитоксических антител в кишке. Основная роль антибактериальных SIgA состоит в том, чтобы препятствовать
хемотаксису вибрионов к эпителию и прилипанию их к поверхности слизистой
оболочки кишечника в результате блокирующего действия на структуры для прилипания
(лиганды) на поверхности бактериальных клеток. Снижение колонизации и адгезии
холерных вибрионов способствует более быстрому их выведению из кишечника при
перистальтике и тем самым уменьшает возможность приживления возбудителя в
кишечном тракте.
Действие кишечных IgA-антител против
холерогена обусловлено главным образом блокадой его В-субъединицы, что
препятствует связыванию токсина с ганглиозидом GM1 на поверхности эпителиоцитов. Антитела, блокирующие
токсический сайт на А-субъединице холерогена, оказывают меньшее защитное
действие.
Список
использованной литературы
1.
Л.Б. Хазенсон, Н.А. Чайка: Иммунологические основы
диагностики и эпидемологического анализа кишечных инфекций. «Медицина»,1987.
2.
В.Д. Тимаков, В.С. Левашев, Л.Б.Борисов: Микробиология. «Медицина», 1983.
3.
Лекция по
теме.
4.
Методическая
разработка кафедры.